Determinazione della concentrazione di IgG tramite
saggio immunoenzimatico competitivo
COATING
Preparare 10 mL di una soluzione di IgG di rabbit 1g/mL in tampone carbonato 0.05M pH 9.6
(soluzione A) a partire da una soluzione di un 1mg/mL.
Addizionare 200L della soluzione A in ciascun pozzetto e lasciare incubare per 1 h a temperatura
ambiente (RT);
Preparare 100 mL di PBS + TWEEN 0.05%.
Effettuare 3 lavaggi con 200L di PBS + TWEEN 0.05%.
BLOCCAGGIO
Preparare 5 ml di BSA 5% in carbonato
Addizionare nei pozzetti 200L di una soluzione al 5% di BSA in tampone carbonato (1h RT);
3 lavaggi con 200L di PBS + TWEEN 0.05%.
COMPETIZIONE
Preparare, per diluizioni successive, 1 ml di 5 soluzioni standard di IgG (in PBS):
100, 10, 1, 0.1, 0.01 g/mL.
Preparare 5 mL di una soluzione di Mab-AP 1:1000 (v/v). Successivamente, preparare 10 mL di una
soluzione 1:10000 (v/v) per diluizione 1:10 (v/v) della soluzione di Mab-AP precedente.
Secondo lo schema riportato in figura, addizionare in ogni pozzetto 100 L di IgG di rabbit alle
concentrazioni sopra indicate e 100 L di MAb-AP (1:10000 in PBS) . Porre nei pozzetti 7A, 7B, 7C, al
posto dello standard, 100 L del campione incognito.
* nei 3 pozzetti (1A,1B,1C) di non competizione porre 100 L di MAb-AP + 100 L di PBS.
Incubare 1h a RT.
3 lavaggi con 200L di PBS + TWEEN 0.05%.
0* 0.01
0.1
1
10
100
?
0*
1
3
4
5
6
7
1
2
0.01
0.1
1
10
100
?
2
3
4
5
6
7
A
A
?
B
B
?
C
C
?
LETTURA
Preparare 10 mL di una soluzione di 4-nitrofenilfosfato (11 mM) preparata in tampone Carbonato 0.05M
pH= 9.6 + MgCl2 1mM
Porre in ogni pozzetto 200L di una soluzione di 4-nitrofenilfosfato (11 mM) preparata in tampone
Carbonato 0.05M pH= 9.6 + MgCl2 1mM
Eseguire la lettura della piastra a 405 nm dopo 5, 10, 15 min.
ELABORAZIONE DATI
Riportare in grafico le assorbanze lette a 405nm in funzione delle concentrazioni utilizzate;
Assorbanza@ (405 nm)
dalla curva ottenuta ricavare la concentrazione del campione incognito.
f ( x) 
1
0.001
0.01
0.1
1
gG] / g/mL
10
100
ad
d
b
1  ( x / c)