Il monitoraggio biologico della popolazione generale nella
stima dell’esposizione ad inquinanti atmosferici
Prof. Patrizia Corsi
Gli studi di mutagenesi ambientale sono finalizzati in gran parte
all’ identificazione e quantificazione di agenti genotossici diffusi
nell’ ambiente e potenzialmente pericolosi per l’ uomo.
Gli approcci di biologia molecolare hanno aperte nuove frontiere e
potenzialità nel campo del biomonitoraggio ambientale e biologico
Modello per la validazione di
biomarker chemio-specifici
CANCEROGENO CHIMICO IN ANIMALI
SOSPETTO CANCEROGENO UMANO / LEGAME CON MALATTIA
IDENTIFICAZIONE E SVILUPPO DI METODOLOGIE PER
MISURARE BIOMARKERS CHEMIO-SPECIFICI
DETERMINAZIONE DELLA
RELAZIONE DEI
BIOMARKER TRA ESPOSIZIONE
E MALATTIA IN
ESPERIMENTI ANIMALI
STUDIO TRASVERSALE
SUI LIVELLI DI BIOMARKER
NEGLI UOMINI ESPOSTI
STUDIO LONGITUDINALE SUI
BIOMARKER NEGLI UOMINI
MARKER DI ESPOSIZIONE VALIDATO
RELAZIONE TRA BIOINDICATORI E
MALATTIA IN STUDI SU ANIMALI
STUDI CASO-CONTROLLO
STUDI A COORTE
TRIALS CLINICI
MARKER DI RISCHIO VALIDATO
MONITORAGGIO
AMBIENTALE
Misurazioni degli agenti mediante campionamenti ambientali allo
scopo di determinare il livello di esposizione per via inalatoria e
studiare l’efficacia delle misure di prevenzione adottate.
MONITORAGGIO
BIOLOGICO
Valutazione dell'esposizione ad agenti cancerogeni presenti
nell'ambiente attraverso la misura di indicatori selezionati in
campioni biologici prelevati negli esposti secondo precise
modalità.
L’indicatore può essere rappresentato dalla sostanza chimica tal
quale, da un suo metabolita, da una modifica biochimica di tipo
reversibile indotta dall'esposizione all'agente nocivo.
Il monitoraggio biologico di una popolazione esposta a potenziali agenti genotossici comprende lo studio di diversi
biomarcatori (di esposizione, di effetto e di suscettibilità), in riferimento ai vari momenti che intercorrono tra
l’esposizione e la manifestazione clinica della patologia (Modificata, da Rùdiger, 1999.)
Obiettivi specifici della
ricerca sui biomarkers
RIFLETTERE
SPECIFICHE
ESPOSIZIONI
Sviluppo e validazione dei biomarkers
PREDIRE IL RISCHIO DI
MALATTIA NEGLI INDIVIDUI
Decaprio AP Biomarkers: Coming of Age for Environmental Health and Risk Assessment
Environ Sci Tec 31 (7): 1837-1847, 1997
VALIDAZIONE DEI BIOMARKERS
Relazione dose-risposta
Interazione Gene-Ambiente
Variabilità inter e intra-individuale
Molteplici vie di assorbimento
Molteplicità degli addotti
Materiali biologici surrogati/organo bersaglio
Relazione temporale
Miscele complesse
Le principali vie di esposizione agli xenobiotici
-The ability of PAH-containing mixtures to induce human cancer has been known since 1775, when the British surgeon Sir Percival
Pott demonstrated a correlation between the exposure of chimney sweeps to soot and the incidence of scrotal cancer (Quoted in
Natl. Cancer Inst. Monogr. 1963,10:7).
-The main sources of human exposure to PAHs are occupation, passive and active smoking, food and water and air pollution
- There is a high variation in atmospheric PAHs levels across geographical areas with B(a)P concentrations ranging from 0.01 to
100ng/m3. The level of exposure to PAHs through this source is low compared to other sources such as diet, occupation or tobacco
smoke.
-The total intake of carcinogenic PAHs in the general population has been estimated to be 3µg/day (Mumtaz MM et al., 1996,
Toxicol Ind Health, 12:742-971)
-Levels of occupational exposure of B(a)P, one of the main PAH compounds, vary widely in different industrial activities and job titles,
ranging from 0.1 to 48 000 ng/m3.
-Such elevated exposure are associated with increased risks of lung, skin and bladder cancer (Mastrangelo et al., 1996, Environ.
Health Perspect. 104:1166-1170).
-In smokers, B(a)P levels range from 0,5 to 7,8 µg/100 cigarettes when exposure is from mainstream smoke and from 2,5 to 19,9
µg/100 cigarettes when it comes from side-stream smoke.
-Levels from passive smoking are lower, ranging from 0.0028 to 0,76 µg/m3 of B(a)P (IARC 1983, Monogr. Eval Carcinog. Risk
Chem. Hum. 32:1-453)
-Dietary intake of total PAHs has been estimated to be almost 2µg/Kg food (IARC 1983, Monogr. Eval Carcinog. Risk Chem. Hum.
32:1-453) with high levels of B(a)P found especially in charcoaled broiled- meat (8µg/kg) while in a variety of other food products
B(a)P levels from 0.09 to 30µg/kg have been reported (Scherer G et al., 2000, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 9:373-380)
La formazione del benzo [a] pirene-7,8-diidrodiolo-9,10-epossido (BPDE), il
principale metabolita cancerogeno del benzo [a] pirene, e iI suo addotto al DNA
Schema del metabolismo ossidativo del benzene
Le principali vie di eliminazione degli xenobiotici
La suscettibilità genetica condiziona la
risposta di soggetti egualmente
esposti
INDICATORI DI SUSCETTIBILITA’
CYP1A1
CITOCROMO P450 MONOSSIGENASI
Sito di restrizione MspI: sostituzione TC dà
origine al raro allele m2
Glutatione-S-transferasi
di
classe
µ:
catalizza la coniugazione del glutatione agli
epossidi degli IPA
GSTM1
GSTT1
La variante allele nullo determina la mancata
produzione dell’enzima attivo e ridotta
efficienza di metabolizzazione di diversi
substrati genotossici
Glutatione-S-transferasi di Classe θ:
responsabile della detossificazione di composti
alchilanti reattivi degli IPA
Xeroderma pigmentosum di Classe D:
XPD
Sito di restrizione 312: sostituzione AspAsn,
codifica per un enzima coinvolto nel
meccanismo del riparo del DNA. La mutazione
determina deficit dell’attività enzimatica
IL PROGRAMMA DI
MONITORAGGIO AMBIENTALE
E BIOLOGICO
Campionamento
personale
Indicatori di esposizione
indicatore di dose
biologicamente
efficace
Indicatori di
suscettibilità
OBIETTIVI
Valutare l’esposizione a sostanze tossiche attraverso
campagne di
Monitoraggio ambientale
Monitoraggio biologico
Validare i dati del monitoraggio biologico sulla base del
monitoraggio ambientale
Esposizione ad IPA e biomarkers di genotossicità in
popolazioni residenti a diversa distanza da un insediamento
siderurgico
ALBEROBELLO
LOCOROTONDO
STATTE
TARANTO- Tamburi
Lo stabilimento ILVA di Taranto, realizzato in fasi diverse tra il 1961 ed il
1975, è tra i più grandi complessi siderurgici di Europa, l’unico a ciclo
integrato, con oltre 10.000 occupati diretti. Il combustibile utilizzato è il
coke, prodotto a partire dal carbon fossile nelle tre batterie che
costituiscono la cokeria.
Materiali e Metodi
MONITORAGGIO AMBIENTALE IPA
Stazioni mobili : macchina caricatrice e sfornatrice
Campionamenti d’area : piano di carica, lato
sfornatrice, inversione termica
Campionamenti personali : operatore piano coperchi,
addetto bariletti, operatore porte, operatori macchine
(caricatrice, guida coke, sfornatrice), inversione
termica, attrezzista
MONITORAGGIO BIOLOGICO 1-IP
n. 105 LAVORATORI
n. 50; batteria 5-6: n. 55)
(batteria 3-4:
Raccolta di campioni di urina
(prima e dopo il turno)
Questionario sulle caratteristiche
individuali . (fumo, consumo di carne alla
,
brace assenza dal lavoro
)
Analisi statistiche: statistiche descrittive; t-tests per la valutazione delle differenze tra gruppi, dopo logtrasformazione dei dati; analisi di correlazione.
FASI DELLO STUDIO
FASE 1
Identificazione e arruolamento della popolazione.
Consenso informato.
Preparazione e codifica del questionario.
Predisposizione SOP
FASI DELLO STUDIO
FASE 2
Ottenimento del consenso informato
Somministrazione del questionario
Misura dei livelli ambientali
Raccolta e analisi dei campioni biologici
FASE 1: QUESTIONARIO
IPA AERODISPERSI
Gli IPA aerodispersi e adesi al particolato presenti nella frazione inalabile
vengono misurati con campionatore attivo indossato in zona respiratoria
durante il giorno, per una durata media di 6 ore, secondo il metodo NIOSH
5506.
Fra i 15 idrocarburi i composti non cancerogeni sono: (acenaftene, fluorene,
fluorantene, pirene, antracene, fenantrene, crisene, benzo(g,h,i)terilene;
quelli definiti cancerogeni dalla IARC: naftalene, benzo(a)antracene,
benzo(a)pirene, dibenzo(a,h)antracene, benzo(k)fluorantene, indeno(1,2,3cd)pirene.
BENZENE AERODISPERSO
Il campionamento viene effettuato tramite RADIELLO.
L'analisi viene effettuata per desorbimento chimico seguito da GC-MS
Le operazioni di monitoraggio
Inizio attività – ore 8:00: consenso informato
prelievo ematico (20 ml)
campione di urina  aliquotazione per IPA urinari
posizionamento pompa
Fine attività – ore 14:30 rimozione pompa
questionario
FASE 1 - SOP: Procedure Operative
Standardizzate
Indicatore biologico di esposizione: IPA
1-idrossipirene urinario
L’1-idrossipirene urinario (1-IP) è un metabolita del pirene.
Viene misurato secondo il metodo descritto da Jongeneelen (1987), dopo
idrolisi enzimatica dei ß-glucuronati e/o solfati coniugati, seguita da
analisi HPLC con rivelatore fluorimetrico: i risultati sono corretti per il
valore della corrispondente creatinina urinaria e sono espressi come
microMol/Molcreat.
Indicatore biologico di esposizione: Benzene
Benzene urinario
Il benzene urinario viene determinato mediante microestrazione in fase
solida effettuata nello spazio di testa del campione, seguita da analisi
gascromatografica con rivelazione di massa (GC/MS).
Indicatore di dose biologicamente efficace: IPA
Gli addotti totali IPA-DNA
Il DNA viene isolato dai linfomonociti di sangue periferico secondo la
metodica del kit Extragen (Extragen BC by Talent).
La determinazione degli addotti viene effettuata attraverso la
multidirectional thin-layer chromatography (TLC), utilizzando substrati di
polietilammnina-cellulosa (Gupta et al., 1982; Izzotti, 1998), dopo
postmarcatura con 32P.
Indicatore di effetto biologico precoce: BENZENE
Conta leucocitaria
Viene eseguito su campione ematico l’esame emocromocitometrico e
la conta leucocitaria e piastrinica
12cm
D1
1,5cm
D3-D4
D2
8,5cm
10cm
POLIMORFISMI GENETICI
Esiste una grande variabilità interindividuale nel grado di metabolizzare gli xenobiotici.
Questa variabilità può essere causata sia da fattori genetici che ambientali.
I fattori ambientali che maggiormente influenzano il metabolismo di sostanze tossiche e di
cancerogeni sono: la dieta, il fumo, l’ingestione di alcohol, l’assunzione di farmaci , l’uso di rimedi a
base di erbe, l’esposizione a contaminanti ambientali e stati di malattia. Basandosi su queste
considerazioni si comprende come sia necessario valutare la capacità individuale nel metabolizzare e
detossificare gli xenobiotici mediante lo studio del fenotipo e del genotipo.
DNA addotti in cellule uroteliali esfoliate e esposizione a fumo passivo
Mogli di fumatori
Mogli di non fumatori
Media 1-HOP: 0.27 0.06
Media 1-HOP: 0.19 0.02
p=0.17
DNA addotti (n./108): 2.8  0.8
DNA addotti (n./108): 1.1  0.4
p<0.05
r (DNA-Addotti vs. 1-HOP)= 0.3
FASI DELLO STUDIO
FASE 3
inserimenti dati su supporto informatico
controlli logico-formali sui database
elaborazione dati ed analisi statistica
IPA_tot
4,000
6,000
IPA totali
(Mediana + Range Interquartile)
2,000
2985 ng/m3
0
1995 ng/m3
Alberobello
Taranto
T-test per variabile log-trasformata p=0.415
benzamb
4
6
Benzene ambientale
(Mediana + Range Interquartile)
1.81 microg/m3
0
2
2.22 microg/m3
Alberobello
Taranto
T-test per variabile log-trasformata p=0.697
Profilo delle medie degli IPA aerodispersi
Il naftalene rappresenta il componente principale della miscela (70% a Tamburi e 55%
ad Alberobello), seguito dal fluorantene a Tamburi e dall’acenaftene ad Alberobello; il
benzo(a)pirene è presente in una quota pari allo 0,3% nella miscela ad Alberobello e
allo 0,2% a Tamburi
2500
Media Alberobello
Media Tamburi
2000
1500
1000
500
(1
,2
,3
,
O
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IN
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AF
T
N
E
0
Caratteristiche delle popolazioni in studio
Gruppi
Età (media
N. Sesso
± ds)
Alberobello 15
Tamburi
18
3M
12 F
3M
15 F
42 ±12
42 ±12
N.
Fumatori
(%)
Livello di
istruzione
5 (28%)
Lic. Elem.
Media Inf.
Media Sup
Laurea
11%
28%
55%
6%
4 (27%)
Lic. Elem. 20%
Media Inf. 20%
Media Sup 40%
Laurea
20%
Mediane di 1-IP
Tutti
Fumatori
Non
fumatori
Alberobello
0.32
0.31
0.32
Tamburi
0.26
0.22
0.28
Tutti
0.27
0.25
0.29
t-test
p=0.825
p=0.254
Mediane di Benzene Urinario
Tutti
Fumatori
Non
fumatori
Alberobello
79
256
57
Tamburi
51
53
49
Tutti
134
342
79
t-test
p=0.697
p=0.049
Mediane di addotti IPA-DNA
Tutti
Fumatori
Non
fumatori
Alberobello
0.89
1.59
0.89
Tamburi
0.75
0.54
0.78
Tutti
0.78
0.62
0.79
t-test
p=0.719
p=0.736
Distribuzione dei polimorfismi nelle popolazioni in studio
%GSTM1 %GSTT1 %CYP1A1 % XPD
null
null
mutato
mutato
Alberobello
73
13
0
50
Tamburi
33
11
33
39
Tutti
51
12
18
44
Livelli mediani di addotti, stratificati per polimorfismi metabolici
(n. addotti/108 nucleotidi)
Polimorfismi
Addotti
Wild type
GSTM1
GSTT1
CYP1A1 MspI
XPD - 312
0.84
Null
0.72
Wild type
0.79
Null
0.72
Wild type
0.72
Mutato
1.14
Wild type
0.84
Mutato
t-Test
0.75
P=0.278
P=0.959
P=0.365
P=0.661