Le Biomolecole “utili” sono prodotte per:
1. Sintesi Chimica
2. Biosintesi (processi biotecnologici e reazioni enzimatiche
3. Sintesi mista (enzimatico-chimica)
4. Isolate da fonti naturali
Sintesi Chimica di molecole organiche
La sintesi chimica di una molecola organica avviene per una o più
reazioni tra varie molecole di reagenti e portano ad una variazione
della struttura molecolare.
Prima di iniziare una sintesi bisogna prendere in considerazione:
1. Una buona progettazione della sequenza di reazioni da fare (è
consigliabile una analisi retrosintetica)
2. Il numero delle reazioni da fare
3. La resa di ciascuna reazione e resa finale
4. Le condizioni di reazione
5. Le condizioni di purificazione (ogni fase o tutto alla fine)
6. Il costo di tutto.
Semplice analisi retrosintetica.
Per trasformazione di gruppi funzionali
Analisi retrosintetica con variazione nello scheletro carbonioso
1. Il numero delle reazioni da fare
2. La resa di ciascuna reazione e resa finale
E’ consigliabile adottare uno schema sintetico con un basso
numero di reazioni. A patto che ciò non comporti un
abbassamento della resa globale del prodotto finale
La resa di un singolo stadio si calcola come il % in
moli del reagente che si trasforma in prodotto
A
60%
B
Vuol dire che solo il 60 % delle
moli di A si trasformano in B
Sintesi multistadio e resa globale
A
50%
50%
B
C
50%
50%
D
E
Globale 6.2%
Il prodotto E sarà ottenuto on una resa globale
del (50 x 50 x 50 x 50) = 6.2 %
Questo tipo di sintesi viene detta lineare
Sintesi multistadio convergente
1.0 mol
A
50%
B
50%
E
1.0 mol
C
50%
D
0.12 mol
12.5%
La sintesi Chimica del Tassolo
una sintesi con molti stadi
J.Am.Chem.Soc. (1994) 116, 1597 and 1599
Sintesi in soluzione o sintesi in fase solida?
La sintesi in soluzione prevede che i reagenti siano tutti
solubilizzati in un opportuno solvente.
I vantaggi:
1. Reazioni veloci (dovuto alla elevata mobilità delle molecole)
2. Reazioni stechiometriche
Svantaggi:
1. Il reagente in eccesso (se c’è rimane nella miscela di
reazione)
2. I sottoprodotti restano nella miscela di reazione insieme al
prodotto desiderato.
3. E’ necessaria una purificazione dopo ogni passaggio sintetico.
Sintesi in fase solida (schema generale)
La sintesi in fase solida prevede che un reagente sia legato ad un
supporto solido (non solubile)
I vantaggi:
1. I sottoprodotti sono allontanati per semplice lavaggio e
filtrazione del supporto solido che ha legato solo il prodotto di
reazione desiderato.
2. I reagenti in eccesso sono analogamente allontanati per
lavaggio e filtrazione.
3. Unica purificazione finale
Svantaggi:
1. Per ottenere rese alte è necessario usare forti eccessi del
reagente in soluzione
2. La scala di reazione spesso non è elevabile a piacere
Oggì è richiesta una sintesi chimica più veloce ed efficiente!
Con l'avvento di nuovi è più veloci metodi di screening di
attività che permettono la valutazione di decine e centinaia di
prodotti in un solo giorno, lo stadio lento del processo di
produzione di un farmaco è diventato la individuazione e la sintesi
chimica dei prodotti da provare i quali, a loro volta, debbono
essere il più possibile diversi tra loro, per poter facilitare la
individuazione di nuove strutture attive.
La sintesi chimica deve tenere il passo con le nuove potenzialità di
screening biologico.
Questo problema è stato risolto con la sintesi combinatoriale.
Sintetizzare un solo composto ? (strada lenta)
o più composti simultaneamente (strada veloce) ed ottenere una
miscela?
Se il prodotto ricercato è stato progettato razionalmente allora
bisogna sintetizzarlo con una struttura ben definita
Se non si ha una idea esatta della struttura del composto, pensato
essere farmacologicamente attivo, ma si ipotizza una struttura
generica di una certa tipologia, allora può venire utile la Sintesi
Combinatoriale
La sintesi Combinatoriale
Questa tecnica sintetica produce un elevato numero di
molecole che differiscono strutturalmente per piccole
porzioni della molecola. Consente di sintetizzare un elevato
numero di molecole da saggiare
Così si ottengono vaste collezioni di prodotti (libraries,
librerie) contenenti un alto numero di varianti di una
struttura fondamentale;
A: sintesi organica classica. B:sintesi combinatoriale.
Esempio
Numero di prodotti ottenibili in funzione della lunghezza del
peptide utilizzando i 20 amminoacidi naturali.
La sintesi combinatoriale è applicabile anche a molecole
piccole variando una parte della struttura
Quanti possibili cicli imidazolici
trisostituiti si ottengono?
Derivati = 63 = 216
Tali librerie possono essere costituite da prodotti in soluzione o
da prodotti ancorati ad una particella solida (bead, perlina).
Sintesi in soluzione o Sintesi in fase solida
Il metodo si presta molto bene ad essere automatizzato e sono
già commercializzati dei sistemi robotizzati che sono in grado
di produrre da 1000 a 2000 prodotti al giorno.
Come identificare il prodotto più attivo?
A prima vista può sfuggire l'utilità di questa tecnica. Vi è
chiaramente un risparmio di lavoro: se avevamo a disposizione 6
reagenti per posizione, abbiamo ottenuto 216 prodotti... peccato che
siano tutti assieme!
In realtà esistono tecniche di marcatura o deconvoluzione che
permettono di risolvere elegantemente il problema dell'identificazione
di un eventuale composto attivo tra i 1000 sintetizzati
Le procedure di deconvoluzione permettono di identificare i
composti di interesse attraverso un processo interattivo di
screening e sintesi.
Libreria su sferette (di vetro) identificazione mediante saggio con
recettore fluorescente
“On-Bead Assay for Receptor Binding using a Fluorescently
Labeled Receptor”
1) Add labeled receptor labelled
with fluorescent tag
2) allow to bind to ligands
on the beads
3) wash to remove unbound
receptor
Beads
Libreria di molti prodotti. Su
ogni sferetta c’è legata una sola
tipologia di molecola.
Solo le sferette che hanno
legato la molecola attiva
che riconosce il recettore
divengono fluorescenti
Un possibile metodo di selezione per affinità con il recettore
Micro sferetta colorabile
A: il recettore è mescolato con le perline della libreria. B: il
recettore si lega alla perlina che contiene il prodotto affine. C: si
aggiunge il substrato dell'enzima; la perlina, alla quale è legato
il recettore modificato, si colora (porpora) e può essere
individuata ed isolata.
Vediamo un esempio concreto di sintesi in fase solida di
una libreria di 27 prodotti e come si individua il prodotto
più biologicamente attivo
Il metodi di sintesi è definito:
Sintesi parcellizata (Split Sinthesis)
In genere la sintesi in fase solida viene effettuata su un supporto
solido facilmente parcellizzabile o rimescolabile.
Sono preferite sferette di vetro o altro materiale, comunque di
forma definita e dimesioni non troppo piccole in quanto devono, in
alcuni casi, poi poter essere anche individuate singolarmente
Split synthesis (mixture libraries)
A D
A
D
B
B D
C
C D
A
A
A
B
B
combine,
mix,split
E
A E
combine,
mix,split
B
B E
C
C E
C
C
A F
A
F
B
B
F
C
C F
Split synthesis (continuazione)
A D
A E
A F
A D G
A E G
A F G
F
B D G
B E G
B
F
G
G
B D
B
C D
C E
C F
C D G
C E G
C F
G
A D
A E
A F
A D H
A E H
A F
H
E
B
H
B D
B E
B
F
B D H
B E H
B
F
H
C D
C E
C F
C D H
C E H
C F
H
A D
A E
A F
A D
I
A E
I
A F
I
B D
I
B
E
I
B
F
I
C D
I
C E
I
C F
I
I
B D
C D
B E
C E
B
F
C F
Perchè non è conveniente fare così?
A
A D
A E
A F
G,H, I
D,E,F
A,B,C
B
B D
B
E
C
C D
C E
B
F
C F
Perchè la reattività dei prodotti può non essere la stessa e ciò
porta ad una libreria in cui I prodotti non sono egualmente
rappresentati.
Nella Split synthesis tutti i composti sono in eguali quantità
pechè ogni accoppiamento è individualmente controllato
(ovvero con un solo reagente)
etc
Deconvolution della libreria attraverso attività biologica
e sintesi di sub-librerie (Selezione del composto attivo)
A D G
A E G
A F G
B D G
B E G
B
C D G
C E G
C F
G
A D H
A E H
A F
H
B D H
B E H
B
F
H
C D H
C E H
C F
H
G
F G
Biological activity of the library
H
G
H
I
select library H
A D
I
A E
I
A F
I
B D
I
B E
I
B
F
I
C D
I
C E
I
C F
I
I
Si staccano i prodotti dal supporto e si
ottengono
tre
librerie
ognuna
contenente nove prodotti di tipo X-Y-Z.
La Libreria che termina con il residuo H
risulta la più attiva.
A D
A D H
Biological activity of the library
A
B D
H
C D
D
H
D
H
B D H
C D H
B
D
D-H
H
B E H
C E
C E H
A F
A F
B
F
C F
E-H
B D H
C D H
F-H
Lead Cmpd
B E
H
H
C
A E H
A E
A D H
B
H
F
H
C F
H
select library D-H
Biological ‘c’è
activity
of the library
Tra i nove prodotti selezionati
il prodotto
attivo. Per individuarlo bisogna suddividere il
gruppo in tre sottogruppi che si possono
sintetizzare a partire dai dimeri separati.
I tre sottogruppi, staccati dal supporto sono
poi saggiati per l’attività biologica.
Il
Diagramma indica che il prodotto che termina
per D-H è quello più attivo.
A-D-H
B-D-H
C-D-H
Ciò restringe il campo a soli tre possibili
select library C-D-H
prodotti: A-D-H, B-D-H, C-D-H
D
D-H
B E H
E
ary
A
A F
B
F
C D H
E-H
F-H
Lead Cmpd
H
C E
H
C
A E H
E
B
H
C F
H
D
C E H
A DF
H
B
F
H
C F
H
D
C
select library D-H
H
H
A D H
Biological activity of the library
B D H
C D H
A-D-H
Lead Cmpd
B-D-H
C-D-H
select library C-D-H
Si sintetizzano
tre prodotti, si staccano dai supporti e si saggiano.
Biological singolarmente
activity of thei library
Risultato: il prodotto C-D-H è il più attivo!
Problemi:
• La deconvoluzione può essere un lavoro lungo
•Il lavoro può essere falsato dalla bassa concentrazione
del prodotto attivo
• L’attività, a volte, può dipendere dalla combinazione di
più prodotti. Ciò impedisce l’idenficazione del singolo
composto attivo
Vantaggio:
• Può essere sinntetizzato un elevato numero di composti
in un tempo breve (dipende dalla sintesi)
Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile”
Questa tipologia di sintesi si basa su molecole legate ad un supporto in genere
una superficie su cui si fa passare il reagente solo in determinate zone (come in
caselle di una scacchiera). Ogni zona (casella) avrà un determinato prodotto.
E
D
F
A
A
D
A
E
B
B
D
B
E
C
C
D
C
E
A
F
B
F
C
F
Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile”
H
G
A
A
D
I
G
A
E
H
E
H
E
H
B
B
D
G
B
C
C
D
G
C
A
F
I
B
F
I
C
F
I
Il recettore (“labelled”) si fa passare su tutta la superficie della
individuando la zona e quindi la molecola che lo lega specificamente
scacchiera
Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile”
Invece di supporti stratificati in un foglio oggi si preferisce usare
apparati automatici che consentono più sintesi contemporanee in fase
solida.
Ogni supporto è collocato in un reattore separato su cui vengono fatti
passare i diversi reagenti.
Il risultato è lo stesso (ma con maggiori quantità ottenibili) di una sintesi
spazialmente indirizzable su diverse zone di superficie
Apparato automatico per sintesi di libreria
(simultanea su più reattori diversi)
Acc. Chem. Res. 1996, 29, 114-122
Un blocco precostituito di 100 mini reattori per libreria di 100 composti
Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile”
Vantaggi:
Si sintetizzano composti puri (non in miscela) quindi
non c’è bisogno di deconvoluzione
Svantaggi:
Le librerie tendono ad essere piuttosto piccole
Esempio di sintesi divergente