DISS. ETH NO. 16926
Identification of apple scab avirulence gene AvrVg candidates
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
Giovanni Antonio Lodovico Broggini
dipt, chern. ETH, ETH Zürich
born 07.12.1976
citizen of Losone (TI)
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Cesare Gessler, examiner
Prof. Dr. Bruce McDonald, co-examiner
Dr. Luciana Parisi, co-examiner
2007
Chapter 1: Abstract
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Abstract
A major goal of plant pathology research is to understand the functioning of
disease resistances and
ascomycete
how pathogens overcome these resistances. The
Venturia tnaequalis, causal pathogen of apple scab, underlies a gene-
for-gene relationship with its host apple plant
apple cultivar carries resistance genes
(Malus spp). Prabably almost every
V. inaequalis avirulence genes underlying
such relationship. To day fourteen apple scab resistance genes have been
identified in different apple cultivars. Nevertheless most ofthese resistance genes
have been overcome by the pathogen. The efficacy of the R-genes that were
overcome depends mostlyon the frequency of the matching avirulence gene in
the pathogen population. In other plant-pathogen interactions, resistance
circumvention was shown to occur mainly by the mutation of the avirulence
alleles, 50 that the avirulence gene encoded prateins escape host recognition. In
all nineteen avirulence genes have been postulated in the past for V. inaequatis.
However little is known at molecular level about
V. inaequalis avirulence genes.
The genes involved in apple scab avirulence on hosts carrying the
Vf gene from M.
floribunda 821 arid Vg fram 'Golden Delicious' have been previously mapped in the
genome of
V. inaequalis at INRA Angers and called AvrVfand AvrVg, respectively.
We decided therefore to try the positional cloning of one of these avirulence
genes. Since the number of markers in the region surrounding both avirulence
genes was low, we starred an enrichment of these regions by mean of bulk
segregant analysis coupled with arnpllfled fragment length polymorphism
technology. This allowed to develop three new markers linked to AvrVg and one to
Avrv]. Simultaneously, two SSR markers were mapped tightly linked to AvrVg and
one to
AvrVj, respectively, at INRA Angers. Upon construction of a genetic library
consisting of BAC clones of a double avirulent isolate of V. inaequalis, a
chromosome walking in the region of
AvrVg was performed isolating eleven
overlapping BAC clones spanning the estimated 330 kb region of AvrVg. The four
clones which allowed spanning the whole region with minimal overlap were
sequenced by shotgun sequencing technique. The sequenced region was 330 kb
long and revealed a total of 61 genes predicted by two distinct gene prediction
software. Since most of fungal avirulence genes encode for proteins secreted
extracellularly, we analyzed the whole set of predicted genes in the
AvrVg regten
Chapter i. Abstract
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and recognized a total of 40 regions wh ich encode for genes secreted
extracellularly and were therefore considered as candidate avirulence genes. Two
candidate avirulence genes, which were encoded in the same sequence but
differed in one of their two splicing sites, were found to share high homology
(98% on ioybp) to two cDNA clones from a llbrary derived from apple leaves
infected with Venturia inaequalis. Moreover identity was found in the S'~
untranslated region. Since the cDNA encoded proteins are expressed during apple
scab infection, we speculate that one of the two predicted variants of candidate
avirulence gene might also be expressed under similar conditions. Moreover the
predicted candidate genes show other typical features offungal avirulence genes:
they are small and cysteine rich proteins. The expression of these candidates
avirulence genes during infection, as weil as the other encoded in the remaining
39 regions that were found to encode extracellular secreted proteins, has to be
proven and will
allow identifying their complete open
reading frames.
Complementation experiments wrth expressed genes will allow identifying the
one conferring avirulence on apple cultivar 'Golden Delicious'.
Chapter 2: Riassunto
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Riassunto
Uno degli obiettivi prineipali della patologia vegetale
e quello
di chiarire i
meceanismi della resistenza alle malattie negli ospiti e di eapire in quale maniera
i patogeni rieseono ad eludere queste resistenze.
Venturia lnaequalis, I'agente
eausale della ticchiolatura, sottosta ad una relazione dei tipo gene-per-gene con il
melo, e probabilmente ogni varleta di melo e portatriee di geni di resistenza ehe
corrispondono in una relazione di questo tipo a geni d'avirulenza della
ticehiolatura. Fino ad oggi quattordici geni di resistenza sono stati identificati in
diverse varleta di melo, e la maggior parte di loro e stata superata dal patogeno, e
quindi I'efficacia di suddetti geni di resistenza dipende principalmente dalla
frequenza dei corrispondente gene d'avtrulcnza nella popolazione dei patogeni. In
altre relazioni tra patogeno e ospite, I'elusione dei geni di resistenza avviene
prineipalmente mutando il gene d'avirulenza in modo ehe la proteina in esso
codifieata eviti il riconoseimento da parte dell'ospite. In passato sono stati
postulati dieiannove geni d'avirulenza nella ticchiolatura. Tuttavia a livello
moleeolare si conosee poehissimo. AII'istituto nazionale di rieerehe agricole (INRA)
d'Angers i loei genetiei determinanti I'avirulenza dei patogeno su varleta portatriei
dei geni di resistenza Vi, da Malus[lortbunda 821, e Vg di 'Golden Delieious', sono
stati mappati nel genoma della ticehiolatura e ehiamati rispettivamente AvrVf e
AvrVg. Abbiamo quindi deeiso di eseguire un c1onaggio in base alla posizione di
mappa di uno di questi due geni, e siecome il numero di marcatori moleeolari
nella regione d'entrambi i loei era scarso, abbiamo effettuato un arrieehimento
dei numero di marcatori di entrambe le regioni di avirulenza combinando la bulk
segregegant analysis (I'analisi differenziale di miseeie di DNA segreganti per un
carattere) con la tecnologia AFLP. Questa teeniea ha permesso di sviluppare tre
nuovi marcatori nella regione d'AvrVg e di uno solo nella regione d'AvrVf
Contemporaneamente, due mareatori mierosatelliti fortemente assoeiati al loeus
d'AvrVg ed uno assoeiato alloeus di AvrVf sono stati mappati all'INRA Angers. Una
volta eostruita una genoteea di cloni BAC di un isolato portatore d'entrambi i geni
d'avlrulenza, si
e intrapresa
un ehromosome walking (passeggiata eromosomiea)
nella regione d'AvrVg. Undici cloni BAC coprono tutta la regione d'AvrVg ehe
e
stata stimata a 330 kb di grandezza. I quattro clont suffieienti a coprire
interamente la regione eon una sovrapposizione minima sono stati in seguito
Chapter 2: Riassunto
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sequenztat. eon la tecniea dello shotgun-sequeneing (sequenziamento a eolpo di
lupara). Una volta sequenziata, la regione d'AvrVg risulta essere grande circa 330
kb e sulla quale, utilizzando dei programmi di predizione, sono stati predetti un
totale di 61 geni. Dal momento ehe la maggior parte dei geni d'avirulenza fungini
ha la earatteristiea d'essere proteine seerete all'esterno delle eellule, abbiamo
analizzato tutte le proteine predette nella regione d'AvrVg per questa peculiartta
identifieando un totale di 40 regioni ehe possono eodifieare per geni seereti e per
questo motivo dei eandidati geni d'avirulenza. Due candidati, codifieati dalla
stessa sequenza ma differenti in sito di "splicing", condividono i primi due esoni.
Questi esoni mostrano un'elevata omologia (98% su 105 basi) con un unigene
appartenente ad una libreria di eDNA derivata da foglie di melo infette da
tieehiolatura, ed oltre a tutto
e stata
trovata identita con la regione non traslata
prima dei gene. Dal momento ehe i geni codifieati dai donl di eDNA sono espressi
durante I'infezione fungina, si pUD dedurre ehe uno dei due geni eandidati sia
anch'esso espresso in situazioni simili. I due geni eandidati inoltre, mostrano altre
earatteristiehe tipiehe dei geni d'avirulenza: sono proteine piecoie e contengono
molte eisteine. l.'espressione di questi geni, eome anehe degli altri 39 eandidati
geni secreti predetti, deve essere dimostrata, permettendo inoltre I'identifieazione
degli ORFs (sequenze codifieanti per una proteina) completi. Esperimenti di
complementazione eon i gen: espressi permetteranno di identifieare il gene AvrVg
responsabile per I'avirulenza su 'Golden Delieious'.