“Sperimenta il BioLab”
Da un albero genealogico al DNA e ritorno
Università degli Studi di Milano
Indice
1. Conoscenze propedeutiche
•
1.1 Le mutazioni
•
1.2 Mutazioni geniche
•
1.3 Alcuni concetti base e terminologia essenziale riguardanti le malattie
monogeniche e le leggi di Mendel
p. 3
p. 3
2. Malattie genetiche monogeniche e analisi del pedigree
p. 7
•
•
•
•
•
2.1 Che cosa è il pedigree
2.2 Principali modalità di trasmissione di malattie o caratteri monogenici
2.2.1 Trasmissione autosomica recessiva
2.2.2 Trasmissione autosomica dominante
2.2.3 Trasmissione di caratteri recessivi associati al cromosoma X
2.2.4 Trasmissione di caratteri dominanti associati al cromosoma X
2.2.5 Trasmissione di caratteri associati al cromosoma Y
2.3 La banca dati OMIM
2.4 Eterogeneità genetica
2.5 Pleiotropia
3. I polimorfismi di restrizione (RFLP) e il loro utilizzo nella
diagnostica delle malattie genetiche
•
3.1 Gli enzimi di restrizione
•
3.2 I polimorfismi del DNA
•
3.3 I polimorfismi di sequenza del DNA
•
3.4 I polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)
3.4.1 La tecnica della PCR per l’analisi degli RFLP
•
3.5 I polimorfismi di restrizione (RFLP) nella diagnosi delle malattie
genetiche
3.5.1 Utilizzo di un polimorfismo di restrizione (RFLP) nella diagnosi diretta.
Diagnosi di anemia falciforme
3.5.2 Utilizzo di un polimorfismo di restrizione (RFLP) nella diagnosi indiretta.
Ricerca di un RFLP associato a un allele malattia
p. 4
p. 7
p. 8
p. 8
p. 8
p. 8
p. 9
p. 9
p. 9
p.10
p.10
p.11
p.11
p.12
p.12
p.12
p.13
p.14
p.14
p.15
4. Sano o malato?
•
4.1 Schede informative di 3 malattie monogeniche
(anemia falciforme, ipercolesterolemia familiare, emofilia A)
•
4.2 A ciascuna storia il suo pedigree. Scenari e simulazione di
consulenza genetica
p.20
5. Tecniche utilizzate in laboratorio
•
5.1 PCR
5.1.1 termociclatori
5.2.2 Taq polimerasi
5.2.3 scelta dei primer
•
5.2 Digestione con gli enzimi di restrizione
5.3 Elettroforesi su gel di agarosio
•
•
5.4 Strumentazione e materiale a disposizione
•
5.5 Principali prefissi e unità di misura usate in biologia molecolare e cellulare
p.23
p.23
p.23
p.24
p.24
p.24
p.24
p.25
p.25
6. Dal pedigree al DNA e ritorno
•
6.1 Schema delle PCR e digestione con enzimi di restrizione
•
6.2 Elettroforesi su gel di agarosio. Soluzioni e reagenti
•
6.3 Preparazione del gel di agarosio
•
6.4 Corsa elettroforetica
•
6.5 Analisi dei risultati
•
6.6 Consulenza genetica
p.26
p.26
p.27
p.27
p.28
p.29
p.30
7. Norme di sicurezza in laboratorio
p.30
8. Test di autovalutazione
p.31
9. Glossario
p.36
10. Siti web
p.38
11. Concorso "Una settimana da ricercatore"
p.38
2
p.16
p.16
1. Conoscenze propedeutiche
1.1 Le mutazioni
Nella specie umana esistono 23 coppie di cromosomi che contengono circa 24.000 geni.
Le malattie genetiche sono causate da mutazioni, cioè da alterazioni del corredo genetico (genoma) di un
individuo.
•
•
Se le mutazioni avvengono nelle cellule che formano i gameti, cioè nelle cellule germinali, allora
possono essere trasmesse alla discendenza dove saranno presenti in ogni cellula dell’individuo
affetto. Queste mutazioni possono sorgere come mutazioni nuove nei gameti di uno dei genitori
oppure possono essere state ereditate dai genitori dalle generazioni precedenti.
Viceversa le mutazioni che avvengono in altre cellule del corpo, le cellule somatiche, non sono
trasmesse alle generazioni successive, ma determinano una differenza genetica tra le cellule dello
stesso organismo (mosaicismo). La conseguenza può essere l’insorgenza e lo sviluppo di un cancro.
Le mutazioni possono riguardare il numero dei cromosomi (mutazioni genomiche), la struttura dei
cromosomi (mutazioni cromosomiche) o i singoli geni (mutazioni geniche).
1.2 Mutazioni geniche
Le mutazioni che coinvolgono singoli geni sono, di solito,
il risultato della sostituzione di una base con un'altra, della
delezione (perdita) o dell’inserzione di basi (Fig. 1.1). Se
insorgono all’interno di un gene che codifica una proteina,
queste mutazioni possono alterare la proteina prodotta. Per
esempio, una sostituzione può modificare il significato di
un codone e portare all’inserimento nella proteina di un
amminoacido al posto di un altro (mutazione mis-senso);
oppure può cambiare un codone per un amminoacido in un
codone di stop provocando la fine prematura della sintesi
della proteina e un prodotto proteico incompleto
(mutazione non-senso); l’inserzione o la delezione di una
o più basi (non multipli di tre!) portano a una sfasatura
nella lettura del codice e quindi all’alterazione della
sequenza della proteina a valle della mutazione
(mutazione frameshift).
La conseguenza di una mutazione è quasi sempre la
produzione di una proteina che non è in grado di svolgere
la sua funzione biologica (ad esempio, di un enzima che
non è in grado di catalizzare una reazione).
In anni recenti, si è individuato un nuovo tipo di mutazione
Fig. 1.1 Tipi diversi di mutazione. Le mutazioni
puntiformi (fatta eccezione per le mutazioni
che consiste nella presenza di copie multiple (da decine a
sinonime) e le piccole delezioni causano quasi
più di mille, a seconda delle diverse patologie) di una
tripletta in un punto del gene (malattie da ripetizione di sempre la produzione di una proteina con
funzionalità alterata.
triplette); nella corea di Huntington, una malattia genetica
neurodegenerativa molto grave a trasmissione autosomica dominante e ad insorgenza tardiva, la tripletta
ripetuta è CAG. Questa ripetizione porta ad un incremento del numero di copie dell’amminoacido
glutammina nella proteina che diventa tossica per le cellule nervose.
Le mutazioni all’interno delle regioni di controllo di un gene possono invece influenzarne il livello di
trascrizione. Un esempio è una forma di talassemia (nota anche come anemia mediterranea) in cui
vengono prodotte in quantità insufficiente le catene dell’emoglobina.
Una mutazione che interessa una sequenza nucleotidica cruciale per il meccanismo di splicing
(rimozione degli introni) di un trascritto primario di RNA avrà come conseguenza il blocco dello splicing
o la modificazione dello schema di splicing di quel trascritto e quindi la mancata produzione del mRNA
corrispondente o la produzione di un mRNA modificato.
3
1.3. Alcuni concetti base e terminologia essenziale sulle malattie monogeniche e le leggi di Mendel
Le malattie ereditarie monogeniche sono determinate da mutazioni in singoli geni che si trasmettono nelle
famiglie secondo leggi ben definite scoperte dall’abate Gregorio Mendel nella seconda metà
dell’Ottocento. Per questo motivo le malattie monogeniche o monofattoriali vengono anche chiamate
“mendeliane”. In particolare bisogna ricordare che:
I geni possono avere alleli diversi (varianti alternative di uno stesso gene) ossia essere polimorfici;
Gli organismi diploidi hanno due copie di ogni gene, cioè due alleli. Se i due alleli sono uguali,
l’individuo è omozigote (ad es, ha genotipo AA oppure aa). Se i due alleli sono diversi, l’individuo è
eterozigote (ad es, il genotipo è Aa);
La I legge di Mendel o legge dell’uniformità della prima generazione ibrida, afferma che l’incrocio
tra individui della generazione parentale ciascuno omozigote per due alleli diversi di uno stesso gene
(ad es, AA x aa) e che quindi differisce dall’altro genitore per una caratteristica (ad es, pelo nero o
marrone), dà una progenie costituita da individui tutti identici tra loro (tutti eterozigoti; ad es, Aa);
Durante la meiosi i due alleli di un gene segregano e si distribuiscono ciascuno in un gamete aploide
(II legge di Mendel, legge della segregazione). Un individuo omozigote produce un solo tipo di
gamete (A oppure a) relativamente a un dato locus (la posizione occupata da un gene in un
cromosoma). Un individuo eterozigote produce due tipi di gameti (A e a) in ugual quantità, cioè in
rapporto (50%) ciascuno. Una buona rappresentazione grafica della segregazione si ottiene
costruendo il “quadrato di Punnett” (Fig. 1.2 e 1.3);
Alleli appartenenti a geni diversi localizzati su cromosomi diversi segregano in modo indipendente
(III legge di Mendel, legge della segregazione indipendente);
Allele dominante: allele che si manifesta allo stato eterozigote;
Allele recessivo: allele mascherato dall’allele dominante, che si manifesta solo allo stato omozigote;
Allele codominante: due alleli entrambi espressi allo stato eterozigote, che agiscono sul fenotipo in
modi indipendenti e distinguibili. Un esempio classico si ha nel caso degli alleli IA e IB del gruppo
sanguigno ABO.
L’1% circa dei neonati è affetto da una malattia genetica monogenica. La mutazione genica è presente fin
dal concepimento, quindi anche alla nascita, anche se non sempre si manifesta fenotipicamente alla
nascita. Alcune di queste malattie comportano conseguenze già apprezzabili nel neonato. Altre malattie
monogeniche si manifestano, invece, durante le età successive della vita. La corea di Huntington, ad
esempio, è una malattia genetica a insorgenza tardiva che si manifesta solo in età adulta.
Fig. 1.2 Rappresentazione della legge della
segregazione dei caratteri (I legge di Mendel): nel
quadrato di Punnett sono riportati i possibili genotipi
dei figli di genitori eterozigoti per un carattere
recessivo (sopra) e per un carattere dominante (sotto).
Fig. 1.3 Il quadrato di Punnett illustra la modalità di
trasmissione di un carattere recessivo legato al
cromosoma X e i possibili genotipi dei figli di un
padre malato (a sinistra) o di una madre portatrice (a
4destra).
Fig. 1.4 Mappa del cariotipo
umano in cui sono evidenziate
alcune
delle
malattie
monogeniche
autosomiche
dominanti,
autosomiche
recessive e legate al cromosoma
X recessive.
Si definisce malattia autosomica quella in cui l’allele malato è presente nelle coppie di cromosomi non
coinvolti nella determinazione del sesso, gli autosomi; si parla invece di malattia legata all’X quella in
cui l’allele si trova nel cromosoma sessuale X. In questo caso la trasmissione segue modalità particolari
in quanto la maggior parte dei geni rappresentati sul cromosoma X non sono rappresentati sul cromosoma
Y. Il cromosoma Y, infatti, è molto più piccolo e contiene quasi esclusivamente i geni per la
determinazione del sesso. La Fig. 1.4 rappresenta la mappa del cariotipo umano in cui è indicata la
localizzazione cromosomica dei geni responsabili di alcune malattie monogeniche autosomiche e
associate al cromosoma X.
Per schematizzare (vedere Tab. 1.1):
•
•
malattie autosomiche: se l’allele normale è dominante, la malattia si rende manifesta solo nella
condizione omozigote recessiva, ossia negli individui in cui entrambi gli alleli del gene sono alterati
(malattia autosomica recessiva); se invece è l’allele alterato a prevalere su quello sano, la malattia si
rende sempre evidente, anche nella condizione eterozigote, ossia è sufficiente che uno solo dei due
alleli sia alterato per avere la malattia (malattia autosomica dominante) (Fig.1.2).
malattie legate all’X: se l’allele è recessivo (Fig.1.3), come nella maggior parte dei casi, i maschi
ricevono l’X difettoso dalla madre, ma non possono bilanciarlo con un allele sano nell’Y in quanto
questo cromosoma non contiene l’allele corrispondente; le femmine invece manifestano la malattia
solo nelle condizione omozigote. Di conseguenza, la frequenza delle malattie recessive legate al
cromosoma X è maggiore nei maschi che nelle femmine. Nel caso di malattie dominanti le
femmine
manifestano la malattia anche nella condizione eterozigote.
Autosomiche
Malattie a ereditarietà mendeliana
Legate al cromosoma X
Legate al cromosoma Y
Tab.1.1 Classificazione delle malattie a ereditarietà mendeliana
5
Dominanti
Recessive
Dominanti
Recessive
Nella Tabella 1.2 sono riportate alcune delle principali malattie monogeniche di cui è indicata la
frequenza nella popolazione adulta, il tipo di trasmissione, la localizzazione cromosomica e il numero del
catalogo OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man).
Malattie
Frequenza in popolazione adulta
monogeniche
Ipercolesterolemia
eterozigoti 1 / 500
familiare
Corea di Huntington 1 / 20000
Tipo di
trasmissione
Autosomica
dominante
Autosomica
dominante
Policistite
renale 1 / 1000 nati vivi
Autosomica
dell’adulto
dominante
Fibrosi cistica
1 / 2000 – 4000
Autosomica
popolazione caucasica
recessiva
Anemia falciforme Molto rara in Europa, molto Autosomica
(HbS)
diffusa nella popolazione nera in recessiva
Africa (1 / 400 – 600) e in
America (1 / 50)
Talassemia
Molto frequente nel bacino Autosomica
Mediterraneo (1 / 250)
recessiva
Fenilchetonuria
1 / 10000 nati vivi
Localizzazione
cromosomica
Cromosoma 19
Ref. OMIM
Cromosoma 4
143100
Cromosoma 16
173900
Cromosoma 7
219700
Cromosoma 11
141900.0243
143890
Cromosoma 11 catene Alfa:
beta; cromosoma 16 141800
Beta:
catene alfa
141900
Cromosoma 12
261600
Autosomica
recessiva
Ipofosfatemia
1 / 20000
X-linked
Cromosoma X
307800
familiare
dominante
Emofilia A
1 / 5000 – 10000 nei maschi
X-linked
Cromosoma X
306700
recessiva
8% nei maschi; 0,64% nelle X-linked
Daltonismo
Cromosoma X
303800
(Cecità al verde e al femmine
recessivo
rosso)
Miopatia
di 1 / 6000 nei maschi
X-linked
Cromosoma X
310200
Duchenne
recessiva
Tab. 1.2 Alcune malattie monogeniche di cui è indicata la frequenza nella popolazione adulta, il tipo di trasmissione,
la localizzazione cromosomica e il numero del catalogo OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man).
6
Ma tu ce l’hai
il pedigree?
??!!
2. Malattie genetiche monogeniche e analisi dei pedigree
2.1 Che cosa e’ il pedigree?
Uno degli aspetti della genetica è lo studio dei meccanismi con cui i geni sono trasmessi dai genitori ai
figli. A tale scopo i genetisti effettuano accoppiamenti tra organismi della stessa specie, per analizzare la
trasmissione dei caratteri. Nella genetica umana, gli accoppiamenti sperimentali ovviamente non sono
possibili. Molte delle nostre conoscenze sull’ereditarietà dei caratteri umani derivano perciò dalla analisi
degli alberi genealogici o pedigree.
In pratica, il pedigree è la rappresentazione sistematica della storia familiare attraverso l’uso di simboli
standardizzati (Fig.2.1). Il pedigree viene stilato partendo da un’intervista ai componenti di una famiglia,
al fine di ricostruirne la storia (anamnesi); in questo modo è possibile seguire la trasmissione di un dato
carattere attraverso parecchie generazioni in una data famiglia (Fig.2.2).
L’analisi del pedigree permette di determinare se il carattere ha una modalità di trasmissione recessiva o
dominante, e se il gene in questione è localizzato su un autosoma o su un cromosoma sessuale, permette
in ultima analisi di informare i membri di una
famiglia sulla probabilità di trasmettere queste
malattie ai propri figli.
Fig.2.1. I simboli usati nell’analisi del pedigree
adottati nel 1995 dalla Società Americana di
Fig.2.2. Un pedigree che mostra la trasmissione
ereditaria di un carattere (i simboli scuri
rappresentano gli individui affetti) attraverso
numerose generazioni di una famiglia.
Nell’analisi del pedigree ci si basa sui principi dell’eredità di Mendel per escludere le modalità di
trasmissione che sono incompatibili con il pedigree. Ad esempio, la presenza nell’albero genealogico di
femmine malate ci permette di escludere la trasmissione legata all’Y.
7
2.2 L’analisi del pedigree per la determinazione delle modalità di trasmissione di malattie o di
caratteri monogenici
Dall’analisi di un pedigree si può determinare (talvolta non in modo univoco, in quanto un pedigree può
essere compatibile con più di una modalità di trasmissione ereditaria) come viene trasmesso un dato
carattere. Analizziamo le caratteristiche dei pedigree relativi a caratteri:
autosomici recessivi (AR)
autosomici dominanti (AD)
legati al cromosoma X recessivi (XR)
legati al cromosoma X dominanti (XD)
legati al cromosoma Y
2.2.1
Eredità autosomica recessiva
Possono essere affetti sia i maschi sia le femmine.
In genere gli individui affetti hanno genitori sani
(portatori asintomatici).
I genitori entrambi portatori sani hanno il 25% di
probabilità di avere figli malati ad ogni gravidanza.
L’incidenza della malattia aumenta in caso di
consanguineità.
Tutti i figli di genitori entrambi affetti (omozigoti)
sono a loro volta affetti.
•
•
•
•
•
2.2.2 Eredità autosomica dominante
Possono essere affetti sia i
maschi sia le femmine.
• Gli individui affetti possono
essere presenti in tutte le
generazioni.
• Gli individui affetti hanno
sempre un genitore affetto.
• Poiché i geni responsabili di
malattie
autosomiche
dominanti sono rari, in
genere gli individui affetti sono eterozigoti. Rarissimi sono gli omozigoti, che possono nascere solo da
genitori entrambi eterozigoti. Ogni affetto (eterozigote) ha il 50% di probabilità di avere figli malati.
• Individui non affetti del pedigree che sposano individui non affetti non hanno discendenti affetti.
• Genitori entrambi affetti (eterozigoti) possono avere figli sani (25%).
• I genitori di un bambino malato possono essere sani: in questo caso si può dedurre che la malattia origina
da una nuova mutazione verificatasi durante la formazione di un gamete (mutazione “de novo”).
•
2.2.3 Eredità recessiva legata al cromosoma X
•
•
•
•
•
•
•
8
La frequenza della malattia è maggiore nei
maschi che nelle femmine.
Le femmine possono essere portatrici sane.
Le donne portatrici hanno un rischio del 50% di
avere figli maschi malati.
I maschi affetti hanno figlie portatrici sane e
figli maschi sani.
La madre di un individuo affetto è portatrice
sana.
Il carattere si trasmette a zig-zag con maschi
affetti in generazioni diverse (eredità diaginica).
La metà delle figlie femmine di madri portatrici
sono anche loro portatrici.
2.2.4 Eredità dominante legata al cromosoma X
•
•
•
Maschi affetti generano solo
femmine affette, mentre i figli
maschi sono sempre sani.
Femmine eterozigoti affette
trasmettono il carattere al 50%
dei figli siano essi maschi o
femmine.
La frequenza della malattia
nelle femmine è solitamente
doppia di quella nei maschi.
2.2.5 Eredità legata al cromosoma Y
•
•
•
Sono stati individuati pochi
caratteri legati al cromosoma Y.
I caratteri si manifestano solo nei
maschi
Sono trasmessi direttamente da
padre a figlio (eredità olandrica).
2.3 La banca dati OMIM
OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, è una banca dati che contiene informazioni sui geni
umani e sulle malattie genetiche realizzata e mantenuta dall’NCBI, the National Center for
Biotechnology Information. La banca contiene la descrizione dei geni e delle malattie ad essi associate,
i quadri clinici e i riferimenti bibliografici, oltre a link a sequenze e ad altre risorse web. Si tratta della
versione on line del testo
“Mendelian Inheritance in Man”,
ora alla sua dodicesima edizione,
a cura del genetista medico Victor
A. McKusick e di un gruppo di
colleghi della Johns Hopkins
University e di altre istituzioni. La
banca
dati
è
aggiornata
quotidianamente e a metà 2004
conteneva oltre 15400 voci. Essa
riporta solo malattie che sono
state associate ad uno o più geni.
La pagina di accesso ad OMIM si
raggiunge tramite un link sulla
homepage dell’NCBI:
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Per entrare, fare click sulla parola
OMIM in bianco sulla striscia blu in cima alla pagina.
9
2.4 Eterogeneità genetica
Per alcune malattie ereditarie monogeniche tutti gli individui affetti portano un’identica mutazione:
l’anemia falciforme ne è un esempio. Per molte altre malattie ci sono invece più mutazioni che possono
produrre lo stesso quadro patologico. Quando le diverse mutazioni sono a carico dello stesso gene si parla
di eterogeneità allelica. Nel caso dell’emofilia A, ad esempio, il catalogo OMIM riporta 270 varianti
alleliche. La fibrosi cistica è causata da più di 1000 mutazioni diverse nel gene CFTR. Le diverse
mutazioni possono produrre
fenotipi di gravità diversa.
Nel caso in cui le mutazioni
avvengono in geni diversi che
collaborano
alla
determinazione
di
un
fenotipo,
si
parla
di
eterogeneità di locus. Ad
esempio, in una stessa via
metabolica, mutazioni in geni
diversi possono portare alla
stessa
modificazione
del
fenotipo (Fig.2.3).
E’ il caso delle due forme di
ipercolesterolemia familiare A
e B (vedere §4.1) dovute
rispettivamente a mutazioni
del gene del recettore che lega
Fig.2.3. Esempio di uno dei meccanismi alla base dell’eterogeneità genetica di
le lipoproteine LDL e del
locus. È rappresentata una catena metabolica costituita da tre passaggi
gene della apoproteina B-100
catalizzati da differenti enzimi (x, y, z); mutazioni in uno qualunque dei tre
che media il legame della
geni, che inattivano uno dei tre enzimi portano tutte, come esito finale, al
particella LDL al recettore.
blocco della via e alla mancata produzione dello stesso metabolita.
2.5 Pleiotropia
Questo concetto sta a indicare che un solo gene può essere responsabile di fenotipi diversi. Un esempio di
pleiotropia nell’uomo è quello dell’anemia falciforme, una malattia caratterizzata da diversi sintomi a
carico di organi e tessuti diversi. Questi possibili effetti fenotipici derivano tutti dall’azione di un solo
allele mutato presente in omozigosi. L’effetto
diretto dell’allele dell’anemia falciforme è
quello di indurre i globuli rossi a produrre
molecole anomale di emoglobina che tendono
a unirsi fra loro e cristallizzare. Di
conseguenza, i globuli rossi si deformano,
assumendo forme a falce con contorni
frastagliati, sono più fragili e lisano e tendono
ad aggregarsi e a occludere i capillari. Tutto
questo produce molteplici danni a carico di
organi e tessuti diversi (Fig 2.4).
Fig.2.4. La mutazione che causa l’anemia falciforme determina una
cascata di effetti fenotipici a livello cellulare e di interi organi.
10
3. I polimorfismi di restrizione (RFLP) e il loro utilizzo nella diagnostica delle
malattie genetiche
3.1 Gli enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione (ER) riconoscono una sequenza di nucleotidi nella doppia elica del DNA e
tagliano il DNA in frammenti di lunghezza definita (Tab.3.1). Sono enzimi prodotti dai batteri che li
utilizzano per difendersi dagli attacchi di un DNA estraneo, per esempio di un virus (Fig.3.1). Sono stati
fino ad ora purificati più di 1000 enzimi di restrizione prodotti da altrettanti tipi di batteri diversi.
coesive
Tab 3.1 Gli enzimi di
restrizione si indicano con un
sistema di lettere e numeri che
si riferisce al ceppo batterico da
cui sono stati isolati. Sono
mostrati alcuni esempi di
enzimi di restrizione, le
sequenze di DNA che questi
tagliano e i prodotti di
scissione.
Alcuni
enzimi
tagliano le sequenze in modo da
dare origine ad estremità
coesive, altri effettuano un
taglio
che
determina
la
formazione di estremità piatte.
Il DNA endogeno viene protetto dall’aggiunta di gruppi metile (-CH3) ai residui di adenina e citosina
(Fig.3.1). Dal punto di vista biochimico gli ER sono delle endo-desossi-ribonucleasi che scindono un
legame fosfodiesterico. Gli ER si possono
suddividere in varie classi a seconda della specificità
e della modalità di taglio; ER diversi riconoscono e
tagliano, in linea di massima, sequenze diverse; uno
stesso enzima taglia qualsiasi tipo di DNA dovunque
trovi la propria sequenza di riconoscimento, detta
sito di restrizione. I siti di restrizione sono sequenze
palindromiche (cioè che possono essere lete in
entrambe le direzioni, come le parole ANNA, ETNA
GIGANTE …) di poche (in genere 4, 5 o 6) coppie
di nucleotidi.
Gli ER sono uno strumento fondamentale per
l’analisi del DNA.
Fig. 3.1 I batteri producono enzimi di restrizione per
difendersi dagli attacchi di DNA esogeno, per
esempio DNA fagico. Altri enzimi (metilasi)
proteggono il DNA batterico dall’azione delle
proprie endonucleasi di restrizione.
A causa del tipo di sequenze riconosciute (sequenze
palindromiche) e della loro modalità di taglio (la
maggior parte degli ER fa un taglio asimmetrico),
tagliando due DNA diversi con uno stesso enzima
si mettono allo scoperto le stesse sequenze
nucleotidiche, si generano cioè le stesse estremità
(estremità adesive o coesive) nei due tipi di
molecole. Questo permette di costruire molecole di
DNA ricombinante (Fig.3.2)
11
Fig 3.2 Costruzione di una molecola di DNA
ricombinante a partire da due molecole di
DNA (una bianca e una nera) provenienti da
fonti diverse ed entrambe tagliate con lo
stesso enzima di restrizione EcoRI.
3.2 Polimorfismi del DNA
Il termine polimorfismo significa “esistenza di forme diverse”. In genetica, il polimorfismo può essere
analizzato a livello di proteina (polimorfismo proteico) oppure di materiale genetico (polimorfismo
genetico). In questo secondo caso, le forme diverse (ossia le varianti genetiche) possono riguardare un
gene, vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina (polimorfismo allelico), oppure un tratto di
DNA non codificante (polimorfismo di sequenza).
polimorfismo proteico
Polimorfismo
polimorfismo allelico
polimorfismo genetico
polimorfismo di sequenza
3.3 Polimorfismi di sequenza del DNA
E’ stato osservato che il DNA di due individui differisce per circa un nucleotide ogni 500/1000. Queste
diversità di sequenza si definiscono polimorfismi e dato che >98% del DNA umano è DNA non
codificante, e che quindi la maggior parte di queste differenze è localizzata in sequenze non codificanti, il
fenotipo di un polimorfismo di sequenza del DNA non è riconoscibile dall’esterno (come nel caso, ad
esempio, dell’albinismo, o individuabile biochimicamente, come per i gruppi sanguigni). Dato l‘elevato
numero di loci polimorfici (1 coppia di basi ogni 500/1000), i polimorfismi di sequenza del DNA sono
molto più frequenti dei polimorfismi allelici tradizionali (albinismo, gruppi sanguigni, alleli della
determinazione del colore degli occhi, etc, etc…) e conseguentemente più utili nella ricerca biologica e
medica.
3.4 I polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)
Quando un polimorfismo interessa una sequenza riconosciuta da un dato ER, la variazione, creando o
distruggendo siti di restrizione, darà luogo a differenze nei siti di taglio di quel dato enzima all’interno
della popolazione. Digerendo il DNA di individui diversi con quell’enzima, si osserva quindi un
polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP, che per semplicità si usa leggere RIFLIP),
e cioè dal DNA di individui diversi si generano frammenti di restrizione diversi.
Come tutti i polimorfismi, i RFLP sono ereditabili come caratteri mendeliani semplici (Fig. 3.3) e sono
trasmessi come caratteri codominanti. Il fenotipo di un RFLP è evidenziabile in termini di differenze di
numero e/o dimensione dei frammenti di DNA ottenuti dalla digestione con un certo enzima di
restrizione. I frammenti sono visibili dopo migrazione elettroforetica su un gel (Fig. 3.3 in basso).
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Fig. 3.3 Sono mostrati due frammenti di restrizione ottenuti con digestione con l’enzima EcoRI (E = sito di
restrizione di EcoRI) di due alleli (1
e 2) di un gene. L’allele 1 è
interrotto da un sito di taglio per
l’enzima EcoRI (GAATTC), l’allele
2, a causa di una mutazione di una
singola base, non presenta il sito di
taglio (GACTTC). Trattando questi
due alleli con l’enzima di
restrizione EcoRI, si otterranno
segmenti di lunghezza diversa: due
segmenti (350 e 150 bp) nel caso
dell’allele 1 e un solo segmento
non tagliato (500 bp, 350 + 150) nel
caso dell’allele 2. Negli individui
eterozigoti sono presenti entrambi
gli alleli e quindi si evidenzieranno
tutti e tre i segmenti.
Nella parte in basso della figura è
mostrato un pedigree di una
famiglia e sotto il simbolo dei
singoli individui è indicato il
genotipo relativamente agli alleli 1
e 2. Dal pedigree mostrato si
capisce come i RFLP abbiano ereditarietà mendeliana semplice e siano codominanti. Nel caso osservato, una coppia
eterozigote ha una figlia omozigote per l’allele 1 e un figlio omozigote per l’allele 2. Quando il DNA dei genitori e
dei figli è digerito con l’enzima di restrizione EcoRI e i frammenti di DNA vengono separati mediante corsa
elettroforetica, il DNA dei genitori eterozigoti mostrano 3 bande corrispondenti a frammenti da 500, 350 e da 150
bp; la figlia omozigote 1/1 mostra 2 bande corrispondenti a frammenti da 350 e 150 bp; il figlio omozigote 2/2
mostra una sola banda da 500 bp.
3.4.1 La tecnica della PCR per l’analisi degli RFLP
L’introduzione della PCR, la tecnica che consente di amplificare selettivamente un tratto di DNA, ha
rivoluzionato la genetica molecolare. (Per la descrizione della tecnica, vedere più avanti al § 5.1).
Le applicazioni della PCR sono praticamente infinite. Uno degli ambiti di utilizzo è la diagnosi di
malattie genetiche mediante analisi dei RFLP. L’utilizzo della PCR semplifica molto le cose. Ad esempio,
la PCR consente di analizzare uno specifico tratto di DNA, invece di dover lavorare su tutto il DNA
nucleare di una cellula, ossia sul DNA genomico.
Come è illustrato nella Fig. 3.4, i primer (inneschi) della PCR vengono disegnati a monte e a valle del
sito di restrizione. Il segmento di DNA amplificato viene sottoposto a digestione con l’enzima di
restrizione e i prodotti della digestione vengono analizzati dopo separazione elettroforetica.
Fig.3.4 I primer della PCR
vengono disegnati a monte e a
valle del sito di restrizione (sito di
taglio dell’ER, cut site). Dopo
l’amplificazione, il DNA viene
digerito
con
l’enzima
di
restrizione e i frammenti di DNA
vengono separati mediante corsa
elettroforetica. Gli omozigoti e gli
eterozigoti sono distinguibili in
base alle diverse bande ottenute
dalla digestione con l’ER. Gli
omozigoti 1/1 e 2/2 daranno
rispettivamente due bande e 1
banda; gli eterozigoti daranno 3
bande.
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3.5 I polimorfismi di restrizione (RFLP) nella diagnosi delle malattie genetiche
3.5.1 Utilizzo di un RFLP nella diagnosi diretta. Diagnosi di anemia falciforme
Gli individui affetti da anemia falciforme sono omozigoti per la mutazione HbS, che consiste nella
sostituzione di un singolo amminoacido dei 146 che formano la catena dell’emoglobina.
Nell’emoglobina HbS, l’acido glutammico (Glu) nella sesta posizione della catena è sostituito dalla
valina (Val). La sostituzione amminoacidica è dovuta alla mutazione A T nella posizione mediana del
codone 6 (Fig. 3.5).
La sostituzione che converte il codone GAG (acido glutammico) nel codone GTG (valina) modifica la
sequenza CCTGAGG (che interessa i codoni 5, 6 e 7) riconosciuta e tagliata dall’enzima di
restrizione MstII. Gli individui omozigoti ed eterozigoti sono distinguibili in base al tipo di
bande ottenute dal loro DNA dopo digestione con l’enzima MstII (Fig. 3.5, in basso).
Fig. 3.5 La figura mostra l’enzima di
restrizione Mst II che riconosce e taglia
la sequenza CCTGAGG. Il DNA
dell’allele A viene tagliato dall’enzima
di restrizione. Una mutazione di una
singola base fa perdere il sito di taglio
dell’enzima MstII e il DNA dell’allele S
non viene tagliato dall’enzima. Nella
parte bassa della figura si vede il
risultato della corsa elettroforetica
relativa ai DNA di un individuo normale,
di un portatore sano e di un individuo
affetto amplificati con PCR (utilizzando
i primer indicati dalle frecce orizzontali)
e successivamente digeriti con l’enzima
MstII. L’individuo normale (A A)
mostra 2 bande, il portatore sano (A S)
mostra 3 bande e l’individuo affetto (S
S) mostra una sola banda di lunghezza
corrispondente al DNA non tagliato.
In questo caso specifico, la stessa mutazione che causa la malattia altera anche un sito di restrizione. La
semplice digestione con l’enzima di restrizione rilevante consente di fare diagnosi diretta di malattia e di
riconoscere i portatori (Fig. 3.5 e 3.6).
Fig.3.6. E’ mostrato il pedigree di una
famiglia in cui soltanto il figlio 1 è
affetto da anemia falciforme. Entrambi
i genitori sono eterozigoti e per questo
motivo hanno avuto un figlio malato.
Le bande elettroforetiche per ogni
membro della famiglia (visibili al di
sotto di ognuno) consentono di
identificare il genotipo di ogni
individuo (vedere legenda Fig.3.3 e
3.5).
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3.5.2 Utilizzo di un RFLP nella diagnosi indiretta. Ricerca di un RFLP associato a un allelemalattia
A differenza di quello che avviene nel caso dell’anemia falciforme, la maggior parte delle malattie
genetiche sono dovute a numerose mutazioni diverse dello stesso gene (eterogeneità genetica, vedere pag.
10). In questo caso la mutazione responsabile della malattia non corrisponde a un unico polimorfismo di
sequenza (e quindi a un unico eventuale RFLP).
In questi casi non è quindi possibile utilizzare un RFLP per la diagnosi diretta. E’ invece possibile trovare
uno o più RFLP associati al gene-malattia (in quanto localizzati all’interno o nelle vicinanze del gene) che
possono essere utilizzati per la diagnosi: si tratta in questo caso di diagnosi indiretta per associazione e
non di diagnosi diretta.
Per poter utilizzare il RFLP come marcatore occorre che il gene responsabile della malattia sia collocato
così vicino al RFLP che quest’ultimo possa rivelare la presenza stessa del gene malato.
Un particolare RFLP può essere associato in alcuni individui con l’allele–malattia ed in altri con l’allele
sano. Pertanto, per poter utilizzare un RFLP nella diagnosi indiretta, è necessario esaminare non soltanto
il DNA del malato ma il maggior numero possibile di membri della famiglia per identificare il tipo di
associazione presente in quel pedigree (Fig. 3.7).
L’importanza dei RFLP come marcatori genetici di associazione sta nel fatto che consentono la diagnosi
di malattia anche in casi in cui non è noto il gene responsabile. I marcatori RFLP (nel genoma umano
sono stati identificati migliaia di RFLP e diverse centinaia sono stati assegnati a ciascun cromosoma)
hanno consentito la mappatura di alcuni importanti geni-malattia (ad esempio, è stato possibile assegnare
il gene della fibrosi cistica in posizione distale del braccio lungo del cromosoma 7).
A differenza della diagnosi diretta, l’accuratezza della diagnosi per associazione è del 100% solo quando
il locus malattia e il RFLP sono strettamente associati (vicini sul cromosoma). In questo caso, infatti la
frequenza di crossing-over che può modificare l’associazione è trascurabile. Tanto maggiore è la distanza
tra il RFLP e il locus genico di interesse, tanto più bassa è la probabilità di una diagnosi accurata.
Un secondo aspetto da prendere in considerazione è che non sempre un dato RFLP può essere utilizzato ai
fini della diagnosi indiretta. E’ necessario che nella famiglia siano presenti i due alleli (se tutti gli
individui della famiglia sono portatori dello stesso allele del RFLP studiare quel RFLP in quella famiglia
non è significativo!).
I
1
2
3
4
II
1
2
III
MW
1
2
3
1
1
4
5
6
7
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Fig.3.7 Il pedigree mostra l’ereditarietà di un marcatore RFLP attraverso tre generazioni di una famiglia in cui
è presente una malattia recessiva legata al cromosoma X. Nella famiglia sono presenti gli alleli (+) e (-). Tutti
gli individui malati sono maschi che presentano l’allele (+). Tutti gli individui portatori dell’allele (-) sono
sani; si può dedurre che l’allele malattia sia strettamente associato all’allele (+) di questo RFLP. Sia la madre
(II 1) che la nonna I 1 sono eterozigoti portatrici sane in cui l’allele (+) è associato all’allele malattia. L’allele
(-) del RFLP è associato all’allele sano del gene malattia come dimostrato da I 2, III 5, III 6 e III 7.
L’accuratezza della diagnosi dipende dal grado di associazione dei due loci. Se il marcatore e il locus malattia
non sono strettamente associati, il crossing-over durante la formazione dei gameti potrebbe modificare
l’associazione e un individuo portatore dell’allele (+) del RFLP non sarebbe portatore dell’allele malattia.
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