ISTRUZIONI PER L’USO
PakPlus® test
REF
PAKPLUS
IVD
INDICE
USO ............................................................................................................................................................................... 2
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE ..................................................................................................................................... 2
PRINCIPIO ..................................................................................................................................................................... 2
REAGENTI ..................................................................................................................................................................... 2
AVVERTENZE ............................................................................................................................................................... 3
PRECAUZIONI .............................................................................................................................................................. 3
RACCOLTA CAMPIONI ................................................................................................................................................ 3
PROCEDURA ................................................................................................................................................................ 3
Materiali Forniti ......................................................................................................................................................... 3
Ulteriori Materiali Richiesti ........................................................................................................................................ 3
Metodica ................................................................................................................................................................... 4
CONTROLLO DI QUALITA' .......................................................................................................................................... 6
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI ........................................................................................................................... 6
LIMITAZIONI .................................................................................................................................................................. 7
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DEL TEST ............................................................................................................. 7
REFERENZE ................................................................................................................................................................. 9
SIGNIFICATO DEI SIMBOLI ....................................................................................................................................... 11
PakPlus test
1
303469.IFUIT REV F
USO
PakPlus test é un (ELISA) in fase solida destinato alla ricerca di anticorpi reattivi verso gli antigeni HLA di classe I e della glicoproteina
(GP) IV , così come verso gli epitopi polimorfici delle glicoproteine piastriniche IIb/IIIa, Ib/IX e Ia/IIa.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE
1-5
L'esistenza di antigeni piastrino specifici sulle glicoproteine piastriniche é stata ampiamente descritta da vari ricercatori. Anticorpi
piastrino-specifici o verso antigeni HLA di classe I presenti in seguito a gravidanza o trasfusione può provocare l'immuno distruzione
6-18
delle piastrine trasfuse.
Confermare la presenza di questi anticorpi nel campione di pazienti può essere di aiuto nella ricerca del di
prodotti compatibili.
Il kit ELISA in fase solida PakPlus è costituito da glicoproteine IIb/IIIa e Ia/IIa immobilizzate ai pozzetti mediante anticorpo monoclonale
e Ia/IIa ottenute da piastrine tipizzate di donatori di gruppo O. Gli antigeni HLA di classe I e le glicoproteine Ib/IX e IV sono fornite come
glicoproteine purificate per affinità. Il test ha lo scopo di determinare e discriminare gli anticorpi anti HLA di classe I e gli anticorpi
piastrino-specifici. La configurazione dei pozzetti é descritta sulla Recording Sheet.
PRINCIPIO
Il siero del paziente viene aggiunto a microstrip rivestite con glicoproteine piastriniche e HLA per permette agli anticorpi di legarsi, se
presenti. Anticorpi non legati vengono lavati. Si dispensa l’antiglobulina umana coniugata con fosfatasi alcalina (Anti-IgG/A/M) ad ogni
pozzetto e lascia in incubazione. Il coniugato Anti-IgG/A/M non legato viene lavato, si dispensa, infine, il substrato PNPP (p-nitrofenil
fosfato). Dopo una incubazione di 30 minuti, si blocca la reazione con la “Stopping Solution”. La densità ottica della colorazione
sviluppata è misurata mediante uno spettrofotometro.
REAGENTI
Numero massimo di test per kit:

PAKPLUS: 5 test per kit
Tutti i reagenti devono essere conservati come indicato sull’etichetta.
REF
MS
TCW
SD
SB
ESS
AH
PN
PC
NC
404553
Micropozzetti in strip: pozzetti a fondo piatto su cui sono state immobilizzate glicoproteine piastriniche e HLA. Le
strip sono chiuse in busta risigillabile. Pronte all’uso.
403622
Soluzione di lavaggio concentrata (10X): Tampone Tris (idrossimetil) aminometano contenente cloruro di sodio
e Tween 20. 1% sodio azide. Diluire con acqua deionizzata o distillata prima dell’uso. Conservare la soluzione
di lavaggio a temperatura ambiente fino a 48 ore o fino a 7 giorni a 2 – 8°C.
403831
Diluente del campione: Soluzione salina tamponata con fosfato contenente albumina bovina e siero di topo.
0.1% sodio azide. Pronto all’uso.
403613
Tampone per substrato: contiene dietanolamina e cloruro di magnesio. 0.02% sodio azide. Pronto all’uso.
Proteggere dalla luce.
403603
Soluzione di stop: Pronta all’uso.
404589
Anti-Human IgG/A/M Coniugato: antiglobulina umana (IgG/A/M) di capra coniugata con fosfatasi alcalina.
Contiene 0.1% sodio azide. Diluire con il diluente del campione prima dell’uso.
403594
Substrato PNPP: (p-nitrofenil fosfato) in polvere. Ricostituire con acqua deionizzata o distillata e diluire nel
tampone del substrato prima dell’uso. Proteggere dalla luce.
404601
Siero di controllo Positivo: siero umano contenente 0.1% sodio azide. Diluire nel Diluente del campione prima
dell’uso.
404577
Siero di controllo Negativo: siero umano contenente 0.1% sodio azide. Diluire nel Diluente del campione prima
dell’uso.
PakPlus test
2
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PS
503019
Copri piastra.
AVVERTENZE









Non usare i reagenti se torbidi o contaminati.
Usare con cautela per evitare la contaminazione del Diluente del campione e del Coniugato. L’eventuale contaminazione di questi
reagenti con siero umano neutralizza il Coniugato e porta al fallimento del test.
Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.
Strip e reagenti contenuti nel kit non devono essere usati insieme a componenti di altri kit.
La sostituzione dei componenti del kit con componenti di altri kit può portare al fallimento del test.
Gettare le porzioni non utilizzate di Coniugato, dei controlli diluiti e di PNPP ricostituito e diluito alla fine di ogni test.
Se viene utilizzato un incubatore a secco, il numero di aperture e chiusure dello sportello deve essere limitata per evitare la
variazione della temperatura interna dell’incubatore stesso.
Per preparare le diluizioni, seguire le istruzioni specifiche per il tipo di pipetta riguardo alle tecniche di dispensazione e lavaggio.
L’incubazione finale con il substrato enzimatico è sensibile alla temperatura, dovrebbe essere eseguita in un area a 22 – 25°C.
PRECAUZIONI



Il siero umano usato per i controlli Positivo e Negativo è stato testato con metodi approvati FDA e riscontrato negativo per anticorpi
anti HIV, HCV e HBsAg. Nessun metodo può, comunque, offrire una assoluta sicurezza dell’assenza di virus HIV, epatite C e
epatite B o altri agenti infettivi. Quindi, tali materiali dovrebbero essere maneggiati come potenzialmente infettivi.
Alcune reagenti forniti con i kit contengono sodio azide come conservante.
ATTENZIONE: la sodio azide reagisce con piombo e rame formando derivati esplosivi. Quando gettato nel lavandino sciacquare
con molta acqua per evitare accumuli. La sodio azide è velenosa e tossica se ingerita.
Eliminare tutte le componenti del kit seguendo le normative e leggi locali sullo smaltimento.
RACCOLTA CAMPIONI
Il sangue dovrebbe essere raccolto senza anticoagulante (siero), in sterilità e dovrebbe essere testato fresco per minimizzare il rischio
di possibili reazioni falsamente positive o negative causate da conservazioni improprie o contaminazione. Il siero che non può essere
testato immediatamente può essere conservato a 2 – 8°C per non più di 48 ore o congelati. Campioni congelati a –80°C o oltre
rimangono in buone condizioni per anni (2-3 anni). Comunque per evitare gli effetti del deterioramento per effetto di congelamenti e
scongelamenti ripetuti, si raccomanda di aliquotare i campioni prima del congelamento. Evitare l’uso di freezer frost-free
La presenza nel campione di particelle o aggregati può causare risultati falso positivi o scarsamente ripetibili. Centrifugare i campioni
contenenti particelle prima dell’esecuzione del test.
PROCEDURA
Materiali Forniti
I flaconi possono contenere più reagente di quanto descritto sull'etichetta. Quando si preparano le diluizioni misurare i reagenti con
pipette appropriate.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
6 - 2 x 8 Microstrip
1 x 50 ml Soluzione concentrata (10X)
1 x 14 ml Diluente campioni
1 x 14 ml Tampone substrato
1 x 14 ml Soluzione di stop
1 x 80 µl Anti-IgG/A/M umano coniugato
3 x 50 mg Substrato PNPP
1 x 0.3 ml Siero Controllo Positivo
1 x 0.7 ml Siero Controllo Negativo
6 Copri piastre
Ulteriori Materiali Richiesti
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Provette in polipropilene per campioni, diluizioni dei controlli e diluizioni dei reagenti
Pipette
Micropipette graduate per dispensare 10 – 100 µl e 100 – 1,000 µl e pipette monouso
Timer
Lettore per micropiastre per la lettura delle DO a 405 o 410 e 490 nm
Acqua deionizzata o distillata
Carta assorbente
PakPlus assay
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8. Lavatore per micropiastre
9. Centrifuga per la separazione del siero nei campioni dei pazienti
10. Bagnomaria o incubatore a secco
o
o

Range di temperatura 37 C + 1 C
11. Recording Sheet specifico per lotto, disponibile on line sul sito www.immucor.com
12. Spugne da laboratorio pre-inumidite
Metodica
1.
Portare i reagenti a temperatura ambiente.
2.
Preparare la soluzione di lavaggio. Diluire 1 volume di soluzione concentrata in 9 volumi di acqua deionizzata o distillata.
Miscelare bene.
3.
Calcolare il numero di pazienti da testare. Usando il Recording Sheet assegnare la posizione di ogni campione testato in doppio.
Registrare l'identificativo di ogni campione sul Recording Sheet.
Preparare Campioni e Controlli
4.
Diluire campioni e controlli in Specimen Diluent come mostrato nella tabella. Miscelare bene:
Volume Diluente Campione (SD)
5.
Volume Campione
PC
150 µl
50 µl
NC
600 µl
200 µl
Campione Paziente
600 µl
200 µl
Rimuovere gli strip necessari dalla busta. Rimuovere velocemente e risigillare nella busta gli strip inutilizzati.
NOTA: Con ogni kit viene fornito un solo supporto. Non gettarlo fino alla fine dell'utilizzo degli strip.
NOTA: Orientare il supporto in modo tale che il pozzetto A1 sia posizionato in alto in corrispondenza dell'angolo sinistro. Assicurarsi
che tutti gli strip siano correttamente inseriti nel supporto. Etichettare o numerare ogni strip per evitare errori. Mantenere il
supporto nello stesso orientamento durante l'esecuzione del test.
6.
Aggiungere 300 µL di soluzione di lavaggio ai pozzetti e lasciarli a temperatura ambiente per 5-10 minuti.
7.
Aspirare o decantare con forza e asciugare bene gli strip invertendo su carta assorbente per evitare che si secchino.
8.
Dispensare 50 µL dei controlli o dei campioni nei pozzetti corrispondenti come registrato sul Recording Sheet. Eliminare qualsiasi
bolla presente nei pozzetti fare attenzione ad evitare trascinamento di reagenti.
NOTA: Non dispensare campioni o reagenti nei pozzetti del bianco.
NOTA: Se si testano più campioni in una sola seduta preparare un solo set di controlli. IDENTIFICARE GLI STRIP PER EVITARE DI
COMMETTERE ERRORI.
9.
Coprire la piastra ed incubare:

30 minuti in un bagnetto termostatato a 37°C , o
o

40 minuti in un incubatore a secco a 37 C
10. Diluire il Coniugato 1 a 100 con il diluente campioni seguendo le indicazioni nella tabella di seguito. Usare un contenitore di
polipropilene.
# Strips
Volume Coniugato (AH)
Volume Diluente Campione (SD)
2–2x8
20 µl
2.0 ml
6–2x8
60 µl
6.0 ml
NOTA: Il coniugato è viscoso. Aspirare 2-3 volte con la pipetta prima di dispensare e sciacquare bene il puntale nel diluente.
Miscelare bene.
PakPlus assay
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11.
LAVAGGIO
a)
b)
c)
d)
e)
Aspirare o decantare il contenuto di ogni pozzetto e asciugare bene su carta assorbente.
Aggiungere 300 µl di soluzione di lavaggio.
Aspirare o decantare.
Ripetere i punti b + c per un totale di 4 lavaggi.
Decantare energicamente per rimuovere ogni residuo di soluzione di lavaggio. Invertire su carta assorbente ed asciugare
bene.
12. Dispensare 50 µl di coniugato diluito (come preparato al punto 10) in tutti i pozzetti tranne quelli destinati al BIANCO. Eliminare la
bolle dai pozzetti.
13. Coprire gli strip ed incubare:

30 minuti in un bagnetto termostatato a 37°C , o
o

40 minuti in un incubatore a secco a 37 C
14. Sciogliere il PNPP in polvere aggiungendo nel flacone 0.5 ml di acqua deionizzata o distillata. Chiudere e miscelare bene.
Proteggere dalla luce fino all'uso.
15. Diluire il PNPP sciolto 1 a 100 in tampone Substrato così come indicato nella tabella sottostante.
# Strips
Volume substrato PPNP (PN)
Volume Tampone (SB)
2–2x8
40 µl
4.0 ml
6–2x8
120 µl
12.0 ml
Miscelare bene. Proteggere dalla luce fino all'uso.
NOTA:
Evitare la contaminazione del substrato con coniugato preparato negli step precedenti.
16. LAVAGGIO
a) Aspirare o decantare il contenuto di ogni pozzetto e asciugare bene su carta assorbente.
b) Aggiungere 300 µl di soluzione di lavaggio.
c) Aspirare o decantare.
d) Ripetere i punti b + c per un totale di 4 lavaggi.
e) Decantare energicamente per rimuovere ogni residuo di soluzione di lavaggio. Invertire su carta assorbente ed asciugare
bene.
17. Rimuovere le bolle dai pozzetti. Pulire il fondo dei pozzetti con una spugna umida.
Passare velocemente ai tre step successivi.
18. Dispensare 100µl di PNPP diluito a tutti i pozzetti ad eccezione dei pozzetti destinati al BIANCO.
19. Incubare gli strip per 30 minuti a TEMPERATURA AMBIENTE (22 – 25°C) al buio.
NOTA: Tempi e temperatura di questa incubazione, dopo aggiunta di PPNP, sono critici. NON variare i tempi e le temperature
stabilite. Fare partire il tempo di incubazione nel momento della dispensazione del PNPP nel primo pozzetto.
20. Bloccare la reazione dispensando 100 µl di soluzione di stop ad ogni pozzetto nella stessa sequenza in cui si è aggiunto il
substrato. Dispensare 200 µl di soluzione di stop ai pozzetti del bianco.
21. Leggere le assorbanze (DO) di ogni pozzetto a 405 o 410 nm usando un filtro di riferimento a 490 nm. Se i risultati non possono
essere letti immediatamente, riportare gli strip al buio per 30 minuti al massimo.
22. Sottrarre i valori del bianco ad ogni valore dei campioni e dei controlli. Molti lettori ELISA sono programmati per sottrarli
automaticamente.
23. Registrare i risultati sul Recording Sheet lotto specifico.
NOTA: Il fenotipo GPIIb/IIIa (fila A e B) dei donatori potrebbe cambiare tra i diversi lotti, come si può evidenziare dal Recording Sheet
lotto specifico.
PakPlus assay
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CONTROLLO DI QUALITA'
Il controllo di qualità PakPlus è incluso in ogni kit mediante la valutazione del risultato dei sieri di controllo negativo e positivo. La
valutazione di questi controlli dovrebbe essere inclusa in ogni seduta per aiutare a determinare eventuali errori tecnici o non adeguata
reattività dei reagenti.
Criteri di validazione dei test:
Controllo negativo (pozzetti IIb/IIIa)
Media DO  0.175
Controllo negativo (tutti i pozzetti)
Entro + 35% della DO media per
ciascuna riga
Controllo positivo (HLA)
DO media > 1.000
Le letture delle DO ottenute dai duplicati dei risultati positivi (per entrambi i campioni e il controllo positivo) devono ricadere in un
intervallo del 20% dalla media dei due valori. I campioni i cui risultati ricadono al di fuori di questo range dovrebbero venire testati di
nuovo. Se il controllo positivo ha risultati al di fuori di questo limite, deve essere considerato invalido e il test ripetuto.
Anche le letture delle DO per i duplicati dei risultati negativi non devono ricadere in un intervallo del 20% della media dei due valori.
Inoltre, la DO non dovrebbe essere al di fuori del limite stabilito per ciascun antigene. Risultati di questo genere dovrebbero venire
considerati non validi e i campioni dovrebbero essere ri-testati. I duplicati delle DO dei risultati negativi devono ricadere in un range
del 35% della DO media dei due valori. Letture con una variazione superiore al 35% rispetto alla DO media deve essere considerata
invalida e i test devono venire ripetuti.
NOTA: La non riproducibilità può essere causata da omissione dei reagenti o dei campioni, aggiunta inadeguata dei reagenti,
temperatura di incubazione inadeguata, esposizione alla luce durante l'incubazione finale, omissione nella pulitura del fondo
dei pozzetti prima della lettura, o cross contaminazione dei pozzetti. Se non vengono eseguiti i test in doppio si potrebbe
rischiare di accettare risultati on corretti.
NOTA: Il siero di controllo positivo contiene anticorpi verso antigeni HLA di classe I. Questo controllo riguarda sia i reagenti, che
l’esecuzione tecnica, che la performance dell’operatore. Il controllo non è destinato alla verifica di nessuna specifica
reazione antigene-anticorpo.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Determinare il Cutoff per ciascun antigene (in ogni fila) come segue:
1.
Calcolare la DO media dei duplicati del controllo negativo per ciascun antigene (in ogni fila).
2.
Moltiplicare tale valore per il Cutoff Multiplier (indicato sul Recording Sheet), e registrare questo valore nella cella
appropriata nella colonna del Cutoff.
Per ciascun campione, determinare i risultati di ciascun antigene (fila) seguendo gli step indicati:
1.
Calcolare la DO media per ciascun paio di risultati.
2.
Confrontare la DO media con il cutoff del controllo negativo di quella fila. Ci sono 2 possibili risultati di reattività per ciascun
antigene (fila): Negativo o Positivo, che vengono determinati come segue:
3.
a.
Se la DO media è < al cutoff il Risultato è Negativo.
b.
Se la DO media > del cutoff il Risultato è Positivo.
Determinare il risultato finale per ciascuna glicoproteina come segue:
a.
Risultato non interpretabile per un campione: un campione che è positivo per le file A – D ed E, o F, o entrambe è
considerato Non Interpretabile per GPIIb/IIIa, GPIa/IIa, GPIb/IX, e GPIV. Una reattività così estesa non corrisponde
ad una specificità per allo-anticorpi e potrebbe indicare la presenza di autoanticorpi, di legame non specifico o
potrebbe essere dovuta ad altre cause.
Questo non si applica all’HLA di Classe I.
PakPlus test
b.
Per GPIb/IX, GPIV, e HLA di Classe I (Fila E, F, G), il risultato finale coincide con il risultato per quell’antigene (fila).
c.
Per GPIIb/IIIa:
6
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 Se A e B sono entrambe Negative, il risultato per GPIIb/IIIa è Negativo.
 Se A o B sono Positive e l’altro allele (fila) è Negativo, il risultato per GPIIb/IIIa è Positivo.
 Se sia A che B sono Positive, il risultato per GPIIb/IIIa è Positivo.
d.
Per GPIa/IIa, fare riferimento alla tavola di cui sotto.
Interpretazione per GPIa/IIa (File C e D)
Fila C Risultato
Fila D Risultato
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Interpretazione
Negativo per anticorpi verso GP Ia/IIa
Positivo per anticorpi verso GP Ia/IIa
**
Positivo o Non interpretabile per anticorpi verso
GPIa/IIa. Vedere sotto **
Per risultati in cui sia C che D sono Positive, dividere il maggior valore di DO per il minore valore di DO. Un
rapporto > 3.0 dovrebbe essere interpretato come Positivo per un alloanticorpo verso GPIa/IIa. I campioni in cui il
rapporto è < 3.0 dovrebbero essere considerati Non interpretabili per GPIa/IIa.
LIMITAZIONI







Risultati errati si possono riscontrare a causa di contaminazione batterica dei componenti del kit, incubazione inadeguata, lavaggi
inadeguati, esposizione alla luce del substrato, omissione dei reagenti, esposizione a temperature più elevate o inferiori a quelle
indicate, o omissione di step di lavoro.
Questo test è destinato ad essere un test di screening. I risultati non dovrebbero essere usati come unica base per una decisione
19-21
clinica.
19-21
Alcuni anticorpi a basso titolo o bassa avidità potrebbero non essere determinati da questo test.
Anticorpi verso antigeni piastrinici non indicati sul foglio di lavoro potrebbero non venire evidenziati.
La presenza di altre varianti polimorfiche di HPA presenti sulla glicoproteina GPIIb-IIIa (HPA-6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 16, 17, 19, 20,
21), GPIb/IX (HPA-12) e GPIa-IIa (HPA-13, 18) non sono stati verificati come antigeni evidenziabili nei pozzetti di PakPlus. E’ da
tenere presente che anticorpi reattivi verso questi antigeni potrebbero comunque venire evidenziati dal test.
Anticorpi anti-HLA di classe I a bassa frequenza potrebbero non venire evidenziati da questo kit.
PakPlus non è stato validato per lo studio di autoanticorpi anti piastrine.
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DEL TEST
Precisione
La precisione intra test è stata determinata seguendo il CLSI EP12-A2, User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance;
Approved Guideline. Un set di 5 campioni di siero è stato testato in duplicato in 20 test separati. Ciascuno dei 5 campioni conteneva
un anticorpo verso una delle 5 glicoproteine studiate con PakPlus: GPIIb/IIIa, GPIa/IIa, GPIb/IX, GPIV, e HLA di Classe I. Si è
osservata una sovrapposizione qualitativa del 100% nei 20 test per tutti i campioni testati. La variazione totale di DO osservata è
stata fra 4,4%CV (1.139 DO media) e 14,9 (0.064 DO media), a seconda dell’antigene e del range di DO del campione.
Riproducibilità
Gli studi di riproducibilità sono stati eseguiti come studi multi centrici, in tre diversi laboratori: Immucor GTI Diagnostics, Inc., Blood
Center del Wisconsin (Milwaukee, Wisconsin), e Puget Sound Blood Center (Seattle, Washington). In ciascun laboratorio, due
operatori hanno testato un pannello di cinque (5) campioni con PakPlus per verificare la variabilità tra diverse sedute. Ciascun
campione è reattivo verso un singolo antigene e negativo per gli altri. Ognuno di questi campioni è stato testato in 20 sedute separate
da 6 operatori (2 per ogni laboratorio). Nella tabella è riportato il riassunto dei risultati dei 5 campioni testati in 20 sedute da 6
operatori.
Pak Plus Riproducibilità intra-operatore
Campione
Anticorpo atteso
Risultati
nr
Positivi (di 120)
1
GPIIb/IIIa (HPA-1a)
120
2
HLA
120
3
GPIV
120
4
GPIb/IX
119
5
GPIa-IIa (HPA-5b)
120
% concordanza
sui positivi
100%
100%
100%
99.2%
100%
Risultati Negativi
(di 480)
480
480
480
480
479*
% concordanza
sui negativi
100%
100%
100%
100%
99.8%
*Per il campione 5 si è ottenuto un singolo risultato positive per HLA di Classe I
PakPlus test
7
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Il range di DO osservate su tutti i campioni (CV totale), considerando tutti gli operatori, ha mostrato una variazione dal 7,4% (DO
media = 1,379) al 26,6% (DO media = 0,048) in corrispondenza del singolo campione, antigene e valore di DO.
Variabilità intra lotto
La variabilità tra lotti di PakPlus è stata verificata mettendo a confronto i risultati di un set di 5 campioni di siero, ciascuno contenente
un anticorpo verso una delle 5 glicoproteine studiate con PakPlus: GPIIb/IIIa, GPIa/IIa, GPIb/IX, GPIV, and HLA Class I. Ciascun
campione è stato testato con 3 diversi lotti di PakPlus. Si è osservata una concordanza del 100% tra i risultati qualitativi dei campioni
testati utilizzando i tre lotti. Il range di DO osservate ha mostrato una variazione dal 1,4% (DO media = 0,827) al 20,5% (DO media =
0,067) in corrispondenza del singolo campione e antigene.
Confronto tra metodi
Le performance di PakPlus per la ricerca di anticorpi reattivi verso GPIIb/IIIa, GPIb/IX, GPIV, o GPIa/IIa è stata confrontata con il
metodo di immobilizzazione di antigeni piastrinici con anticorpi monoclonali (MAIPA) e con il test Lifecodes QuikScreen per i risultati
relativi agli anticorpi verso antigeni HLA di classe I. Sono stati eseguiti tre studi clinici. Due di questi come studi esterni presso The
Blood Center of Wisconsin (Milwaukee, Wisconsin) e Puget Sound Blood Center (Seattle, Washington); i test MAIPA sono stati
eseguiti presso Australian Red Cross Kelvin Grove (Queensland, Australia). Il terzo come studio interno, presso Immucor GTI
Diagnostics utilizzando campioni provenienti da Sanquin Diagnostic Services (Amsterdam, The Netherlands) e da Immucor GTI
Diagnostic. I dati provenienti da tutti gli studi sono poi stati raccolti per l’analisi. Le tabelle sottostanti mostrano la percentuale di
concordanza tra i positivi (sensibilità), i negativi (specificità) e la concordanza complessiva. L’intervallo di confidenza (CI) del 95%
intorno a questi valori è indicato in parentesi.
Confronto tra metodi: PakPlus vs. QuikScreen per la ricerca di anticorpi verso antigeni HLA di Classe I
Lifecodes QuikScreen
Positivi
Negativi
Positivi
235
12
Negativi
44
431
Totale
279
443
PakPlus
Totale
247
475
722
% di concordanza complessiva:
% di concordanza sui positivi:
% di concordanza sui negativi:
92.2%
84.2%
97.3%
(90.0 – 94.1%)
(79.4 – 88.3%)
(95.3 – 98.6%)
Tre campioni sono stati esclusi dallo studio perchè avevano un risultato non interpretabile o invalido con QuikScreen.
I campioni con risultati discordanti tra PakPlus e QuikScreen sono stati studiati ulteriormente con un test su Luminex (Lifematch LMX)
per la ricerca di anticorpi verso antigeni HLA di classe I. Dei 12 PakPlus positivi – QuikScreen negativi, tutti si sono confermati
negativi con LMX. Dei 44 PakPlus negativi – QuikScreen positivi, 14 erano negativi con LMX.
Confronto tra metodi: Ricerca di anticorpi verso GPIIb/IIIa, GPIa/IIa, GPIb/IX, o GPIV
I test sono stati eseguiti in due modi. La tabella sottostante mostra tutti i risultati di PakPlus vs MAIPA per ciascun anticorpo rilevato
nel test. Le tabelle successive mostrano il confronto per ciascuna glicoproteina presente nel kit PakPlus. In entrambi i casi i campioni
con un risultato non interpretabile con MAIPA (per allospecificità non determinabile o reattività diffusa verso molteplici epitopi) sono
stati esclusi dal test. Per questi campioni non è stata valutata la performance di PakPlus.
Analisi sul totale degli anticorpi verso qualsiasi antigene HPA
MAIPA
Positivi
PakPlus
Negativi
Totale
Positivi
118
39
157
% di concordanza complessiva:
91.2%
(88.3 – 93.5%)
Negativi
4
325
329
% di concordanza sui positivi:
96.7%
(91.8 – 99.1%)
122
364
486
% di concordanza sui negativi:
89.3%
(85.6 – 92.3%)
Totale
17 campioni sono stati esclusi dalle analisi perché il risultato del MAIPA era non interpretabile. 9 campioni sono stati esclusi perché il
risultato di PakPlus non era interpretabile (pan-reattività). Questi campioni sono stati esclusi da qualsiasi ulteriore analisi comparativa
tra PakPlus e MAIPA.
I test relativi alla GPIV sono stati eseguiti solo in un laboratorio, così come descritto nella sezione specifica.
Analisi sugli anticorpi verso GPIIb/IIIa
MAIPA
PakPlus
Positivi
Negativi
Totale
75
28
103
% di concordanza complessiva:
Negativi
0
391
391
% di concordanza sui positivi:
100%
(95.2 – 100%)
Totale
75
419
494
% di concordanza sui negativi:
93.3%
(90.5 – 95.5%)
Positivi
PakPlus test
8
94.3%
(91.1 – 96.2%)
303469.IFUIT REV F
Analisi sugli anticorpi verso GPIa/IIa
MAIPA
PakPlus
Positivi
Negativi
Totale
Positivi
41
12
53
% di concordanza complessiva:
96.6%
(94.5 – 98.0%)
Negativi
4
411
415
% di concordanza sui positivi:
91.1%
(78.8 – 97.5%)
Totale
45
423
468
% di concordanza sui negativi:
97.2%
(95.1 – 98.5%)
24 campioni sono risultati non interpretabili con PakPlus a causa di risultato positivo su entrambi i pozzetti con GPIa/IIa (C e D) e
rapporto tra le DO medie <3,0 (vedere il paragrafo “Interpretazione dei risultati”). Questi campioni sono stati esclusi dal confronto. Si
trattava di campioni negativi al MAIPA.
Analisi sugli anticorpi verso GPIb/IX
MAIPA
PakPlus
Positivi
Negativi
Totale
Positivi
5
20
25
% di concordanza complessiva:
95.5%
(93.3 – 97.2%)
Negativi
2
464
466
% di concordanza sui positivi:
71.4%
(29.0 – 96.3%)
Totale
7
484
491
% di concordanza sui negativi:
95.9%
(93.7 – 97.5%)
Analisi sugli anticorpi verso GPIV
Le performance di PakPlus nella ricerca di anticorpi verso GPIV è stata confrontata con MAIPA solo in uno studio, quello
eseguito presso The Blood Center of Wisconsin (Milwaukee, Wisconsin).
MAIPA
Positivi
PakPlus
Negativi
Totale
Positivi
3
2
5
% di concordanza complessiva:
98.0%
(94.3 – 99.6%)
Negativi
1
146
147
% di concordanza sui positivi:
75.0%
(19.4 – 99.4%)
Totale
4
148
152
% di concordanza sui negativi:
98.6%
(95.2 – 99.8%)
Sostanze interferenti
Gli studi su sostanze interferenti sono stati eseguiti seguendo le CLSI EP07-A2 Interference testing in clinical Chemistry; Approved
Guideline. Le sostanze indicate di seguito non mostrano alcuna interferenza con PakPlus alle concentrazioni specificate:
Emoglobina
Trigliceridi
Bilirubina
≤ 500 mg/dl
≤ 500 mg/dl
≤ 20 mg/dl
IVIG
Sono state testate anche IgG umane purificate, usate come surrogato per IVIG. A concentrazioni sieriche > 200
mg/dl si è osservata un’interferenza significativa in termini di risultati non interpretabili (pan-reattivi) o falsi positivi.
Non sono stati eseguiti test con concentrazioni sieriche < 200 mg/dl. I livelli riscontrati in pazienti riceventi terapia
22
con IVIG sono più alti delle minori concentrazioni testate.
I risultati ottenuti per questi pazienti in terapia con IVIG devono essere valutati attentamente a causa di
questa interferenza.
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303469.IFUIT Rev F
2015-10-19
Warning
Danger
H302
H318
H412
EUH032
P264
P270
P273
P280
P301 + P312
P305 + P351 + P338
P310
P330
PakPlus test
Attenzione
Pericolo
Nocivo se ingerito
Provoca gravi lesioni oculari
Nocivo per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata
A contatto con acidi libera gas molto tossici
Lavarsi accuratamente le mani dopo l'uso
Non mangiare, né bere, né fumare durante l'uso
Non disperdere nell'ambiente
Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso
IN CASO DI INGESTIONE: contattare un CENTRO ANTIVELENI/un medico in caso di malessere
IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le
eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare
Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico
Sciacquare la bocca
10
303469.IFUIT REV F
SIGNIFICATO DEI SIMBOLI
SYMBOL
ENGLISH
(EN)
CHINESE
(ZH)
DEUTSCH
(DE)
RS
Recording Sheet
记录单
Protokollbogen
ID #
Identification
Number
识别编
号
Identifikationsnummer
DATE
Date Read
TECH
Technologist
NC
Negative Control
PC
Positive Control
读取日
期
技师
阴性对
照
阳性对
照
FRANҪAIS
(FR)
Tableaux de
résultats
No
identification
du patient
GREEK
(EL)
ITALIANO
(IT)
PORTUGUÊS
(PT)
Tabela de
resultados
Φύλλο Καταγραφής
Foglio di lavoro
Αριθμός
Ταυτότητας
Numero di
identificazione
Número de
identificação
Datum
Date
Ημερομηνία
Data
Data da leitura
Untersucher
Negative
Kontrolle
Positive
Kontrolle
Technologue
Contrôle
négatif (A)
Contrôle
positif
Τεχνολόγος
Αρνητικός Ορός
ελέγχου
Θετικός Ορός
ελέγχου
Tecnico
Controllo
negativo
Controllo
positivo
Técnico
Controlonegativo
Controlopositivo
ESPANOL
(ES)
Tabla de Resultados
記録用紙
Nº de identificación
検体ID
Fecha
検査日
Analista
Control
negativo
Control
positivo
Pocillo del
Blanco
検査者
陰性コント
ロール
陽性コント
ロール
Blank Well
空白孔
Blank
Puitsvierge
ΤΥΦΛΟ
Bianco
Poço do Branco
Dilute Before Use
使用前
稀释
Vor Gebrauch
verdünnen
Diluer avant
utilisation
Αραιώστε
πριντηνΧρήση
Diluire con
acquadeionizzata
prima dell’uso
Diluir antes de
utilizar
Dilución
MNCOD
Mean Negative
Control OD
平均阴
性对照O
D
OD-Mittelwertder
NC
Μέση τιμή OD
Αρνητικού
μάρτυαρα
Media del
Controllo Negativo
OD
DO Média do
Controlo Negativo
promedio de
la OD del CN
MPCOD
Mean Positive
Control OD
平均阳
性对照O
D
OD-Mittelwertder
PC
Μέση τιμή OD
Θετικού μάρτυαρα
Media del
Controllo Positivo
OD
DO Média do
Controlo Positivo
promedio de
la OD del CP
Cutoff Multiplier
乘数截
止数值
Cutoff Multiplier
Πολλαπλασιαστής
cutoff
Moltiplicatore
Cutoff
Multiplicador de
Cutoff
Control Cutoff
对照截
止数值
Μαρτυρας
cutoff
Controllo Cutoff
Controlo Cutoff
Cutoff (corte)
OD 1
Optical Density 1
光密度
1
Optische Dichte 1
Οπτική πυκνότητα 1
Densità ottica 1
OD 2
Optical Density 2
光密度2
Optische Dicht 2
Densidade Óptica
1
Densidade Óptica
2
Densidad
Optica 1
Densidad
óptica 2
Row A
A行
Row B
B行
BLANK
DIL
Multiplier
CUTOFF
ROW A
ROW B
MEAN
INTRP
VALID
RSLT
DUP OK
TEMPLATE
CALCS
SAMPLE
RESULTS
SAMPLE
CONTROLS
RVW
CUTOFF der
Kontrolle
Moyenne des
DO du
contrôle
négatif
Moyenne des
DO du
contrôle
positif
Multiplicateur
du seuil de
positivité
Seuil de
positivité du
contrôle
Densité
optique 1
Densité
optique 2
Οπτική πυκνότητα 2
Densità ottica 2
Reihe A
Rangée A
Γραμμή Α
Riga A
Linha A
Fila A
Reihe B
Rangée B
Γραμμή Β
Riga B
Linha B
Fila B
Μέση OD δείγματος
Media Campione
OD
DO Média da
Amostra
Media
Mean Sample OD
平均样
品 OD
Mittelwert OD
der Probe
Moyenne des
DO de
l’échantillon
Interpretation
说明
Interpretation
Interprétation
Ερμηνεία
Interpretazione
Interpretação
Interpretacion
Controls meet
criteria for valid
assay
对照符
合有效
测定标
准
Kontrollen valide
für den Test
Les contrôles
rencontrent
les critères de
validité de
l’essai
Ο έλεγχος πληρεί τα
κριτήρια για έγκυρη
μέθοδο
I controlli
corrispondono ai
requisiti richiesti
per la validazione
del test
Controlos
satisfazem os
critérios de
validação do teste
Resultados de los
controles para un
ensayo valido
Result
结果
Ergebnis
Résultat
Αποτέλεσμα
Risultato
Resultado
Resultados
Αποδεκτή
διακύμανση εις
διπλούν
Variazione
accettabile dei
duplicati
Variação Duplicada
Aceitável
Variación duplicada
aceptable
Μήτρα πλάκας
Modello di piastra
Template
Calcoli di controllo
Cálculos de control
Risultati del
campione
Campione
Controlli
Resultdos da
Amostra
Amostra
Controlos
Controllato da
Revisto por
Duplicate
Variation
Acceptable
可接受
的重复
变化
Sample
Controls
平皿模
板
对照计
算
样品结
果
样品
对照
Reviewed by
审核
Plate Template
Control
calculations
Sample Results
PakPlus test
Doppelbestimmung sind ok
Plattenbelegung
Berechnungen
der Kontrolle
Ergebnis der
Probe
Probe
Kontrollen
Gegengelesen
durch
Variation des
analyses en
double
acceptable
Modèle de la
plaque
Calculs de
contrôle
Résultats des
échantillons
Échantillon
Contrôles
Revu par
Υπολογισμός
ελέγχου
Αποτελέσματα
δειγμάτων
Δείγμα
Μάρτυρες
Ανασκόπηση από
11
JAPANESE
(JA)
ブランク
使用前に希
釈してくだ
さい
Template/
Plantilla
Calculos
control
Resultados
Muestra
Controles
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