Università degli Studi di Bari
Potenziale biotecnologico delle saline di Margherita di Savoia.
Prof.ssa Angela Corcelli
Dipartimento di Biochimica medica, Biologia medica e Fisica medica
Le saline di Margherita di Savoia si
estendono parallelamente alla costa
adriatica per una lunghezza di circa
20 km, occupando una superficie di
oltre 4000 ha e penetrando
nell'entroterra per una lunghezza
variabile dai 2 ai 5 km.
La laguna olocenica del Tavoliere
1760 circa
Risalenti al III secolo a.C., e di
enorme rilevanza per l'economia
locale, costituiscono la piu' vasta
area d'Europa per la produzione di
cloruro di sodio, vantando una
quantita' annua pari a circa 5/6
milioni di quintali.
Great Salt Lake, Utah
Margherita di Savoia
Nelle vasche delle saline vive l’artemia salina
su alcuni isolotti delle saline si e' stabilita
una colonia di fenicotteri rosa
alofite
alofite
Salicornia europea
(dall'arabo sala alquarah, pianta
annuale)
alofite
Arthrocnenum fruticosum
Suaeda fruticosa
erba Kali
Progetto 2001
1977
costituzione della riserva naturale di popolamento animale
“La salina di Margherita di Savoia”
1979
dichiarazione di valore internazionale
zona Ramsar
Convenzione di Ramsar (Iran), 1971
Convenzione sulle zone umide di importanza internazionale,
soprattutto come habitat di uccelli acquatici
conservazione ed uso saggio (wise use) delle zone umide
attraverso l’azione nazionale e la cooperazione
internazionale, come mezzi per raggiungere lo sviluppo
sostenibile in ogni parte del mondo
suddivisione
delle vasche di una salina
area evaporante
3343 ha
area salante
500 ha
salinità crescente
fino a 25.7°Bè
da 25.7 a 30°Bè
Bè° ?
La scala Baumè
è una scala non metrica
usata per misurare il peso specifico
Gradi Baumè
3.5
acqua di mare
25.7
saturazione
Salinità (g/kg)
37.2
279.3
30.0
vasche di
cristallizzazione
329.2
L'acqua marina, convogliata da un'idrovora alla foce
Aloisa, passa in una serie di vasche per cambiare
grado di salinita': la pendenza del terreno, collettori e
altre idrovore sospingono l'acqua sempre piu' satura,
grazie all'azione del sole, fino alle vasche terminali,
prossime al centro abitato di Margherita di Savoia.
da 30 milioni di metri cubi di acqua di mare
si ottengono 500 milioni di chilogrammi di sale
3.5 Bè
Stage 1
25 - 35 Bè
Stage 2
3.5 Bè
25 - 35 Bè
25 Bè
Stage 3
3.5 Bè
25 Bè
25 - 35 Bè
15 °Bè: precipita il solfato di calcio (gesso)
25.5 °Bè: precipita il cloruro di sodio
oltre i 30 °Bè: precipita il solfato di magnesio
Micro-algae
Bacteria
Biomass
Protozoa
Fish
Mangroves
Seagrasses
Seaweeds
Brine fly larvae
Brine shrimp
35
105
155
205
Salinity
Red halophilic bacteria
255
285
Una pozza di cristallizzazione del sale ricca di
microrganismi alofili
Cristalli di NaCl
con inclusioni di alobatteri
altri habitat degli Archaea
Termofili
altri habitat degli Archaea
Termoacidofili
campionamento
Cosa si scopre esaminando
una goccia di acqua rossa al microscopio?
Una goccia di liquido delle saline
al microscopio
400x
la Dunaliella ricca di carotenoidi
un’altra alga alofila
1000 x
bastoncelli
1000 x
I bastoncelli sono dotati di flagelli
Fotografia al
microscopio a
contrasto di fase
delle cellule quadrate
(Walsby, 1980).
cellule
quadrate
1000 x
Halobacterium salinarum
Micrografia a
scansione
elettronica
(150,000X)
ioni all’interno e all’esterno
4M NaCl
4M KCl
membrane viola isolate e liofilizzate
cristalli di batteriorodopsina
spettri di assorbimento della clorofilla e della batteriorodopsina
0
.
3
0
0
.
2
5
0
.
2
0
0
.
1
5
0
.
1
0
0
.
0
5
0
.
0
0
Lunghezza d’onda
4
0
0 4
5
0 5
0
0 5
5
0 6
0
0 6
5
0 7
0
0
La prima struttura tridimensionale
della BR è stata ottenuta già nel 1975
Nature, Unwin & Henderson
Retinale all-trans
Trasformazione dell’energia luminosa in energia chimica
catalizzata dalla batteriorodopsina
Tre proteine a retinale
in Halobacterium salinarum
RODOPSINA SENSORIA
Fotomovimento
ALORODOPSINA
Pompa di ioni cloruro
per lavoro osmotico
BATTERIORODOPSINA
Pompa protonica per
la sintesi di ATP
La batteriorodopsina degli alobatteri
è un fotorecettore
utile per la sintesi di ATP
La rodopsina della retina degli animali
cattura la luce e inizia la cascata di
eventi che porta alla visione
Batteriorodopsina, fotociclo e biochip
A New Kind of Computer Bug
Scientists at Syracuse University are using a protein
bacteriorhodospin – found in bacteria found in salt
marshes -- to write and store data. Jeff Stuart, senior
research scientist, said that two laser beams are used to
access and/or write information on the protein. These
beams cause structural changes in the protein similar to
how an optical plate is altered. Bacteriorhodospin protein
has the ability to store information three dimensionally for
up to five years. "Currently, we are working on a storage
system that can store up to 10GB of information," said
Stuart. Additional information is available by calling
315/443-5908.
I lipidi degli alobatteri sono diversi da quelli degli eucarioti
PM polar lipids
H C
2
HC
CH
GlyC
O
O
2
O
O
P
OH
OH
O
HO S
3
HO
O
CH
CH OH
2
OO
O
OH
HO
OH
OH
2
O
HO 3S
OH
HO
O
O
OH
O
CH
HC
H C
2
H2 C
HC
HO
O
CH 2
CH 2OH
OO
HO
S-TGD-1
O
OH
O
O
CH 2
HC
O
H 2C
O
O
H2C
HC
O
O
O
O
CH2
O
O
O
P
HO
OH
2
O
CH2
O
OH
P
OH
OH
O
O
CH2
HC
OH
PGP-Me
BPG
CH2
HC
OH
CH2
O
CH2
O
O
O
P
OH
O
O
CH2
CH3
H2C O
HC
O
H2 C
O
H2C O
HC O
HC O
CH2
CH2
O
O P
P
OH
O
OH
O
O
PGS
CH2
P
OH
PG
O
CH2
HC OH
HC OH
CH2
CH2
O
O
S
HO
O
OH
PM neutral lipids
O
CH3
H
O
squalene
H
7-8
vitamin MK8
La composizione lipidica
come elemento tassonomico
Metodi
Campionamento delle acque madri
Raccolta delle cellule
Isolamento delle membrane
per dialisi
Estrazione di lipidi
Spettrometria di massa (ESI-MS)
Confronto con i profili lipidici di ceppi da collezione
ESTRAZIONE DI LIPIDI (Bligh & Dyer)
CELLULE (in NaCl 4M) o PM (in H2O)
+
metanolo/cloroformio
sistema monofasico (H2O:MeOH:CHCl3 0.8:2:1)
+
cloroformio/acqua
sistema bifasico (H2O:MeOH:CHCl3 0.9:1:1)
lipidi
in cloroformio
analisi mediante TLC
TLC degli estratti lipidici della biomassa
di Margherita di Savoia (M) ed Eilat (E)
E
M
Solvente: cloroformio/acido acetico 90%/metanolo (65/35/4)
Rivelazione con ac. Solforico 0.5% in acqua
Spettrometria di massa
la ionizzazione elettrospray
prevede l’applicazione di una tensione ionizzante -dell’ordine dei kilovoltslungo l’ago nebulizzatore eventualmente collegato
all’uscita di un cromatografo HPLC
Spettro ESI-MS (-) dell’estratto lipidico delle cellule
della biomassa di Margherita di Savoia
(Lattanzio et al, Extremophiles, 2002)
805.6
intensity
Haloferax,
Halorubrum
1055.9
x 3.0
Salinibacter
899.7
660.4
760.2 885.6
966.1
600
800
Halobacterium
1218.2
Haloarcula
1000
m/z (amu)
1200
1400
Ioni molecolari e picchi bicarichi dei lipidi polari
presenti nei microrganismi alofili archeali
Lipide
M/z, amu
Bisfosfatidilglicerolo (BPG)
760
Fosfatidilglicerolo (PG)
806
Fosfatidilglicerolosolfato (PGS)
886
Fosfatidilglicerolosolfato metilestere(PGP-Me)
900
Glicocardiolipina (GlyC)
966
Diglicoside solfato difitanilglicerolo (S-DGD-1)
1056
Diglicoside difitanilglicerolo (DGD-1)
976
Triglicoside solfato difitanilglicerolo (S-TGD-1)
1218
Triglicoside difitanilglicerolo (TGD-1)
1138
Tetraglicoside solfato difitanilglicerolo (S-TeGD-1) 1318
Picchi (valori di m/z) osservati negli spettri ESI-MS (-)
degli estratti lipidici di ceppi da collezione
Genere, specie
Hfx gibbonsii
ATCC 33959
Hfx denitrificans
AtCC 3590
Hfx volcanii
ATCC 29605
Hfx mediterranei
ATCC 33500
Hbr saccharovorum
ATCC 29252
Har vallismortis
ATCC 29715
Har marismortui
ATCC 43049
Hbt salinarum
NRC 1
Hbt salinarun
NRC 817
* picco minore
Fosfolipidi
Glicolipidi
806
886
900
976
X
X
X
X
X
X
X
Cardiolipine
1056 1138 1218 1381
760
966
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
*
X
Mezzi di coltura di microrganismi alofili
DUNALIELLA (1)
NaCl
87.66 g/l
MgSO4
0.60 g/l
CaCl2
33.24 mg/l
KH2PO4
13.60 mg/l
EDTA
6.08 mg/l
NH4Cl
0.44 g/l
NaHCO3
2.07 g/l
Ferro
ALOBATTERI (2)
NaCl
250 g/l
MgSO4 · 7H2O
20 g/l
Sodio citrato diidrato
3 g/l
KCl
2 g/l
CaCl2 · 2H2O
0.2 g/l
Peptone
10 g/l
Metalli in tracce
micronutrienti
(1) Masi and Melis (1997) BBA 1321:183-193
(2) Lanyi and Mc Donald (1979) Methods Enzymol 56:398-407
campione prelevato da una vasca ad elevata densità (27° baumè)
Raccolta delle cellule mediante centrifugazione (7000g x 20 min)
Nota: la dunaliella galleggia
terreno con peptone
• Semina su terreno solido
(prevalenza di bastoncelli)
terreno sintetico
• Semina in terreno liquido
(prevalenza di cellule piatte di
forma geometrica)
terreno privo di peptone
(scarsa presenza sia di
bastoncelli che di cellule piatte)
MdS1 MdS2
MdS1:
MdS2:
MdS3:
MdS4:
MdS5:
MdS6:
MdS7:
MdS3
MdS4
MdS5
MdS6
MdS7
bastoncelli sottili mobili
bastoncelli flagellati
bastoncelli sottili
cellule pleiomorfe piccole mobili
bastoncelli sottili mobili
cellule pleiomorfe più grandi (triangolari, trapezoidali, quadrangolari)
bastoncelli sottili
Piastra di coltura di un microrganismo isolato
salinibacter
dunaliella
cellule quadrate
Salinibacter ruber è un batterio estremo alofilo con
alcune caratteristiche biochimiche tipiche degli
Archaea.
Posizione di due ceppi di S. ruber nell’albero filogenetico basato sulle
sequenze del 16S rRNA.
(Anton et al, Int J Syst Evol Microbiol, 2000)
Salinibacter ruber contribuisce alla colorazione rossa delle acque delle
vasche di cristallizzazione.
(Oren and Rodriguez-Valera, FEMS Microbiol Ecol, 2001)
OH
HO
OH
batterioruberina
OH
salinixantina
H
O
H3C
retinale
660.7
Spettro ESI-MS (-)
dell’estratto lipidico di S. ruber
241.2
intensity
418.1
758.7
200
400
600 800
m/z, amu
1000 1200 1400
Giallo (Retinale?)
Rosso (salinixantina)
Profilo cromatografico
dell’ estratto lipidico di S. ruber
5 DPG
4 DPG
3 PE
2
picco principale: m/z 660.6
1 glicolipide
Le singole bande sono state
analizzate mediante ESI-MS
Analisi FISH di archeobatteri alofili
Identification by FISH of Bacteria in samples from crystallizer ponds.
Identical microscopic fields were visualized with an epifluorescence
microscope using filter sets specific for DAPI (a and c) and the
fluorochromes used for probe labeling (b and d). (a and b) Cells from the
crystallizer in Majorca hybridized with Cy3-labeled probe EHB412. (c and
d) Cells from CR-30 (Alicante) hybridized with fluorescein-labeled probe
EHB586 and Cy3-labeled probe EHB1451. Bar, 5 µm.
16S
regione
spaziatrice
23S
5S
tRNA-Ile, Ala o Glu
RIII
boxA
tRNA-Ile
tRNA-Ala
RIII
Francisco Rodriguez Valera
Alicante, Spain
Franco Fanizzi, Lecce
Aharon Oren
Hebrew University, Jerusalem
Dieter Oesterhelt
Max Planck Institute, Martiensried, Germany
Le Acque Salso-Bromo Jodiche delle Terme di Margherita
Atti del II Convegno Medico Idrologico, 1970
Dott. Antonio di Lecce
Ufficiale sanitario del Comune di Margherita di Savoia
Nome
gr per litro
Millimoli
Cationi
Ione Sodio Na
60,200
2617,4
2617,4
Ione Potassio K
11,800
301,7
301,7
Ione Calcio Ca
0,0005
-
-
Ione Magnesio Mg
28,590
1175,1
2350,2
Anioni
5269,3
Ione Cloro Cl
Ione Bromo Br
Ione Iodio I
142,210
4011,5
0,43
5,4
1841 gamma
Ione Solforico SO4
60,120
Anidride Carbonica
4,08
Silice SiO2
totale
Non dosato 1,8
Residuo a 180° gr 364,400
Residuo al rosso scuro gr 309,2
0,0015
307,4320
626,2
1252,5
5269,3