Quale tipo di informazioni è
possibile ottenere dalla registrazione
di correnti di singolo canale?
Ampiezza media della corrente
di singolo canale
Ampiezza media della corrente attraverso un singolo canale
Chiuso
Aperto
1 pA
20 ms
Traccia di corrente attraverso un singolo canale
Causa la presenza di un rumore di fondo (thermal noise) che è
riducibile ma non eliminabile, l’ampiezza della corrente che fluisce
attraverso un singolo canale è soggetta a fluttuazioni.
Di essa è pertanto possibile conoscere solo il suo valore medio
Il calcolo di tale valore medio richiede la costruzione di un istogramma
di ampiezza derivato dalla registrazione di singolo canale
Costruzione di un istogramma di ampiezza
Chiuso
Aperto
1 pA
20 ms
1000
Numero degli eventi
 Occorre una lunga registrazione di singolo
canale
 Si misurano le ampiezze di tutte le aperture
 Tali ampiezze vengono riportate in un grafico
(istogramma di ampiezza)
 ll dominio dell’ampiezza (ascissa del grafico)
viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno
dei quali si associa il numero di aperture
aventi ampiezza corrispondente
m=2.0 pA
800
600
400
200
0
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Ampiezza (pA)
2.4
La larghezza dell’istogramma dipende dal rumore di fondo della registrazione
L’andamento dell’istogramma può essere descritto da una funzione gaussiana del tipo:
N
dove:
m = ampiezza media di corrente
s = deviazione standard
A = area della distribuzione
( x  m )2
exp
2s 2
2 s 2
A
2.6
Misurando le correnti di singolo canale è possibile
costruire la relazione I-V a canale aperto
-30 mV
-100 mV
L’attività di singolo canale viene misurata nello
stesso patch di membrana a diversi potenziali
0 mV
-100 mV
+40 mV
-100 mV
La relazione corrente-voltaggio a canale aperto è generalmente lineare
anche nel caso di canali voltaggio-dipendenti
iopen single = γ (V-EK)
La “conduttanza di singolo canale (g)” è un parametro biofisico che
può aiutare a identificare un tipo di canale
Probabilità
di apertura
Cos’è la probabilità di apertura?
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7 C8
C9
Chiuso
Aperto
A1
A2
Popen 
POPEN 
A3
A4
A5
A6
A7
A8 A9
A10
A1  A2  A3  .....  An
A1  A2  A3  .....  An  C1  C2  C3  .....  Cn 1
tempo totale trascorso nello stato aperto
tempo tot. nello stato aperto  tempo tot. nello stato chiuso
vale a dire,
POPEN  frazione del tempo trascorso nello stato aperto
Tracciati di singolo canale che mostrano Po diverse
0.1
chiuso
aperto
0.25
chiuso
aperto
0.5
chiuso
aperto
0.75
chiuso
aperto
chiuso
0.9
aperto
Po nel caso di un canale voltaggio-dipendente:
Essa varia al variare del potenziale
-60 mV
-100 mV
-30 mV
-100 mV
0 mV
-100 mV
+40 mV
-100 mV
Currente, conduttanza, e voltaggio
I = N·P·i
i = g (V – VR)
I = corrente “macroscopica”
N = numero di canali funzionali
P = probabilità che un canale sia aperto
i = corrente attraverso un singolo canale aperto
g = conduttanza del singolo canale aperto
V = potenziale di membrana
VR = potenziale di inversione
4
i = g (V – VR)
I = N·P·g (V – VR)
I = g (V – VR)
I (nA)
Corrente = Conduttanza  Driving force
g = Conduttanza “macroscopica”
g=Npg
se g è costante, g è proporzionale a P
I = g (V – VR)
Quale altro tipo di informazione può
dare l’analisi delle correnti di singolo
canale?
1. Il numero degli stati in cui il canale può esistere
2. Il tempo medio di permanenza in ciascun stato
3. Le velocità di transizione tra gli stati
I tre tracciati mostrano la stessa probabilità di apertura ma cinetiche diverse
chiuso
aperto
chiuso
aperto
chiuso
aperto
Durata delle aperture e delle chiusure
Chiuso
1 pA
Aperto
100 ms
Traccia di corrente attraverso un singolo canale ottenuta ad un potenziale fisso senza alcun tipo
di sollecitazione (stato stazionario).
• La corrente passa frequentemente dall’uno all’altro di due distinti livelli
• Il canale pur in condizioni stazionarie può trovarsi in almeno due stati
conformazionali : chiuso e aperto
• La traccia mostra una notevole variabilità nella durata delle aperture e delle
chiusure
• Non è possibile prevedere quanto tempo il canale rimarrà in ciascun stato
funzionale (chiuso o aperto), né quando avverrà la successiva transizione:
Siamo di fronte a variabili casuali (stocastiche o markoviane)
Le leggi che le governano possono essere dedotte dalla distribuzione di
probabilità di un elevato numero di eventi (aperture e chiusure)
Come ricavare la distribuzione di probabilità
delle aperture e delle chiusure
• Occorre una lunga registrazione di singolo canale
• Si misurano le durate di tutte le aperture (e chiusure)
• Tali durate vengono riportate in un grafico (istogramma di durata)
• ll dominio temporale (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a
ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi durata corrispondente
Chiuso
Aperto
100 ms
500
350
400
250
∑aperture=950
200
150
100
Numero degli eventi
Numero degli eventi
Tempi di chiusura
Tempi di apertura
300
∑chiusure=950
300
200
100
50
0
0
5
10
15
20
25
Durata aperture (ms)
30
20
40
60
80
100
Durata chiusure (ms)
120
140
500
350
300
400
Numero degli eventi
Numero degli eventi
Tempi di chiusura
Tempi di apertura
250
=8 ms
200
150
100
=26 ms
300
200
100
50
0
0
5
10
15
20
25
30
20
40
60
80
100
120
Durata chiusure (ms)
Durata aperture (ms)
Notare l’andamento decrescente delle due distribuzioni:
• gli eventi di breve durata sono i più frequenti
• gli eventi più lunghi sono via via sempre meno numerosi
Le due distribuzioni delle durate sono ben descritte da funzioni del tipo:
t 
N ( t )  a  exp




dove:
• N(t) = numero di aperture comprese tra (t-0.5dt) e (t+0.5dt)
• dt =intervallo in cui è suddivisa l’ascissa
• a e  sono costanti tipiche del canale
In particolare,  =costante di tempo è un indice di quanto rapidamente la distribuzione
declina verso zero:
 è il tempo a cui la distribuzione è il 37% del suo valore iniziale
Nel caso di uno schema cinetico a due stati (C↔O) a=1/
140
Come sono correlati i tempi di permanenza e le
costanti di velocità nel caso di un modello a due stati?
a
C
1
N( to )   o  exp( t /  o )
b
O
1
N( tc )   c  exp( t /  c )
Si può dimostrare che:
N ( to )  b  exp(  b t )
N ( tc )  a  exp( at )
Cioè: Il tempo medio che il canale trascorre in un particolare stato (il
soggiorno in quello stato) e’ il reciproco della costante di velocità di
transizione che porta fuori da quello stato.
Tempo Medio di Apertura (MOT o o) = 1/b
Tempo Medio di Chiusura (MCT o c) = 1/a
Per esempio, se:
la durata media dei soggiorni nello stato aperto è o= 1 ms
e la durata media di soggiorni nello stato chiuso è c = 4 ms,
Allora: b=1/ o = 1 ms-1 e a=1/ c = 0.25 ms-1
Per capirne di più….
Quindi, in uno schema cinetico a 2 stati: MOT=1/b e MCT=1/a
La frazione di tempo che il canale trascorre in uno dei due stati (che poi
corrisponde alla probabilità P che il canale si trovi in uno dei due stati) dipende
da entrambe le costanti di velocità a e b. Pertanto:
MOT
a

Fraz. di t nello stato aperto = Po=
MOT  MCT a  b
Se misuriamo un gran numero di tempi di apertura successivi, che tipo di
distribuzione osserviamo?
Supponiamo che un canale aperto abbia una probabilità P= 0.3 di chiudersi nei
successivi 0.1 ms. Allora, misurando 1000 aperture, circa 700 volte si
avrebbero aperture con un to>0.1ms, ecc.
800
N. eventi con ..
70% di 1000
700
70% di 700
490
70% di 490
343
70% di 343
240
….
….
t o > di..
0.1
0.2
0.3
0.4
….
700
600
500
400
300
200
100
0
0
0.2 0.4 0.6 0.8
1
1.2 1.4 1.6
Per capirne di più….
Quando il canale è aperto vi è una probabilità costante che esso cambi il suo stato
da O a C in un breve e definito intervallo di tempo dt, indipendentemente da
quanto a lungo già si trovava nello stato O, o da come ci era arrivato.
Supponiamo per esempio che esista una probabilità P=0.3 che la transizione
avvenga nei successivi 0.1 ms. Ciò significa che possiamo fare predizioni
statistiche circa il cambiamento da O a C. Avendo osservato un gran numero di
canali aperti, circa nel 30% di essi il cambiamento a C sarà avvenuto nei primi
0.1 ms. Quindi, dopo 0.1 ms il 70% di essi è ancora nello stato O. Nei successivi
0.1 ms, un ulteriore 30% del rimanente 70% cambierà a C, e così via.
Processi con tali caratteristiche, che la probabilità di un particolare cambiamento
rimane costante in piccoli intervalli di tempo successivi, sono esempi di processi
Markoviani.
Canali con più stati chiusi distinguibili
Chiuso
Aperto
350
350
Tempi di apertura
300
200
150
=8 ms
100
50
Numero chiusure
Interpolazione con un
singolo esponenziale,
una costante di tempo
250
Numero aperture
Tempi di chiusura
300
250
Interpolazione con una
somma di due esponenziali:
due cost di tempo
1=2.3 ms a1=0.4
2=25 ms a2=0.6
200
150
100
50
0
5
10
15
20
25
30
0
10
Durata aperture (ms)
20
30
40
50
60
Durata chiusure (ms)
Schemi cinetici possibili:

 C2 

 O
C1 



 O 

 C2
C1 


In questo caso le relazioni tra i tempi medi di apertura e di chiusura e le
costanti di velocità dipendono dallo schema cinetico scelto
Importanza di:
Frequenza di campionamento
Filtraggio dei segnali
nella registrazione di correnti di singolo canale
Seguiranno esempi di tracciati mostranti la
perdita di informazione con una frequenza di
campionamento bassa o con un filtraggio
eccessivo
Effetto del filtraggio su un tracciato di
corrente di singolo canale
Traccia filtrata a 10000 Hz
Traccia filtrata a 1000 Hz
0.5 pA
4 ms
In pratica per correnti di singolo canale il filtraggio analogico del
segnale è normalmente compreso tra 5 e 3 KHz
Effetto della frequenza di campionamento su un
tracciato di corrente di singolo canale
Freq. camp. = 0.1 ms/punto
Freq. camp. = 0.4 ms/punto
0.5 pA
4 ms
Teorema del campionamento: i dati dovrebbero essere campionati
ad una frequenza almeno doppia di quella della banda passante
Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali
ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e
biologi molecolari
Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una
particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel
processo di apertura/chiusura.
Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico
Gene (DNA)
Ipotesi circa una
importante catena laterale
RNA
Viene fatta
“esprimere” la
proteina con una
catena laterale
alterata
Vengono mutati i codons desiderati
o cDNA
misura