In-line
Tissue Engineering
approach
Fabrizio Raimondi – Stefano Pagnutti
Biella 5 giugno 2009
La perdita o l’insufficienza funzionale di un tessuto
o di un organo rappresentano uno dei problemi
più invalidanti, frequenti e costosi
nell’ambito della sanità.
Il problema non è esclusivamente limitato
alla mancanza di organi in toto
- fegato, rene, cuore, pancreas ma coinvolge anche deficit tissutali localizzati
e limitati a parti di non vitale importanza
che comunque determinano
una scarsa qualità della vita.
Mentre la perdita di un organo
viene necessariamente compensata con un trapianto,
nel caso di perdite di sostanza
il chirurgo deve ingegnarsi su come ricostruire,
utilizzando i tessuti residui
o con ciò che viene messo a disposizione
dalle industrie dei biomateriali,
la struttura e la funzione
dei tessuti danneggiati.
PASSATO
Biomateriali improvvisati
e tentativi di riparazione
sono antichi come il
desiderio e la necessità
dell’uomo di sostituire
parti del corpo difettose
per migliorare la qualità
della vita.
NASCE LA MEDICINA
Papiro di Edwin Smith (1850)
48 casi clinici:
27 traumi cranici;
6 lesioni della gola e del capo;
2 della clavicola;
3 delle braccia;
8 dello sterno;
1 della spalla;
1 della colonna vertebrale.
2600 a.C. Sacerdote, ufficiale, costruttore e
architetto visse alla corte del faraone Djoser
(III Dinastia). Quasi universalmente
riconosciuto come
il “Padre della Medicina”
Alluce in cuoio e legno
Sacerdotessa di Tebe (1.000 a.C.)
(Museo del Cairo)
Chiodo di 23 cm
in ferro inserito
nel ginocchio.
Mummia di Usermontu
(656-525 a. C.)
(Museo di San Josè, CA)
1700 a.C. The Edwin Smith Surgical Papyrus
Lungo 4.68 metri e largo 33 cm, fu scritto sulla base
di testi più antichi di circa 1000 anni
LE PRIME PROTESI
Protesi dentaria dei Fenici costituita
da conchiglie legate con filo d’oro
(V-VI sec. a.C.)
Canino legato con filo dìoro
a due incisivi
(Cairo)
Incisivo artificiale
(tomba etrusca)
Mandibola trovata in Honduras
nel 1931, presenta tre frammenti
di conchiglia in luogo degli incisivi
inferiori.
Databile intorno al 600 d.C.
MIRACOLI
I santi Cosma e Damiano attorno al 300
avrebbero attaccato la gamba di un
moro ad un cristiano.
“El milagro de Calanda”
Atti notarili e processuali testimoniano
lo strano reimpianto di gamba di Miguel
Juan Pellicer nel 1640 a Calanda (Bassa
Aragona, Spagna)
IL PRIMO INNESTO ETEROLOGO
Nel 1668 il medico olandese Job Van
Meekeren esegue il primo innesto osseo
eterologo innestando un frammento di
cranio di cane in un difetto craniale di un
soldato rimasto ferito.
Il soldato venne scomunicato. Per questo
chiese di farsi togliere l’innesto, ma non
fu possibile perché risultò
completamente integrato.
(De Boer 1988)
LA STRUTTURA DELL’OSSO
Antoni Van LeeuwenhoeK nel 1674
descrive per la prima volta la struttura
ossea relativamente a quelli che saranno
poi chiamati canali Haversiani.
Si cominciano ad evidenziare concetti
come “callo osseo”, “impianto” e
“riassorbimento”.
Nel 1743 Duhamel pubblica i risultati
dei suoi esperimenti su animale dove
suggerisce il ruolo importante del
periostio nella neo-osteogenesi.
(De Boer 1988, Glicenstein 2000)
INNESTO AUTOLOGO E OMOLOGO
Il primo innesto autologo
Germania 1820: Philips Von
Walter chiude il foro a seguito
della trapanazione del cranio,
con la bratta precedentemente
asportata.
Il chirurgo scozzese
William Mac Ewen nel
1880 innesta un
segmento di tibia da
donatore in un difetto
omerale di un ragazzo.
Leopold Ollier
studia il fenomeno della
rigenerazione ossea
e pubblica nel 1861 il
“traité de la régénération des
os” documento in cui
compare per la prima volta il
termine “greffe osseuse”:
innesto osseo
PRESENTE E FUTURO… PROSSIMO
Riparazione o sostituzione
di organi e di tessuti rimossi
“Riparare”
“Rigenerare”
• Ripristino di strutture
• Proprietà biomeccaniche
• Funzione
• Attività biochimica
TISSUE ENGINEERING
L’ingegneria dei tessuti è un “campo multidisciplinare”
in cui si fondono biologia cellulare, ingegneria, scienza dei materiali
e chirurgia, allo scopo di costruire nuovi tessuti funzionali, mediante
la combinazione di:
Cellule
autologhe
Scaffold
Ingegneria
Tissutale
Fattori
di crescita
Applicazione
clinica
SEMPLICEMENTE
“…the science of persuading the body to regenerate or repair
tissues that fail to regenerate or heal spontaneously”
C. M. Agrawal
scaffold
Solo
scaffold
host
tissue
Scaffold +
cellule
Biomaterials Research Group 2004
Scaffold +
fattori di
crescita
Scaffold +
cellule +
fattori di
crescita
BASTA IL SOLO SCAFFOLD?
Adesione di
proteine, GFs,…
Scaffold
impiantato
Coagulo
ematico
osso
Invasione
di vasi
sanguigni
Richiamo
e penetrazione
cellulare
Nutrienti bloccati,
cataboliti intrappolati
Pori
riempiti
di ECM
Cellule sintetizzano
e depositano matrice
extracellulare (ECM)
Cellule aderiscono,
proliferano e
differenziano
Cellule al centro
MUOIONO
Fallimento
dello scaffold
?
SOLO
Scaffold
alternativa
piccoli difetti
< 2-3mm
Cellule
Fattori
di crescita
Tessuto osseo
danneggiato
Tissue
Engineering
In-line TISSUE ENGINEERING
Tissue
Engineering
Utilizzare i requisiti e i principi dell’ingegneria
tissutale, direttamente in sala operatoria
1. LO SCAFFOLD
Necessità di un BIOMATERIALE
• Fornisce un’impalcatura tri-dimensionale per lo sviluppo delle linee
cellulari e la deposizione di matrice extracellulare
• Svolge un’importante funzione di interazione biologica: comunicazione e
scambio di segnali con il tessuto circostante
Controllo della struttura e della funzione
del tessuto ingegnerizzato
BIOMATERIALE IDEALE
• biocompatibile
• favorire
- adesione
- migrazione
- proliferazione
- differenziamento cellulare
- sintesi di matrice
extracellulare (ECM)
- invasione vascolare
• biodegradabile
INTERAZIONE CELLULA-BIOMATERIALE
La capacità di una cellula di riconoscere ed interagire con il
substrato rappresenta il primo indispensabile passo, senza il
quale processi come proliferazione, migrazione e
differenziamento cellulare non sarebbero possibili.
Nella progettazione di materiali per l’ingegneria dei tessuti, la
comprensione dei meccanismi che regolano tale interazione
sono di fondamentale importanza.
RICONOSCIMENTO E ADESIONE
Uno dei requisiti fondamentali di un biomateriale
per l’ingegneria dei tessuti è la capacità di
promuovere efficientemente l’adesione
delle cellule da cui verrà colonizzato.
Tale adesione prevede una fase precoce
in cui la cellula riconosce il substrato.
L’adesione cellulare ad un biomateriale avviene
tramite un meccanismo specifico, mediato
da proteine di membrana dette integrine.
Le integrine trasmettono il segnale dalla superficie cellulare
alla fitta rete di filamenti citoscheletrici che costituiscono
l’impalcatura della cellula. Dall’interazione delle integrine
con la matrice si originano cascate di segnali che determinano
la riorganizzazione del citoscheletro di actina
ed il cambiamento della morfologia cellulare.
La cellula, all’inizio tondeggiante (a), assume una forma distesa (b).
QUALE SCAFFOLD SCEGLIERE
Innesto omologo
Sicurezza
Aspetti medico-legali
Innesto eterologo
Biocompatibilità
Immunogenicità
Qualità
Innesto di sintesi
Porosità
Degradabilità
PURA MATRICE BIOLOGICA
Gli innesti eterologhi prodotti da
Bioteck con un sistema esclusivo
di deantigenazione enzimatica a 37° C
sono sicuri, totalmente biocompatibili e
con la componente collagenica
preservata
INNESTI FLEX
Un sistema di demineralizzazione parziale, consente
inoltre di avere innesti dalle caratteristiche di
flessibilità e plasticità uniche.
La demineralizzazione espone maggiormente la
matrice collagene esaltandone così le caratteristiche
biologiche.
2. I FATTORI DI CRESCITA
Fattori di crescita (growth factors, GFs):
sono polipeptidi che agiscono legandosi generalmente a recettori
ad attività tirosina-chinasica, inducendo una gamma complessa
di risposte che influenzano il destino della cellula bersaglio.
Possono avere un ruolo mitogenico (ad es. bFGF sui condrociti)
oppure trofico-differenziativo
(ad es. BMP-1 sulle cellule mesenchimali e pre-osteoblasti).
COSA OFFRE IL MERCATO
• Autologhi Piastrinici
PDGF; TGF-ß1, ß2; IGF I-II; EGF; FGF; VEGF
• Omologhi
innesti a base di DBM/BMP
• Eterologhi
E.M.D – Emdogain® Gel BIORA
Colloss®; Targobone® Biomet Biologics.
• Ricombinanti
rhPDGF Regranex® J&J
rhBMP7 Osigraft® Stryker Biotech
rhBMP2 InductOs® Medtronic
3. LA COMPONENTE CELLULARE
 Staminali (nell’embrione e tessuti adulti)
 Differenziate (nei tessuti adulti)
CELLULE STAMINALI
Le cellule staminali (stem cells, SC) sono cellule non specializzate
a uno stadio precoce di sviluppo.
Hanno la caratteristica di riprodursi a lungo senza differenziarsi
(auto-rinnovamento) e di dare origine a cellule progenitrici
dalle quali derivano linee cellulari differenziate
(muscolari, ematiche, nervose, ecc...).
Possono dividersi e differenziarsi in un largo numero di tipi cellulari
che producono i tessuti e gli organi del corpo.
Le prospettive terapeutiche aperte dalle SC risultano straordinarie: un primo
campo d’applicazione riguarderà la cura di molte patologie gravi (tumori,
malattie ereditarie, malattie neuro-degenerative), un secondo campo
d’applicazione riguarderà l’impianto di SC per rigenerare cellule e tessuti
evitando così i trapianti di organi e i problemi connessi di scarsità dei donatori e
di rischio di rigetto per incompatibilità donatore/ricevente
Le cellule staminali sono cellule non specializzate in grado di dividersi dando origine contemporaneamente
• ad una cellula staminale (uguale alla cellula madre)
• ad una cellula precursore di una progenie cellulare
che alla fine darà a sua volta origine a cellule terminalmente differenziate (mature).
Tipi di CS
Totipotenti
Pluripotenti
Multipotenti
Dove si trovano
Cellule costituenti la morula
Nella massa cellulare contenuta
all’interno della blastocisti
All’interno di tessuti fetali e
adulti differenziati (es. cordone
ombelicale, midollo osseo,
sangue, fegato, sistema nervoso)
Potenzialità
Possono originare tutti i tessuti
(formazione di un intero
organismo):hanno la capacità di
differenziarsi in tutte le linee
cellulari necessarie a formare
l’embrione
Hanno la potenzialità differenziarsi
in qualsivoglia cellula di un animale
adulto, ma non di dare origine ad
un embrione
Si differenziano in specifici tipi
cellulari (ad es. cellule
mesenchimali). Hanno la proprietà
di moltiplicarsi e mantenersi in
coltura, ma sono prive della
capacità di rinnovarsi in modo
illimitato
Unipotenti
All’interno di tessuti adulti
differenziati – cellule tessutospecifiche (es. nell’intestino)
Staminali
embrionali
Possono dar luogo soltanto ad un
tipo cellulare
Staminali
fetali / adulte
Staminali
adulte
CELLULE STAMINALI ADULTE
• Presenti nei tessuti adulti
• Cellule multipotenti che possono essere influenzate dai
fattori di crescita (GFs) per differenziare in varie
tipologie cellulari mature
• Ad es. cellule staminali mesenchimali (MSCs) presenti
nello stroma del midollo osseo
CELLULE STAMINALI NEL MIDOLLO OSSEO
Il midollo osseo è attualmente considerato la fonte più abbondante e facilmente
disponibile di cellule progenitrici staminali aventi la capacità di auto-rinnovarsi,
proliferare, migrare e differenziare in varie tipologie cellulari mature.
In aggiunta alle cellule staminali ematopoietiche, il midollo osseo contiene cellule
staminali non-emopoietiche mesenchimali e endoteliali, che costituiscono tre
“compartimenti staminali” altamente integrati tra loro.
MSCs:
CONCENTRAZIONE MIDOLLARE FISIOLOGICA
In condizioni fisiologiche, il midollo osseo di un uomo adulto
contiene mediamente 1 MSC / 250.000 cellule midollari.
Questo numero è strettamente correlato all’età:
Caplan AI. Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics. Tissue Eng. 2005 Jul-Aug;11(7-8):1198-211. Review
MSCs:
CONCENTRAZIONE EFFICACE MINIMA
E’ stato dimostrato da vari autori che il midollo osseo in toto contiene
una quantità di cellule osteoprogenitrici non sufficiente per garantire
una rigenerazione ossea efficace. Per avere un adeguato stimolo
osteogenico occorre concentrare il midollo 3-4X.
OK
3-4X
• Muschler GF, Matsukura Y, Nitto H, Boehm CA, Valdevit AD, Kambic HE, Davrs WJ, Easley KA, Powell KA. Selective retention of bone marrow-derived cells to enhance spinal fusion.
Clin Orthop Relat Res. 2005 Mar;(432):242-51.
• Ph. Hernigou, MD, A. Poignard, MD, F. Beaujean, MD and H. Rouard, MD. Percutaneous Autologous Bone-Marrow Grafting for Nonunions. Influence of the Number and Concentration
of Progenitor Cells. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 2005;87:1430-1437.
AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE DI MSCs
Il sistema più efficace per concentrare e quindi
aumentare il rapporto volume/quantità di MSCs
dell’aspirato midollare:
CENTRIFUGAZIONE
SISTEMA DI CONCENTRAZIONE
Porta ad una elevata
concentrazione di
cellule midollari
in sospensione,
quindi iniettabili
IL SISTEMA MARROW STIM
Studi hanno
dimostrato che la
maggior
concentrazione di
cellule si ottiene
aspirando 2 ml di
midollo per sito di
prelievo.
Prima
Dopo
Aspiration to obtain osteoblast progenitor cells from human bone marrow: the influence of aspiration volume.
(Muschler GF, Boem C, Easley K. 1997 - J. Bone Joint Surg. Am. 79:1699-1709)
VALORI DI CONCENTRAZIONE
• 80% - Recupero della frazione
totale di Cellule Nucleate (TNC)
• 6,7x - Concentrazione di TNC
rispetto a quella fisiologica
• 66% - Recupero della frazione
totale di Cellule Mononucleate
(MNC)
• 6,1x - Concentrazione di MNC
GRAZIE