METODO NAZIONALE STANDARD
REAL-TIME RT-PCR EUROPEA
PER VIRUS INFLUENZALI A H5
VSOP 46
Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training
Centre for Infections
REAL-TIME RT-PCR EUROPEA PER VIRUS INFLUENZALI A H5
Revisione no: 2 Data di revisione 12.05.09 Emesso da Standards Units, Department for Evaluations, Standards & Training
Riferimento no: VSOP 46i2
Questo MNS deve essere usato congiuntamente con gli altri MNS emessi dalla Health Protection
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STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD
I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee
guida, promuovono l’adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di
confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la
standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello
stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono
ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute
pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in
considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono
inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo.
I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di
consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i
documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi.
I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima
pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L’inclusione del
logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di
preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato
allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano
necessariamente quelle dell’organizzazione di cui sono membri. L’elenco attuale delle organizzazioni
professionali partecipanti può essere ottenuto tramite e-mail all’indirizzo [email protected].
Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione,
procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste
siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di
controllo di qualità interno ed esterno.
Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa
pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere
ritenuta responsabile dell’accuratezza o dell’utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall’uso o da
modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente
come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno
Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano
modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al
documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza.
La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione.
Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori
informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk
La HPA è un’organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott.
Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di
informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in
condizioni di sicurezza1.
Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web www.evaluations-standards.org.uk. Contributi
allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l’indirizzo [email protected].
Si informa il lettore che la tassonomia completa di questo documento è aggiornata al momento della
pubblicazione.
Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference
Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager;
la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente.
Riferimento suggerito per questo documento:
Health Protection Agency (2009). European Real-Time RT-PCR for Influenza A H5 viruses. National
Standard Method VSOP 46 Emissione 2 http://www.hpa-standardmethods.org.uk/ pdf_sops.asp
REAL-TIME RT-PCR EUROPEA PER VIRUS INFLUENZALI A H5
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INDICE
STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD ................................................................................
2
INDICE ...............................................................................................................................................
3
PROCEDURA DI MODIFICA ............................................................................................................
4
INTRODUZIONE ................................................................................................................................
5
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .............................................................................
6
1.1 RACCOLTA DEL CAMPIONE……………………………………….………..……………………….…
1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE …………….……..…..…………………………....
1.3 PROCEDURA ANALITICA SUL CAMPIONE ………................…………………………………..……
6
6
6
PRELIEVO DEL CAMPIONE ................................................................................................
6
2.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA …………………………………..……………
6
3
STRUMENTAZIONE ............................................................................................................
6
4
REAGENTI ….........................................................................................................................
6
5
PROCEDURA .......................................................................................................................
7
6
LABORATORIO DDI RIFERIMENTO …………………………………………………………....
8
7
SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI NAZIONALI E CENTRE FOR
INFECTIONS) …………………………………………………………………………..…………..
8
8
CONTATTI …………………………………………………………………………………………..
8
APPENDICE 1. ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO PER PCR ……………….…….....……………….
9
7 APPENDICE 2. RICERCA DI EMAGGLUTININA H5 DI INFLUENZA A CON SAGGIO
EUROPEO DI REAL-TIME RT-PCR (TAQMAN) ...............................................................................
10
BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................
11
2
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PROCEDURA DI MODIFICA
Documento di riferimento
controllato
Titolo del documento
controllato
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Real-Time RT-PCR Europea per virus influenzali A H5
Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche
di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
[email protected].
Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun
documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio.
Modifica
Numero/
Data
2/
12.05.2009
Emissione
no.
Scartata
1.2
Pagina
Inserita
Emissione
no.
2
Sessione(i)
interessate
Modifica
Tutte
Modificato nome
Dipartimento da ESL a
DEST
2
Stato dei MNS
Inserita informazione per
la tassonomia
5
Introduzione
Aggiornata valutazione
informativa
7
Procedura
ERNVL aggiornato a Cfi
8
Contatti
Aggiornati
Tutte
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PER VIRUS INFLUENZALI A H5
Questi protocolli non devono essere divulgati ed i risultati ottenuti con questi saggi
non possono essere pubblicati o presentati in riunioni pubbliche senza l’esplicito
consenso del Respiratory Virus Unit, Centre for Infections.
Tipo di campione:
Campioni respiratori
Tamponi Nasali e Faringei
Aspirati Naso-faringei
Lavaggio Broncoalveolare
Aspirato Endotracheale
Espettorato
INTRODUZIONE
Scopo
Questo Metodo Nazionale Standard descrive un saggio real-time one-step RT-PCR utilizzato per la
ricerca dei virus influenzali A H5 in campioni clinici (secrezioni respiratorie). Le sequenze dei primer e
deI probe sono state dapprima descritte da Yves Thomas (National Centre for Influenza, Central
Laboratory of Virology, University Hospital of Geneva, Switzerland); la sequenza del probe è stata
successivamente modificata da Terry Collins (NHS Greater Glasgow. North Glasgow University
Hospitals Division, West of Scotland Specialist Virology Centre)2-4.
Il saggio più sensibile per la diagnosi differenziale dei virus influenzali A H5 nei campioni clinici è la
ricerca specifica con RT-PCR per il rilievo dell’RNA virale. Questo saggio utilizza primer ed un probe
specifici solo per i virus influenzali A H5, differenziandoli dagli altri patogeni respiratori. I Primer ed il
probe, descritti in modo dettagliato in questo MNS, sono stati saggiati con un ampia selezione di virus
influenzali A H5 umani ed aviari, includendo ceppi di virus influenzali A H5 recenti, isolati dal 2004 al
2008. Nel corso della valutazione si è notato che il saggio ha presentato ridotta sensibilità per i virus
Influenza H5N3 isolati recentemente in Europa, e pertanto questo metodo non è considerato ottimale
per la ricerca di questi virus.
Il documento descrive le procedure per l’esecuzione one-step di una RT-PCR (reverse transcription
and amplification – trascrizione inversa ed amplificazione, eseguita in una sola provetta) con primer
specifici ed un probe per i virus influenzali A H5 (i primer ed il probe sono specifici per il gene
emoagglutinina dei virus influenzali A H5). Il rilievo dell’amplificazione è ottenuto monitorando
l’incremento della fluorescenza durante la reazione di PCR.
Abbreviazioni:
RT
PCR
=
=
Reverse Transcription
Polymerase Chain Reaction
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1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA5-10
1.1 Raccolta del campione
Appropriato contrassegno per identificazione del rischio secondo le procedure locali.
1.2 Trasporto e Conservazione del campione
E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto.
Usare un sistema di trasporto per virus idoneo (ove richiesto) ed inserire il campione in
contenitore o sacchetto di plastica chiuso.
Appropriato contrassegno per identificazione del rischio secondo le procedure locali.
1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE
Tutte le manipolazioni su materiale clinico proveniente da un paziente con sospetta influenza
aviaria devono essere eseguite in ambiente con livello di contenimento 3 (CL3) all’interno di
cabine di sicurezza di classe I/classe III. Dopo avere aggiunto il materiale clinico al tampone di
lisi utilizzato per la procedura di estrazione, la successiva estrazione dell’acido nucleico può
essere eseguita in CL2. *Consultare - Informazioni utili per la scelta del metodo di estrazione.
Buona pratica di laboratorio
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale
e la valutazione del rischio
PPE (personal protective equipment – abbigliamento di protezione personale) deve essere
sempre indossato
2 PRELIEVO DEL CAMPIONE
2.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA
Il campione deve essere processato il più presto possibile. In teoria, i sistemi di trasporto devono
garantire l’arrivo del campione in laboratorio entro 24 ore.
3 STRUMENTAZIONE
ABI Prism Real-time thermal cycler/Sequence Detection System (Applied Biosystems)
Microcentrifuga picofuge
Strisce di provette da 0.2 mL con tappo o piastre sigillate a 96 pozzetti (Applied Biosystems)
Pipette con puntali monouso con filtro
4 REAGENTI
SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System (Cat No. 11732-020; 11732088) contenente; SuperScript III One-Step RT/Platinum Taq mix, 2x Reaction mix (tampone
contenente 0.4mM di dNTP e 6mM MgSO4), ROX Reference Dye.
Forward e reverse PCR primers (10pmol/µL working stock) (MWG):
H5VietFor: 5’- GGA TGG CAG GGA ATG GTA GA 3’
H5VietRev: 5’- TCT ATT GCC TTT TGA GTG GAT TCT T 3’
TaqMan minor groove binder probe (5µM working stock):
H5VietProbe: 5’FAM-TGG GTA CCA CCA TAG CAA YGA GCA GG- MGBNFQ 3’ (Applied
Biosystems) *Consultare informazioni utili.
Water (DNase- and RNase-free) (Promega)
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5
PROCEDURA
5.1
Estrarre 150µL di campione con metodo Boom (Appendice 1) o con robot per estrazione
MagNAPure (consultare la VSOP 36 – Operation of the Roche MagNA Pure LC automated
nucleic acid extraction robot). *Consultare - Informazioni utili.
Virus di controllo = Influenza A H5N3 A/Duck/Singapore/3/97 virus. Disponibile presso il CfI;
consultare Sezione 8 Contatti. Il materiale di controllo è stato preparato in aliquote da 600µL di
virus in 200µL di tampone di lisi. Un’aliquota di 200µL di questa miscela di controllo inattivata
virus/tampone di lisi deve essere estratta come specificato al punto 5.1. Il controllo dell’RNA
virale è eluito in 100µL di acqua. *Consultare - Informazioni utili.
5.2
Preparare una master mix su ghiaccio con tutti i componenti della reazione, ad eccezione del
templato di RNA virale:
RT- PCR mastermix, ad esempio per 10 reazioni:
5uL SuperScript III RT/Platinum Taq Mix
125µL 2x Reaction Mix
5µL H5VietFor primer
5µL H5VietRev primer
5µL H5VietProbe
5µL ROX Reference dye
5.3
Aliquotare 15µL per provetta o in pozzetto di piastra.
5.4
Aggiungere 10µL di templato RNA preparato al punto 5.1 a ciascuna provetta / pozzetto in
piastra, chiudere con tappo o sigillare.
5.5
Inserire in ABI Prism real-time thermal cycler, selezionare come rilevatore ‘FAM No Quencher’,
deselezionare il 9600 emulation checkbox (se questo è inserito in modo predefinito come inserito
/ selezionato), ed usare il seguente protocollo di ciclo;
5.5.1 Incubare a 50°C per 15 minuti (trascrizione inversa)
5.5.2 Incubare a 95°C per 2 minuti
5.5.3 Incubare a 95°C per 15 sec
5.5.4 Incubare a 60°C per 30 sec (a questo punto prelevare i dati)
5.5.5 Ripetere i punti 5.5.3 e 5.5.4 altre 39 volte
5.6
Al termine della corsa controllare che siano corretti i setting di default ‘ciclo d’inizio e di fine’ e
resettare, se richiesto. Se necessario, regolare il valore della soglia spostandola sopra il valore di
fluorescenza rilevato nei controlli negativi. Selezionare l’analisi per calcolare i valori dei Ct (ciclo
soglia) per campioni e controlli positivi. (Consultare Allegato 2).
*INFORMAZIONI UTILI
In funzione del materiale disponibile, eseguire le reazioni dei campioni e dei controlli in duplicato
o triplicato.
Ogni laboratorio deve elaborare una valutazione del rischio sul campione(i) da analizzare che si
ritiene possa contenere virus Influenza A H5 prima della suddivisione in aliquote per l’estrazione
con tampone di lisi. Il rapporto tampone di lisi e campione è minore nell’estrazione eseguita con
MagNAPure rispetto a quella manuale di Boom. Un rapporto più ridotto fra tampone di lisi e
campione può non essere sufficiente ad inattivare i virus influenzali A H5.
Dopo la rimozione dell’RNA templato per il saggio one-spep, il rimanente è utilizzato per formare
cDNA da utilizzare nel saggio RT-PCR two-step.
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Può essere utilizzato il 6FAM-BHQ probe (Operon Biotechnologies) in sostituzione del probe
6FAM-MGB. Se si utilizza il probe 6FAM-BHQ, selezionare come detector 6FAM-BHQ al posto
del 6FAM-MGB.
6
LABORATORIO DI RIFERIMENTO
Inviare i campioni positivi per Influenza A al Respiratory Virus Unit, CfI, Colindale.
7
SEGNALAZIONE ALLA HPA11 (LOCALE ED AI
SERVIZI NAZIONALI ED AL CENTRO PER LE
INFEZIONI)
Ogni risultato positivo per infezione causata da questo microrganismo deve essere
immediatamente segnalata per garantire che sia intrapreso un appropriato intervento per la tutela
della salute pubblica.
La linea guida sulla procedura attuale di refertazione di questa infezione è disponibile sul sito web
dell’HPA www.hpa.org.uk. Qualsiasi richiesta sulla procedura di refertazione, o di qualsiasi altra
condizione inerente problemi di salute pubblica, deve essere discusso in prima istanza con la
locale Health Protection Unit (HPU).
8
CONTATTI
Dr Joanna Ellis – Clinical Scientist, Respiratory Virus Unit, Virus Reference Department, HPA,
Centre for Infections, Colindale, London NW9 5HT.
Tel: 020 8327 6239
Email : [email protected]
Dr Alison Bermingham – Clinical Scientist, Respiratory Virus Unit, Virus Reference Department,
HPA, Centre for Infections, Colindale, London NW9 5HT.
Tel: 020 8327 7429
Email : [email protected]
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APPENDICE 1. ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO PER PCR
A1.1
REAGENTI
Tampone L6
Tampone L2
Sospensione di silice
Etanolo (70%)
Acetone
RNase-free water
RNasin (40,000U/mL)
A1.2
PROCEDURA
A1.2.1 Aggiungere 150µL di campione a 840µL di tampone L6, in una provetta da 1.5mL *Consultare Informazioni utili.
A1.2.2 Aggiungere 10µL di sospensione di silice.
A1.2.3 Passare su Vortex per 5 secondi, mettere poi su agitatore a temperature ambiente per 10 minuti
A1.2.4 Centrifugare per 15 secondi, scartare il sopranatante
A1.2.5 Aggiungere 1mL di tampone L2, passare su vortex, centrifugare per 15 secondi e scartare il
sopranatante
A1.2.6 Ripetere A1.2.5
A1.2.7 Ripetere A1.2.5 con etanolo 70% al posto di tampone L2, due volte
A1.2.8 Ripetere A1.2.5 con acetone al posto di etanolo, una volta
A1.2.9 Asciugare i campioni per 10 minuti a 56°C, con coperchi apertI
A1.2.10 Aggiungere 30µL di RNase-free water contenente 1µL di RNasin e passare su vortex per 5
secondi.
A1.2.11 Eluire l’acido nucleico a 56°C per 10 minuti
A1.2.12 Passare su vortex e centrifugare per 5 minuti
A1.2.13 Raccogliere l’eluato con attenzione, non contaminare con silice
NOTA TECNICA
I residui di silice trasferiti alla fase successiva possono inibire l’attività della trascrittasi inversa.
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8.0 ALLEGATO 2. RICERCA DI EMAGGLUTININA
H5 DI INFLUENZA A CON SAGGIO EUROPEO
REAL-TIME PCR-RT (TAQMAN)
A/Duck/Singapore/3/97 Diluizioni scalari in base 10
Virus influenzali A H5
A/Duck/Singapore/3/97
A/Vietnam/1203/2004
A/Indonesia/6/2005
A/Turkey/Turkey/1194/2005
A/QAV/2005
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BIBLIOGRAFIA
1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December 1997.
2. Thomas YKLWW. Real-time H5 Protocol. (ELP04-2005) EISS Laboratory Protocol Library 2006.
3. Real-time detection of H5 influenza virus RNA. (SOP MID 101/01) NHS Greater Glasgow North
Glasgow University Hospitals Division, West of Scotland Specalist Virology Centre 2006.
4. VSOP 41 - Real-time RT-PCR (TaqMan) for Influenza A H5 Viruses. Health Protection Agency
2009.
5. Advisory Committee on Dangerous Pathogens 2004 Approved List of Biological Agents.
http://www.hse.gov.uk/pubns/misc208.pdf. p. 1-17.
6. Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety
Precautions: Notes for Guidance. 4th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); 1993.
7. Control of Substances Hazardous to Health Regulations 2002. General COSHH. Approved Code
of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; 2002.
8. Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and
healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; 2002.
9. Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in
health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; 2002.
10. Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service laboratories. Safe working and the
prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2nd ed. Suffolk: HSE Books;
2003.
11. Health Protection Agency. Laboratory reporting to the Health Protection Agency. Guide for
diagnostic laboratories. 2008.
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