MSc project title : Use of biological scaffolds for
3D-modelling analysis and in vitro osteogenic
differentiation methods and implementation
Candidata: Giovanna Lo Conte
Relatore : Dr. Marcello Bracale
Correlatori: Dr. Paolo Gargiulo e
Dr. Ólafur E. Sigurjónsson
INTRODUZIONE
L‘ingegneria dei tessuti è un campo multidisciplinare che
grazie all‘uso della combinazione delle cellule, l‘ingegneria, la
biochimica copre un ampio range di applicazioni.
Lo scopo principale dell‘ingegneria dei tessuti è la creazione di
sostituti biologici (ossa, cartilagine, pelle, vasi sanguigni,etc)
che una volta impiantati mantengono o migliorano le
caratteristiche
dei
tessuti
danneggiati.
L‘ingegneria dei tessuti usa cellule viventi come materiali
ingegnerizzati. La fabbricazione dei tessuti in laboratorio è
ottenuta dalla combinazione di cellule, matrici extracellulari
ingegnerizzate (scaffolds) e molecole biologicamente attive.
INTRODUZIONE
Allo stato attuale della tecnologia il metodo più comune per
esaminare le cellule sugli scaffolds è il microscopio elettronico.
Esso permette un’analisi 2D della superficie di tali strutture e
non permette una visione interna degli scaffolds.
Per vedere la parte interna degli scaffold è realizzare un
sezionamento seguito da un analisi istologica, ma tale tecnica
è
distruttiva,
noiosa
e
semi-quantitativa.
Questo progetto nasce dall’esigenza di voler superare tali limiti
e di voler trovare un nuovo strumento di analisi che consenta
di ottenere le informazioni delle tecniche attualmente
utilizzate in maniera non distruttiva e quantitativa.
OBIETTIVI
Il primo obiettivo è vedere se con la tecnologia della µCT è
possibile monitorare i cambiamenti intracellulari che
avvengono su differenti tipi di scaffolds OPLA (open-cell
polylactic acid) e CaP (Calcium Phosphate) inseminati da
cellule
mesenchimali
staminali
MC3T3-E1.
Scaffold CaP
Il secondo obiettivo è la progettazione di uno scaffold che
consenta l’ottimizzazione della crescita in vitro delle ossa e
realizzazione di un prototipo dello scaffold usando una
stampante
3D.
METODO: Set up MC3T3-E1
•
•
Le cellule staminali MC3T3-E1 sono
una linea cellulare proveniente da un
piccolo roditore (Mus Musculus).
Queste cellule staminali, dopo un
programma di differenziazione degli
osteoblasti in vitro, possono produrre
una matrice mineralizzata come quella
ossea[2].
Le cellule staminali MC3T3-E1 sono
coltivate in un medium di coltura (αMEM), senza acido ascorbico, con
l’aggiunta del 10% di siero fetale
bovino (FBS) e 1% di antibiotico
(contenente penicillina)
MC3T3-E1 al
microscopio
[2] Jane B. Lian, Victoria Shalhoub, Fauzia Aslam, Baruch Frenkel, Jack Green, Michael Hamrah, Gary S. Stein and Janet L. Stein (1997):
Species-Specific Glucocorticoid and 1,25-Dihydroxyvitamin D Responsiveness in Mouse MC3T3-E1 Osteoblasts: Dexamethasone Inhibits
Osteoblast Differentiation and Vitamin D Down-Regulates Osteocalcin Gene Expression .1997 May;138(5):2117-27
METODO: Set up scaffolds
• Prima della semina delle cellule sugli
scaffold, essi sono disposti in un
multiwell con 24 pozzetti, sono
bagnati con una soluzione di PBS
(tampone
fosfato
salino)
e
fibronectina
(che
induce
l’attaccamento delle cellule su di essi)
e poi sono incubati per un ora.
• Per la semina degli scaffolds sono
usate approssimativamente 200.000
cellule in una soluzione di volume
totale di 150 µl.
METODO : differenziazione osteogenica
• Le cellule inseminate sugli scaffolds
sono coltivate con un media per la
differenziazione osteogenica (DMEM/F12) con l’aggiunta di acido
ascorbico (che induce
la
formazione di collagene), βglycerolphasfate (che induce la
calcificazione del collagene) e siero
fetale bovino (FBS).
• La cultura è mantenuta in un
incubatore a 37° in un atmosfera
umidificata contenente 5% CO2 e il
media è cambiato ogni due giorni.
dopo 2
giorni
ANALISI SUPERFICIE SCAFFOLD CON IL MISCROSCOPIO
Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane)
Scaffold CaP
con cellule al
microscopio
Leica DM-IRB Inverted Research Microscope
ANALISI CELLULE E MATRICE CON IL MISCROSCOPIO
Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane)
Scaffold CaP
con cellule al
microscopio
dopo il
sezionamento
e la
colorazione
ANALISI CALCIFICAZIONE CON IL MISCROSCOPIO
Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane)
Scaffold CaP
con cellule al
microscopio
dopo il
sezionamento
e la
colorazione
SCANSIONE CON µCT E RICOSTRUZIONE 3D
Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane)
Scaffold CaP dopo la
ricostruzione 3D
con datos|x
µCT Phoenix Nanotom s GE
software phoenix datos|x
Caratteristiche da indagare dopo 8 settimane:
-struttura 3D dello scaffold
-dimensione dei pori
- proprietà dell’attaccamento delle cellule allo
scaffold
-distribuzione della formazione della matrice
mineralizzata (mineralizzazione)
METODO
• Definito un protocollo di
scansione degli scaffolds
• Definito un protocollo di
ricostruzione 3D degli scaffolds
• Usando lo standard DICOM
(Digital Imaging and COmmunications
in Medicine) per portare i dati dell’
immagini 3D in ambiente
Mimics.
• Sarà necesario stabilire un
protocollo per l‘analisi 3D di
tali strutture in ambiente
Mimics, per poter ricavare
informazioni e confrontarle con
quelle delle tecnologie
attualmente usate.
Dati scansione
V=120kV
I=100µA
T=2000ms
OTTIMIZZAZIONE E PROTOTIPIZZAZIONE
Nella seconda parte del mio lavoro, partendo
dall'ipotesi[3] che è possibile riuscire a catalizzare
la dinamica di crescita cellulare attraverso la
stimolazione meccanica, voglio ottimizzare il
processo modificando le caratteristiche degli
scaffolds (forma, porosità, materiale).
Voglio realizzare, infine, un prototipo dello
scaffold usando una stampante 3D (ZPrinter 450)
che è in grado di generare modelli tridimensionali
partendo da disegni realizzati usando dei
programmi di modellazione.
[3] Ulrich Meyer, Thomas Meyer, Jorg Handschel, Hans Peter Wiesmann (2009) Fundamentals of
Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Springer-Verlag Berlin Heidelberg
