Proprietà sistemiche
Dall’elasticità ai coefficienti di controllo
Se il RLS non va bene con cosa
possiamo sostituirlo?
S e J: proprietà sistemiche
* Le questioni del controllo non possono essere trattate
guardando solamente allo stadio isolato.
* Ciascuna variabile (metabolita o flusso) non è determinata
da un singolo stadio ma dipende in generale da tutti, magari in
maniera diversa. Come possiamo formalizzare questo in
maniera quantitativa?
* Se vogliamo risposte quantitative dobbiamo porre domande
quantitative
Flux Control Coefficient
J
(C )
Cosa sono, a cosa servono e come posso misurarli
v1
X0
v2

S1
E1

E2
v3
S2

E3
S3
v4 …
vn
…..

E4 …
X1
En
Se siamo allo steady state, v1 = v2 = v3 = v4 = vn = J
Operiamo una variazione nell’enzima E2,
quale sarà la variazione di J corrispondente?
Misura di CJ
ΔE2  ΔJ
Operando una variazione piccola di J (ma sufficiente per una
misura affidabile) ci avviciniamo alla derivata della curva J= J(E2)
δE2  δJ
J
 Coeff. angolare
 E2
J
J  E 2   J  E 2  J   ln J  C J
E2
 E2
J  E2
J E 2  ln E 2
E2
J
C Ei
Per ogni flusso (reazione), ci sono tanti CJ
quanti enzimi; (se ci sono più flussi…)
Il tipo di definizione è simile a quella dell’elasticità, ma il CJ
non è una proprietà di tipo locale, bensì di tipo sistemico
Per misurare CJ con precisione occorre fare piccole variazioni
nella quantità di un enzima (e uno solo!!)
Questo non è sempre fattibile dal punto di vista sperimentale
Che forma avrà la curva J(E)?
A valori
bassi di E
A valori
alti di E
Derivata e derivata con scaling
CJ in un grafico log-log
In questa zona la
pendenza è 45%
cioè il coeffic.
Angolare (che è
il CJ), è 1
La relazione enzima flusso in un caso reale:
Photosynthesis (Calvin cycle)
Light 400 μmol/m2*s
Haake et al. (1998) Plant J. 14:147-57
Reduction of plastidial aldolase
(reaction close to equilibrium)
% reduct.
Aldolase
% inhibit.
Photosynt.
35-78
10-45
Enzyme (% wt)
CJaldolase in wt ≈ 0.24 (normal conditions)
L’aldolasi plastidiale è un enzima che lavora vicino all’equilibrio ma che è limitante
Reduction of plastidial transketolase (reaction close to equilibrium)
Light at 220,
350, 700 μE
Condition
CO2 amb., light at 220 μE
CO2 amb., light at 700 μE
CJTK for wt plants
0.14
0.32
La transketolasi è un enzima che lavora vicino all’equilibrio ma che è limitante
Rubisco
57
100 (wt)
31.1
54.1
Activation %
93.5
62.5
Assimilation
6.35
6.80
Rubisco (%)
“
Vmax
CJRubisco= 0.1 in wt conditions
La Rubisco è un enzima che lavora molto lontano dall’equilibrio e che NON è limitante
Flux control in photosynthesis
A significant share of flux control is in
enzymes ‘close to equilibrium’
Highly regulated enzymes working far from
equilibrium show less flux control
When light is switched on, flux increases: 
many reactions are activated through changes
in pH, Mg2+, redox status (thioredoxins),
carbamylation, inhibitor degradation…
 Attivazione parallela (no sign for a RLS!)
Una via metabolica reale: biosintesi di Trp in lievito
Biosintesi del Triptofano in Saccharomyces cerevisiae:
5 enzimi trasformano l’Acido Corismico in Triptofano
AAS (TRP2)
PRT (TRP4)
InGPS (TRP3)
PRAI (TRP1)
TrpS (TRP5)
A rigore le variazioni dovrebbero essere piccole…
La figura testimonia due fatti:
- I valori di CJ in vivo, nelle condizioni wt, sono bassi
- Incominciano a salire solo per riduzioni notevoli della
quantità di enzima (<50%)
Due conclusioni importanti
Flux change: an asymmetric problem
* Easy: Stopping flux to a product through a pathway.
(Pick any enzyme; knock out by mutation or inhibition).
* Hard: Increasing flux to a product through a pathway.
* La sovraespressione non porterà un grande (quanto?)
aumento nel flusso!
* Molti enzimi hanno un CJ basso per cui una buona
parte dell’attività di ciascuno di essi è dispensabile e
questo significa che molte mutazioni sono recessive!
Verifica sperimentale della prima conclusione
Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i geni
causa un ΔJ paragonabile al ΔEi (ΔJ  CJ x ΔEi )
Alcune proprietà dei
J
C
X 0  S1  S2  S3  S4  X1
E1 E 2 E 3 E 4 E 5
Facciamo un esperimento con il pensiero…
aumentiamo l’enzima E1 di una quantità δE1
es. incremento frazionario dell’1% (δE1 / E1)
 E1
E1
   1%  0.01
Otterremo un aumento di flusso δJ, la cui entità sarà:
 J E1
J

C EJ1
 J E1

indica l’aumento di flusso
determinato dall’enzima 1
Immaginiamo di fare lo stesso per tutti gli enzimi
δE3
δE1
δJ
δJ
δE2
δJ
δE4
δJ
E1

J
δE5
E2

J
E3

J
E4

δJ
J
E5

J
 J tot

 J E1

 J E2

 J E3
...
 J En

J
J
J
J
J
 C EJ1    C EJ2    C EJ3    ...C EJn   
   (C EJ1  C EJ2  C EJ3  ...  C EJn ) 
 
n

J
C Ei

1
A moment's reflection should show that such a change is equivalent to changing the time scale of the
measurements: thus it should change all steady-state fluxes through the system by exactly a factor of α.
n
Teorema della somma

1
C EJi  1
Se la somma di tutti i coefficienti CJ deve valere 1,
allora si spiega perché in una via metabolica molti (se
non addirittura tutti) gli enzimi hanno un CJ basso!
Questo darebbe ragione della recessività dei geni (95%)!!!
(nessuna spiegazione alternativa rende ragione dei dati)
Phenotype is flux!
(non sempre…)
A cosa servono i CJ ? Ci permettono di predire il flusso in funzione
della quantità di enzima. La bontà della predizione sarà tanto maggiore
quanto più piccola sarà la variazione di enzima.
J
J E
 CE 
J
E
ΔJ
ΔE
E1
Viene però usata di solito questa formula
per predire le variazioni di flusso, perchè
l’approssimazione è minore
 ln J
E2
J
 CEi
  ln Ei
Se il flusso dipende dalla quantità di enzima
con la legge di un’iperbole rettangola,
AEi
J
B  Ei
…allora è possibile ricavare il CJ anche quando avvengono
grandi variazioni di E (cosa che in genere non si può fare)
CEJ
(J 2  J1 ) E 2

(E 2  E1 )J 2
Si usano in pratica i valori di E e di
J non di “partenza”, ma di arrivo
Note that this differs from the small-change estimate of the flux control coefficient in
that the scaling factor is E2/J2, not E1/J1 (the ratio at the original operating point).
Usando questa formula si può derivare una formula più
generale per predire le variazioni di flusso in funzione
dell’entità della sovraespressione di un enzima:
f flusso relativo
1
f 
r 1 J
1
 C Ei
r
Quando r
è grande
1
f 
1  C EJi
Se sovrasprimo di 5 volte un enzima con CJ di 0.6, basta usare la curva “5” (r = 5) e
trovare dove incontra la retta x=0.6, il risultato sarà un flusso relativo f~2
Coefficienti di controllo delle
concentrazioni
Sj
C Ei
“j” è l’indice da far variare su tutti i substrati
“i” è l’indice da far variare su tutti gli enzimi
Ci dicono come varia la concentrazione dell’intermedio j-esimo
(Sj) al variare della quantità di enzima i.
Attenzione che non è l’inverso dell’elasticità.
E’ di nuovo una proprietà sistemica e ve ne sono in totale: (n
enzimi) x (m substrati)
Definizione formale di
S
C
 S3
S3
S3
E 2  S3 E 2 S3  ln S3





 CE2
 E 2 S3  E 2 S3 E 2  ln E 2
E2
 ln S j
 ln E i
Sj
 C Ei
Ci dice come varia la concentrazione di un metabolita
al variare di un enzima.
Proprietà sistemica: variando anche un solo enzima è
possibile che cambino TUTTI i metaboliti variabili
Esistono n x m CS (n reazioni, m metaboliti)
Per i vari CS valgono relazioni analoghe al teorema della somma
 Sj
Sj
Sj
 C E1
Sj
 C E1

 
Sj
 (C E1

 E1
E1
Sj
C E2
 C ES2J

Sj
C E2
 
Sj
 C E3

 E2
Sj
C E3
E2
 
Sj
 ...  C En
 E3
Sj
 C E3

Sj
...C En
 
)  
n
E3

...
Sj
C En

 En
Sj
C Ei
1
Se tutti gli enzimi aumentano in quantità (velocità)
dello stesso fattore, quale sarà la variazione di SJ ?
Vale 0!
En

Per ogni S la somma dei CS vale 0
n

Sj
i C Ei
0
Teorema della somma
1
Che significato ha?
 Alcuni enzimi aumentano la concentrazione di SJ
 Altri enzimi diminuiscono la concentrazione di SJ
Che relazione esiste tra CJ e ?
Possiamo derivare le proprietà sistemiche dalle proprietà
locali?
Possiamo collegare tra loro le proprietà sistemiche (CJ, CS)
e proprietà locali ()?
Come una variazione locale di attività
enzimatica influisce sul sistema?
Aumentiamo un poco E2. Cosa succederà a monte di E2?
v1
v2
v3
v4
E3
E4
X 0  S1  S2  S3  X1
E1
E2
S1 scende, ma questo comporta:
una diminuzione di v2 e un aumento di v1
Similmente S2 sale e questo comporta:
una diminuzione di v2 e un aumento di v3
v1
v2
v3
v4
E3
E4
e
e
e
e
1
2
3
X 0  S1  S2  S3 4 X1
E1
E2
Non è possibile prevedere intuitivamente la risposta del
sistema (il nuovo ss) a motivo degli effetti incrociati.
Esistono però dei vincoli tra le proprietà sistemiche (es. i
CJ) in termini delle elasticità che possiamo derivare.
Come?
Coefficienti di risposta
How can we describe the sensitivity of a steady-state variable to a
perturbation of the local rate (activity) through a specific step caused
by a change in a parameter that affects this step directly?
Cambio il parametro x  x + δx , raggiungo un nuovo steady state
il flusso passerà da J a J + δJ
Although the parameter acted locally on step i, the change we
observe is systemic in the sense that the properties of all steps in
the system contributed to the observed change in the steady state.
Coefficiente di risposta
Supponiamo che un enzima in una via metabolica sia sensibile ad un inibitore I.
Quale sarà il cambiamento del flusso nella via quando aggiungo l’inibitore in
vivo?
Dipenderà da a) quanto è forte l’effetto dell’inibitore sull’enzima
dv
E
v
I 
dI
I
b) quanto è forte il controllo del flusso da
parte dell’enzima (quanto vale il suo CJ)
lnJ lnJ lnv k
RI 


 CEJ ε EI
lnI lnv k lnI
J
k
Posso descrivere l’effetto di un qualsiasi composto
attraverso l’elasticità degli enzimi sensibili a quel
composto e i corrispondenti CJ
k
Come riformulare
quantitativamente l’analisi di una
via metabolica?
Flusso nella via: J
v1
X0

E1
v2
S1

E2
v4 …
v3
S2

S3
E3

…..
E4 …
vn

X1
En
Variabili: il flusso J, n metaboliti e (n+1) enzimi
Possiamo ricavare il valore dei coefficienti di controllo (CJ e CS)?
Quante incognite e quante equazioni?
La via metabolica prevede:
Il flusso, n metaboliti e (n+1) enzimi, le cui  sono note (o
conoscibili tramite esperimento)
Come incognite ci sono:
(n+1) CJ e n(n+1) CS
cioè n+1 + n(n+1) = (n+1)2
Per ricavare il valore numerico dei coefficienti abbiamo
bisogno di avere (n+1)2 relazioni tra i coefficienti
Sappiamo che esiste 1 equazione che lega i CJ e n che legano i CS
Mancano n2 + n equazioni che ricaviamo dai teoremi della
connettività
Connettività per i
metaboliti (CJ)
E’ possibile ottenere una piccola variazione nella concentrazione
di un metabolita interno al sistema (es. δS2), senza cambiare il
flusso J o le concentrazioni degli altri metaboliti (es. S1)?
RISPOSTA: è possibile se oltre al metabolita simultaneamente cambia anche
qualche altro parametro (ad es. se l’enzima Ei aumenta della quantità dEi), in
modo da mantenere costante la velocità vi dell’enzima in questione; la variazione
di velocità sarà nulla e i due cambiamenti saranno legati come segue:
dv i
v dE i
v dS J
 εE
 εS
0
vi
Ei
SJ
i
i
i
J
Cambiando la concentrazione di S2) cambierà la velocità di tutte e
tre le reazioni (v1, v2 e v3) in quanto S2 è rispettivamente prodotto,
substrato e regolatore.
Immagino una piccola variazione nella concentrazione di ciascuno
dei tre enzimi in modo da un mantenere costante la velocità di
ciascuna reazione
Che δe1 abbia un effetto compensativo dell’effetto di δs2 on v1:
δv1
v δe1
v δS2
 εe
 εS
0
v1
e1
S2
1
1
1
2
Per la reazione 1
Normalmente questa ε vale 1 perchè la velocità di un enzima
isolato aumenta dell’1% se metto l’1% in più di enzima
Per le altre due reazioni:
Per le reazioni 2 e 3
Although the system is in a new steady state (some parameters have
changed), only the value of S2 is different; J and S1 are still the same.
Teorema della Connettività (CJ) per il metabolita S2
v
S2 ha un effetto diretto sulla velocità di E1 per cui ε S12  0
Facendo lo stesso per S1
C JE1ε Sv1  C JE2ε Sv 2  0
1
1
S1 non ha alcun effetto diretto sulla velocità di E3, per cui
il termine ε Sv3 sarà nullo e l’espressione è più semplice
1
Combining the summation theorems with the connectivity theorem, we
are able to express the flux control coefficients in terms of the elasticities
of the enzymes towards the internal metabolite concentrations.
Per ogni metabolita posso scrivere una relazione
tra i CJ in base al teorema della connettività
 n equazioni della connettività (CJ) (una per ogni metabolita)
(a cui si aggiunge 1 teorema della somma per i CJ)
In totale abbiamo quindi (n+1) relazioni che legano i CJ
 sono sufficienti per risolvere il sistema di equazioni che coinvolgono i CJ.
 n2 equazioni della connettività (CS) (n per ogni metabolita)
(a cui si aggiunge n teoremi della somma per i CS)
 sono sufficienti per risolvere il sistema di equazioni che coinvolgono i CS
Per mezzo di ragionamenti analoghi è possibile derivare le
relazioni tra i CS e le ε
Connettività per i CS
C
Sj
Ei

Ei
Sj
 1
i
Teorema della connettività per i CS
con εS e CS definiti per lo stesso
metabolita S (Sj).
Es., per S2 nello schema della diap. 6
n

i 1
hk
C 
Sh
Ei
Ei
Sk
0
Teorema della connettività per i CS
con εS e CS definiti per metaboliti
diversi
Es., per S2 nello schema della diap. 6
Sistemi semplici
X 0  S1  X1
E1 E 2
Somma CJ
C 
C EJ1  C EJ 2  1
J
E1
connettività CJ
E1
S1
C 
J
E2
E2
S1
0
E’ un sistema di due equazioni in due incognite
C 
J
E1


E2
S1
E1
S1

E1
S1
C
J
E2



E2
S1
E2
S1

E1
S1

E1
S1
0
Se considero anche i CS avrò ancora
due equazioni in due incognite
C ES1
1
 C ES1
2
C ES11  SE11  C ES12  SE12  1
0
Essendoci 1 solo metabolita interno (S1) non
esistono altre relazioni della connettività dei CS
Anche i CS possono essere definiti sulla base delle elasticità
C
S1
E1


E2
S1
1
  SE11
C
S1
E2
1
 E
 S12   SE11
Control coefficients in a three-step pathway
(http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca6.htm#2)
v1
v2
v3
X 0  S1  S2  X1
e1 e 2
e3
J
CE2
Esempi dei valori di un
CJ e di un CS
C 
S1
E1

 
     
E1 E3
S1 S2
2
 
E3
S1
E2 E1
S2 S1
 SE   SE
E E
E E
E
E
S S S S S S
3
E2
S1
E1 E3
S1 S2
E2 E3
S1 S2
1
1
3
2
2
2
1
1
2
2
2
1
1
2
…e se conosco le leggi cinetiche per gli enzimi e la
concentrazione di S1, allora posso ricavare il valore
numerico delle elasticità e quindi il valore dei CJ e dei CS
Posso risolvere il sistema!!!
Esempi più complessi ma ancora semplici da risolvere
manualmente: vedi via metabolica descritta in
Cap. 10 di “Fundamentals of Enzyme kinetics”, di A. Cornish Bowden
Vai a: Go to chapter 10 “Fundamentals of enzyme kinetics )
Per sistemi complessi (con tanti enzimi, biforcazioni e
substrate cycles), ci vuole l’algebra matriciale
(vedere su questo Hofmeyr-Westerhof-Snoep, cap.2)
Cosa serve un modello?
Nei modelli dinamici come quelli appena descritti, ricavo i
valori di CJ che suggeriscono i punti di intervento (metabolic
engineering). Non è garantito il successo (il modello potrebbe
essere sbagliato!) ma almeno posso fare predizioni da mettere
alla prova …
I coefficienti (del flusso e delle concentrazioni) dipendono anche
dai valori dei parametri (X0, X1, quantità dei vari enzimi…). Se
cambiano i parametri, automaticamente cambia lo ss e i valori
* delle concentrazioni dei metaboliti
* del flusso
Una raccomandazione:
Abbiamo introdotto i concetti di Coefficiente di
controllo 1) del flusso e 2) delle concentrazioni)
Non torniamo indietro ad usare la vecchia nomenclatura del Rate
Limiting Step!
Alla domanda “How much?” (quanto un enzima influenza un flusso o
una concentrazione) rispondiamo con un valore numerico (CJ o CS ).
Referenze
Articolo sulla via del Trp in Saccharomyces:
Niederberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H. (1992) A strategy for increasing an in vivo
flux by genetic manipulations. The tryptophan system of yeast. Biochem J. 287:473-9.
Per il concetto di CJ e di elasticità:
Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 5; vedi anche http://bip.cnrsmrs.fr/bip10/mca3.htm#1 e http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca4.htm
* Jan-Hendrik S. Hofmeyr, Jacky L. Snoep, Hans V. Westerhoff (2002) Kinetics, Control
and Regulation of Metabolic Systems, Pag. 66-75 (chapter 3: Metabolic Control Analysis)
Tesi Teusink: http://www.narcis.nl/publication/RecordID/oai%3Auva.nl%3A79049
Da leggere: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9202124
Per la dimostrazione dei teoremi si veda anche la ristampa dell’articolo originale:
Kacser, Burns, Fell (1995) The control of flux. Biochem. Soc. Trans. 23, 341-366
Vedi anche il cap. 10 di “Fundamentals of Enzyme kinetics”, di A. Cornish Bowden
Go to chapter 10 “Fundamentals of enzyme kinetics”
Continua...
Formulazione alternativa del
teorema della connettività per i CJ
dE i
v dS J
 ε S
Ei
SJ
i
J
Possiamo così calcolarci per ogni enzima che sia sensibile a sJ, quale debba essere il
corrispondente cambiamento di concentrazione in Ei (dEi) per ottenere una vi costante
(ammettiamo per semplicità che SJ influisca solo sulla velocità degli enzimi E2 ed E3.
Per una variazione in dSJ a flusso costante, possiamo riscrivere il teorema della somma*:
dS J
dJ
E dS J
J
CE  S
 CE  S

0
SJ
SJ
J
J
2
Più in
generale
E2
3
J
3
J
E dS J
J
0
i CE  S
SJ
i
i
J
C   0
i
J
Ei
Ei
SJ
S2 affects the activities of the enzymes in the pathway (described by the elasticities),
and these affect the flux (via the flux control coefficients). In the end, however, the
total response of the system to a change in the concentration of S2 should be zero