Università degli Studi di Perugia
Corso di Laurea Interfacoltà in Biotecnologie
Fondamenti di Bioinformatica e di Biologia dei Sistemi
Proteomica e Metabolomica
Software usati in proteomica
Pier Luigi Orvietani
Biotecnologie 2011-2012
Strumentazione per la cattura delle immagini
VERSADOC
Tools del Versadoc tramite software
Identificazione
Comparazione
Il confronto e l’analisi dei 2D Gels vengono effettuati mediante
l’uso di opportuni Hardware e Software
Bioinformatica
PDQuest Workflow
Acquire the image
Size and orient the image
Spot identification
Spot comparison and matching
Data analysis
Spot cutting and mass spectrometry analysis
Publish results
Digital Data and Signal Intensity
PDQuest converte i segnali dal campone biologico in dati digitali
Ogni oggetto visualizzato dal monitor è composto da tanti piccoli pixel.
Ogni pixel ha una coordinata X eY a cui corrisponde una posizione
orizzontale e verticale
Vi è anche un valore Z che corrisponde all’intensità del segnale del pixel
Caratterizzazione dell’intensità del segnale
L’oggetto per essere visibile e quantificabile deve avere l’intensità del suo cluster
di pixel maggiore di quella del background
L’intensità totale di un oggetto è la somma dell’intensità di tutti i pixel che formano
lo stesso oggetto
L'intensità media di un oggetto è l'intensità totale diviso per il numero di pixel
dell'oggetto.
L‘unità dell’intensità del segnale è espressa in Densità Ottica D.O.
IMMAGINI CREATE DURANTE LO SPOT
DETECTION
2-D Scan
Filtered Image
Gaussian Image
PDQuest usa modelli Gaussiani per creare spot che possano essere precisamente
identificati e quantizzati
PDQuest crea spot Gaussiani rapportati tridimensionalmente per meglio
evidenziare le differenze fra di loro
SPOT QUANTITY
Spot Quantity è la totale intensità di un spot ben definito in un immagine del gel
Spot Quantity viene calcolato mediante l’immagine Gaussiana con la seguente
formula
Altezza dello spot * π *σx * σy
Altezza dello Spot è il picco dello spot ed è misurato in OD/ unità di immagine (IU)
1 IU: 0,1 mm
σx σy è la deviazione standard della distribuzione Gaussiana dello spot
secondo gli assi X e Y . Anche queste sono misurate in IU
Spot Quantity viene espresso in OD*IU2
L’IMMAGINE VIENE IMPORTATA E VISUALIZZATA
L’Immagine viene regolata nelle sue caratteristiche di
luminosità, contrasto, gamma etc.
Una volta elaborata viene tagliata e dimensionata
via software vengono individuati gli spots,
dai più deboli ai più intensi
Il software confronta i vari gels,
evidenziando gli spots (proteine)
presenti o assenti nell’uno o nell’altro.
Normalizzazione dei dati
Formula di Normalizzazione
Raw spot quantity * Scaling factor * pipette error compensation factor
__________________________________________________
Normalization factor
Raw spot quantity è l’intensità dello spot
Scaling factor è il valore con cui noi vogliamo esprimere l’intensità
normalizzata (PPM ;%)
Normalizzazione dei dati
Vari tipi di analisi possono essere effettuate
Vari tipi di analisi possono essere effettuate
Gli spot possono essere elaborati
anche con analisi statistica
… mettere in relazione i dati derivanti da set di analisi
per es. l’analisi quantitativa con l’analisi statistica
Ottenere alla fine un quadro riassuntivo degli spot di interesse
Gli spots vengono ricontrollati ed ottimizzati
Anche con l’aiuto dell’immagine 3D degli spot interessati
E’ possibile esaminare i gels relativi a diversi
esperimenti …
… e confrontarne i risultati
Ogni proteina (spot)
è caratterizzata
da Mr - pI
Ricerca nei
Data Base
Se non è possibile ritrovare gli spot in data base
allora si prosegue con l’analisi degli spot dal gel
SPOT CUTTER
ALCUNE DELLE APPLICAZIONI DELLA PROTEOMICA
CAMPO FARMACEUTICO:
STUDIO DEGLI EFFETTI DI NUOVI FARMACI E LORO
IDENTIFICANDO LE VARIE MODIFICAZIONI POLIPEPTIDICHE
TOSSICITA
CAMPO AGRO-ALIMENTARE:
STUDIO DI PROTEINE TOSSICHE O PROTETTIVE CHE SONO COINVOLTE
IN MOLTI MECCANISMI DI RESISTENZA AD AGENTI PATOGENI E
PARASSITARI SVILUPPATISI CON L’INTRODUZIONE DI TECNOLOGIE
TRANSGENICHE
NELLA CLINICA MEDICA:
ANALISI DI MAPPE PROTEOMICHE COME MEZZO DI DIAGNOSI
RICERCA DI NUOVI TARGET TUMORALI:
DALLO
STUDIO
DI
PROTEINE
DI
MEMBRANA
E
LORO
CARATTERIZZAZIONE SI POTRANNO SVILUPPARE FARMACI SEMPRE
PIU MIRATI ALLA LORO CURA
NELLA CLINICA MEDICA:
ANALISI DI MAPPE PROTEOMICHE COME MEZZO DI DIAGNOSI SIA PER I
TUMORI CHE PER LE MALATTIE INFETTIVE
RICERCA DI NUOVI TARGET TUMORALI:
DALLO
STUDIO
DI
PROTEINE
DI
MEMBRANA
E
LORO
CARATTERIZZAZIONE SI POTRANNO SVILUPPARE FARMACI SEMPRE PIU
MIRATI ALLA LORO CURA
Caratterizzazione della
Proteina Tumorale TD52
proteina
M
(kDa)
75 _
50 _
37 _
S3
25 _
S2
S1
mappa 2D
4
5
6
7
6
7
anticorpo
75 _
50 _
37 _
S3
25 _
S2
4
S1
5
La 2-DE si può applicare anche con l’uso di isotopi radioattivi
incubazione con S35
del campione
solubilizzazione
separazione in 2DE
seccaggio del gel
esposizione su lastra