Microscopia
L'esame microscopico dei microrganismi si basa sull'uso del:
Microscopio ottico
Microscopio elettronico
Microscopio ottico: si usa prevalentemente nelle applicazioni di routine
Si utilizzano comunemente vari tipi di microscopi ottici:
in campo chiaro, in campo scuro, a contrasto di fase e a fluorescenza.
Microscopio in campo chiaro
Ingrandimento: prodotto degli ingrandimenti rispettivamente degli
obiettivi e degli oculari
Valore massimo di ingrandimento: 1500 volte.
Risoluzione: capacità di distinguere due punti adiacenti come distinti e
separati.
E' di 0,2 μm con illuminazione a luce bianca
Obiettivi a secco
Obiettivi ad immersione (per maggiori ingrandimenti)
Olio (di legno di cedro- di vaselina): ha lo stesso indice di rifrazione
del vetro.
Microscopio a contrasto di fase
Particolarmente utile per lo studio delle cellule viventi
Principio:quando i raggi luminosi attraversano un corpo trasparente
alcuni di essi vengono ritardati causa della differente densità delle diverse
zone dello stesso: il ritardo corrisponde a circa ¼ della lunghezza d'onda
(tali raggi si trovano fuori fase rispetto agli altri raggi luminosi)
Tali differenze di fase sono trasformate in differenze di intensità luminosa
Spirillum volutans
Clostridium botulinum
Paramecium
Microscopio in campo oscuro
Il campione appare luminoso mentre il campo appare oscuro
Treponema pallidum
Volvox e Spirogyra
Microscopio a fluorescenza
Prevede l'impiego di sostanze fluorescenti che assorbono le onde
ultraviolette e le rimettono sotto forma di onde luminose visibili di
lunghezza d'onda maggiore
I microrganismi trattati con un colorante fluorescente appaiono come
corpi colorati e brillanti su di un fondo oscuro
Preparati per l'osservazione al microscopio ottico in campo chiaro
1-Osservazione a fresco.
Osservazione del microrganismo vitale
Si sospende il campione in una goccia di acqua e si osserva fra due
vetrini
L'osservazione a fresco è preferibile quando:
- si osservano i batteri a spirale
- si osservano i microrganismi mobili (a goccia pendente su cellula di
Koch)
Metodo valido per l'osservazione dei microrganismi di maggiori
dimensioni come funghi e protozoi
2- Osservazione mediante colorazione
Le cellule sono meglio visibili
Si può studiare la diversa affinità dei batteri ai vari coloranti
Colorante:sale che per idrolisi si scinde in anioni e cationi
A- Colorante basico: lo ione colorante porta la carica positiva
B- Colorante acido: lo ione colorante porta la carica negativa
C- Colorante neutro: sale complesso di un acido colorante con una base
colorante
Coloranti derivati dall'anilina:
A- basici: blu di metilene, violetto di genziana, cristalvioletto,
fucsina basica
B- acidi: eosina, rosso congo, fucsina acida
C- neutri: eosinato blu di metilene
La cellula batterica ha affinità per i coloranti basici che si legano ai
gruppi fosforici degli acidi nucleici con carica negativa.
Mordenzanti: favoriscono l'attecchimento del colore all'interno della
cellula
es. acido fenico, soluzione iodo-iodurata (Liquido di Lugol)
Differenziatori: sono sostanze decoloranti
es. alcool etilico assoluto
Allestimento del vetrino
Distensione: del materiale sul vetrino
Essiccamento: a temperatura ambiente
Fissazione:
- rende il materiale aderente al vetrino
- rende inalterabili la forma della cellula e degli elementi morfologici
- rende la cellula più permeabile ai coloranti
Fissazione al calore (120°- 130°C)
Fissazione con agenti chimici (es. formaldeide, alcool etilico, ecc.)
Colorazione
Asciugamento
Osservazione microscopica
Colorazione semplice
Flambaggio
Cristalvioletto
Distensione
Lavaggio
Essiccamento
Asciugamento
Fissazione
Osservazione
Colorazione differenziale
A- Colorazione di Gram
Mordenzante
Decolorante
B- colorazione di Ziehl-Neelsen
Serve per evidenziare i Micobatteri i quali sono difficilmente colorabili con gli
altri metodi di colorazione a causa delle particolari caratteristiche della parete
cellulare ( alto contenuto in lipidi)
I Micobatteri sono acidoresistenti