METODICHE MOLECOLARI APPLICATE A
CAMPIONI PARAFFINATI DI
TUMORI DELLA EWING FAMILY (EFT)
A. Parafioriti(1), S. Del Bianco(1), E.
Armiraglio(1), S.Mapelli(2)
(1) U.O. Anatomia Patologica; (2) Centro di
Chirurgia Ortopedica Oncologica
Istituto Ortopedico Gaetano Pini - Milano
Sarcoma di Ewing
Tumore maligno dell’osso più comune in età pediatrica dopo
l’osteosarcoma con prognosi legata a :
• presentazione localizzata (70 % sopravvivenza)
• metastatica (30% sopravvivenza)
Descritto da J. Ewing nel 1920
e rimasto per decenni ad
istogenesi
incerta.
Oggi
sappiamo che ha origine
neuroectodermica
e
che
insieme al Tumore di Askin ed
ai Tumori neuroectodermici
primitivi (PNET) costituiscono
un gruppo chiamato EFT con
caratteristiche
istologiche,
immunofenotipiche, genetiche
comuni.
FLI1
CD99
Caratteristiche citogenetiche
Il sarcoma di Ewing
cromosomiche peculiari:
t(11;22) nel 70% dei casi
t(21;22) nel 10% dei casi
t(7;22) nel 5% dei casi
t(17;22) ed altre…
La
traslocazione
più
frequente t(11;22)(q24;q12)
produce
un
gene
chimerico EWS/FLI1 che
codifica per una proteina
espressa nel 90% dei EFT.
presenta
delle
traslocazioni
Riscontro delle traslocazioni
L’identificazione
importante:
delle
traslocazioni
è
-per motivi diagnostici (diagnosi differenziale
dei tumori a piccole cellule Ewing-like)
- per motivi prognostici/predittivi (valutazione
di malattia residua a livello midollare e
plasmatico).
Scopo dello studio
Abbiamo applicato routinariamente la metodica RTPCR che permette di rilevare la presenza dei trascritti
di fusione più comuni EWS/FLI1 e EWS/ERG in sezioni
tumorali paraffinate di pazienti portatori di EFT dello
scheletro.
L’accurata scelta dei primers ha reso possibile, con
un’unica amplificazione, la discriminazione tra i due
sottotipi del trascritto EWS/FLI1.
Alcuni casi sono stati tipizzati anche con metodica di
Real-Time PCR (qRT-PCR).
Metodi
L’analisi è stata condotta su 53 campioni di sarcoma EFT
dell’osso.
• L’RNA è stato estratto da sezioni paraffinate con un kit
commerciale
• Il risultato dell’estrazione è stato valutato
spettrofotometro ottenendo valori di ratio e resa.
allo
• Due microgrammi di RNA sono stati retrotrascritti in
cDNA ed è stata effettuata una PCR sul gene
housekeeping PGK per verificare la buona qualità del
cDNA.
Metodi
• La PCR standard è stata condotta amplificando circa
200 ng di cDNA ed utilizzando una coppia di primers
in grado di discriminare i due sottotipi di trascritto di
fusione.
• Su 5 campioni di cui 3 risultati negativi in PCR
standard è stata condotta un’analisi di Real-Time
PCR utilizzando il metodo del SYBR green con la
stessa coppia di primers usata in PCR standard.
Risultati
La tipizzazione dei pazienti per il trascritto di fusione
EWS/FLI1 ha fornito i seguenti risultati:
EWS/FLI1 tipo 1
36
EWS/FLI1 tipo 2
6
Di 5 pazienti analizzati
mediante q RT- PCR:
Nessun trascritto 7
• 3 confermati negativi
RNA degradato
4
• 2 positivi per EWS/FLI1
Totale
53
PCR standard
Lane A e D = trascritto
EWS/FLI1 tipo 1
Lane B e E = trascritto
EWS/FLI1 tipo 2
Lane C = nessun
trascritto
Lane F = marcatore
25bp
A
B
C
D
E
F
G
Lane G = marcatore
100bp
Vantaggi della Real-Time PCR
La rilevazione dei trascritti di fusione tramite metodica
di RT- PCR può essere utile come supporto alla diagnosi
degli EFT
• Accresce enormemente la sensibilità dell’analisi
minimizzando il rischio di falsi positivi.
• Non richiede ulteriori indagini post-PCR per la
visualizzazione dei risultati (elettroforesi su gel di
agarosio)
e
la
verifica
della
loro
identità
(sequenziamento).
Conclusioni
La caratterizzazione citogenetica dei tumori
appartenenti alla EFT integra i dati morfologici ed
immunofenotipici della diagnosi istopatologica, al
fine di una classificazione sempre più accurata,
della possibilità di identificare sottogruppi di
pazienti con prognosi diversa o riprese di malattia
altrimenti non ancora “detectable”.