SOCIETA’ DI RICERCA INDUSTRIALE AVANZATA
Relazione tecnica
Progetto “Sistema Multisensore per il monitoraggio dei
processi fermentativi nella produzione di formaggi tipici
regionali”
Progetto PROBIO, Fondi Europei di Sviluppo Regionale (FESR)
Introduzione
Il progetto prevede la realizzazione di un sistema sensoristico per il monitoraggio di un
processo di biofermentazione per la produzione di starter microbici del processo di maturazione
del formaggio.
E’ stata svolta quindi una parte di lavoro prettamente microbiologica, in cui sono stati
isolati, caratterizzati e coltivati dei Lattobacilli. E’ stato anche allestito un piccolo fermentatore da
laboratorio.
Sono poi stati messi a punto dei saggi enzimatici spettrofotometrici per la determinazione
di alcuni analiti utili per il monitoraggio della crescita batterica e sono state effettuate misure su
campioni di colture. I saggi enzimatici sono serviti da guida per la messa a punto delle
corrispondenti misure elettrochimiche.
Sono stati realizzati e caratterizzati, degli elettrodi mediante la tecnica screen-printing.
Questi elettrodi sono stati utilizzati per misure statiche e in flusso.
E’ stato progettato e realizzato un sistema di misura in flow-injection; in particolare è stata
costruita una cella di misura in flusso per gli elettrodi serigrafati e un strumento che pilota delle
elettrovalvole per il controllo del prelievo e dell’inizione di campioni direttamente dal
fermentatore.
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Direzione e Sede Legale: via A. Moro n. 15 – 57033 Marciana Marina (Li) Tel. ++39-0565-904461-3 Facs ++39-0565-904447
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Isolamento, caratterizzazione e coltura di microorganismi
I microorganismi utilizzati nella ricerca sono stati isolati dal prodotto commerciale
Actimel Danone. Un’ansata di prodotto è stata seminata su piastra di terreno solido MRS Agar
(vedi Tabella 1) e incubata a 37°C in condizioni di microaerofilia per 48 ore.
Tabella 1: Composizione dei mezzi di coltura
MRS Agara , Fluka cod. N° 69964
Universal peptone
10 g/l
Estratto di carne
5 g/l
Estratto di lievito
5 g/l
D(+)-Glucosio
20 g/l
Dipotassio idrogeno fosfato
2 g/l
Diammonio idrogeno citrato
2 g/l
Acetato di sodio
5 g/l
Solfato di magnesio
0.1 g/l
Solfato di manganese
0.05 g/l
Agar
12 g/l
a
MRS Broth, Fluka cod. N° 69966
Peptone
Estratto di carne
Estratto di lievito
D(+)-Glucosio
Dipotassio idrogeno fosfato
Triammonio citrato
Acetato di sodio triidrato
Solfato di magnesio eptaidrato
Solfato di manganese tetraidrato
10 g/l
8 g/l
4 g/l
20 g/l
2 g/l
2 g/l
5 g/l
0.2 g/l
0.05 g/l
pH finale a 37°C 6.5+0.2
Le colonie ottenute sono state osservate al microscopio previa colorazione di Gram
secondo la seguente procedura:
Ä immersione per 1 min. in soluzione di Cristal violetto
Ä risciacquo con acqua bidistillata
Ä immersione per 1 min. in soluzione Lugol
Ä risciacquo con acqua bidistillata
Ä immersione per 1 min. in soluzione decolorante
Ä risciacquo con acqua bidistillata
Ä immersione per 1 min. in soluzione di Safranina
Ä risciacquo con acqua bidistillata
I microorganismi sono risultati positivi alla colorazione di Gram, di aspetto bastoncellare,
confermando così la loro appartenenza al genere Lactobacillus, in particolare Lactobacillus casei.
Un’ansata di batteri viene seminata in terreno liquido, nel nostro caso abbiamo utilizzato MRS
Broth (vedi Tabella 1), e incubato per 24 ore a 37°C.
La coltura che ne è risultata è stata la base per allestire una serie di tubi contenenti diluizione
scalari in base dieci delle quali ne è stata piastrata una quantità pari a 100 µl su terreno MRS agar.
Di ogni diluizione sono state effettuate tre repliche.
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Fig. 1 Schema esemplificativo della conta di cellule per ml eseguita mediante semina su terreno
solido, per correlare la concentrazione delle sospensioni cellulari con le misure
spettrofotometriche di torbidità.
Parallelamente, di ogni diluizione è stata effettuata una lettura allo spettrofotomentro utilizzando
luce a lunghezza d’onda pari a 600nm.
A 48 ore dalla semina, ogni piastra è stata esaminata per verificare il numero delle U.F.C. (Unità
Formanti Colonie) presenti ad ogni diluizione e questi risultati sono stati correlati alle letture
spettrofotometriche effettuate precedentemente (al momento della semina).
I risultati hanno permesso di costruire una retta di calibrazione che è stata poi successivamente
utilizzata per risalire alla concentrazione delle colture liquide dalla semplice misura
spettrofotometrica.
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1
600
0.6
A
0.8
0.4
0.2
0
0.E+00
1.E+09
2.E+09
3.E+09
4.E+09
5.E+09
6.E+09
n° batteri/ml
Fig.2. Retta di calibrazione che correla la concentrazione di cellule batteriche all’assorbimento a
600 nm.
Negli esperimenti successivi, si è proceduto al monitoraggio della crescita batterica
mediante lettura spettrofotometrica di campioni prelevati a vari tempi dall'inoculo. Diverse colture
sono state allestite con inoculi differenti per mettere a punto le migliori condizioni sperimentali
per seguire l'evoluzione della modificazione biochimica del mezzo di coltura. In generale è stato
comunque osservato che la velocità massima di replicazione raggiunta in MRS Broth, a 37°C, in
condizioni di microaereofilia è di una divisione ogni 70 minuti. La crescita si arresta quando la
sospensione cellulare raggiunge la concentrazione di circa 6 x 1010 cell/ml.
7.00E+09
6.00E+09
cellule/ml
5.00E+09
4.00E+09
3.00E+09
2.00E+09
1.00E+09
0.00E+00
0
5
10
15
20
tempo, ore
25
30
Fig.3. Esempio di curva di crescita di una coltura di Lactobacillus casei in MRS Broth.
L'inoculo iniziale era di 5.54 x 104 cell/ml.
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E’ stato allestito un piccolo bioreattore da laboratorio con un volume di lavoro di 500 ml.
E’ dotato di un sistema di termostatazione costituito da una sonda di temperatura interna collegata
ad una piastra riscaldante/agitatore magnetico e di un sistema di aereazione costituito da un albero
rotante con sparger, connesso a due ancorette magnetiche. Il coperchio a tenuta è dotato di diverse
connessioni utilizzabili per inoculi e prelievi. Sono stati predisposti dei tubi per il prelievo di
aliquote di terreno da analizzare dotati di filtri per garantire la sterilità durante la crescita batterica.
Fig. 4 Fermentatore da laboratorio.
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Misura spettrofotometrica di analiti nel mezzo di coltura prima e dopo la
crescita batterica.
L'analita che meglio si presta come indice della crescita di Lattobacilli è l'acido lattico, in
quanto viene prodotto in notevole concentrazione da questi microorganismi. La misura
spettrofotometrica dell'acido lattico, necessaria nel corso di questa ricerca come riscontro e linea
guida per la messa a punto delle misure elettrochimiche, può essere effettuata in vari modi.
L'enzima lattico deidrogenasi (LDH) catalizza la reazione
acido lattico + NAD+
acido piruvico + NADH
il cui equilibrio termodinamico è molto spostato a favore dell'acido lattico. Sebbene il
rilevamento della reazione è in linea di principio molto semplice dal punto di vista
spettrofotomentrico in quanto la formazione del NADH si può seguire leggendo l'aumento
dell'assorbanza a 340 nm, è tuttavia necessario accoppiare la reazione ad un'altra reazione
enzimatica che, consumando uno dei prodotti, ne sposta l'equilibrio, quale ad esempio quella
catalizzata dalla glutammico piruvico transaminasi (GPT):
acido piruvico + acido glutammico
alanina + acido α-chetoglutarico
La coppia LDH/GPT è alla base di kit commerciali per la determinazione
spettrofotometrica dell'acido lattico (Boheringer, Sigma), ma nella nostra esperienza ha dimostrato
di avere il problema di un background piuttosto elevato. Si è tentata allora una via alternativa
basata sull'enzima lattato ossidasi (LOD), che catalizza la reazione:
acido lattico + O2
acido piruvico + H2 O2
Poiché nessuno dei componenti della reazione è rilevabile spettrofotometricamente, la
reazione è stata accoppiata alla seguente, catalizzata dall'enzima perossidasi (HRP, horse radish
peroxidase):
H2 O2 + TMBred
TMBox + H2 O
dove con TMB si intende tetrametilbenzidina, rispettivamente ridotta e ossidata. La forma
TMBox ha un colore blu e un picco di assorbimento a 370nm, che può essere correlato alla
concentrazione di acido lattico. In questo modo è stata costruita una retta di calibrazione con
campioni a concentrazione nota di acido lattico, che è stata successivamente utilizzata per la
determinazione della produzione di acido lattico durante la crescita dei Lattobacilli.
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taratura acido lattico
3
A370 finale
2.5
2
1.5
1
y = 32.605x + 0.1205
R
0.5
2
= 0.9919
0
0
0.02
0.04
0.06
0.08
acido lattico mM
Fig. 4. Retta di calibrazione per la misura spettrofotometrica dell'acido lattico con il sistema
bienzimatico LOD/HRP.
Misura spettrofotometrica della produzione di acido lattico in colture di Lattobacilli.
La concentrazione dell'acido lattico in aliquote di terreno di coltura prelevate a vari tempi di
crescita è stata determinata spettrofotometricamente dopo filtrazione su filtri sterili di porosità
0.4µm. La concentrazione di acido lattico è stata messa in relazione con la densità cellulare
determinata mediante misure di assorbimento a 600nm come descritto precedentemente.
5.00E+09
4.50E+09
y = 4.757E+08x - 1.247E+09
R2 = 9.997E-01
4.00E+09
3.50E+09
cell/ml
3.00E+09
2.50E+09
2.00E+09
1.50E+09
1.00E+09
5.00E+08
0.00E+00
0
2
4
6
8
10
12
mM acido lattico
Fig. 5. Relazione tra la concentrazione di acido lattico e la concentrazione cellulare in colture di
Lattobacilli; i punti di diverso colore appartengono a tre serie di dati provenienti da tre diverse
colture.
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Come si può osservare in figura 5 è risultato che esiste una relazione lineare tra la concentrazione
di acido lattico nel mezzo e la densità cellulare. Questa relazione lineare si perde quando termina
la fase logaritmica di crescita in quanto la densità cellulare si stabilizza, mentre la produzione di
acido lattico continua fino a raggiungere valori intorno a 250 mM.
Misura spettrofotometrica di altri analiti.
Vi sono naturalmente altri analiti la cui concentrazione varia nel corso della crescita batterica e
che sarebbe utile monitorare. Sono state eseguite alcune prove per mettere a punto dei sistemi di
misura spettrofotometrici che servano da guida e riscontro per le successive misure
elettrochimiche. D’altra parte i sistemi enzimatici possono poi essere, con eventuali modifiche,
adattati alle misure elettrochimiche.
Basandosi sulla reazione catalizzata dall’enzima glutammico deidrogenasi (GlDH)
acido α-chetoglutarico + NADH + NH4 +
acido glutammico + NAD+
si può costruire una retta di taratura in cui si correla la velocità di reazione, misurata come la
variazione di assorbanza a 340 nm nel tempo, alla concentrazione di ione ammonio nella miscela
di reazione. La figura 6 mostra che la relazione di proporzionalità si ha nel range 3-40 mM.
deltaA340nm/sec
0.02
0.015
0.01
0.005
y = 1.6942E-04x + 7.1611E-04
R2 = 0.99697
0
0
20
40
60
[NH4+], mM
80
100
120
Fig. 6 Retta di taratura per la misura spettrofotometrica dello ione ammonio con GlDH.
Alcune prove sono state eseguite su campioni di filtrato da colture di Lattobacilli, ma
sfortunatamente non si è evidenziata la presenza di ione ammonio. Aggiungendo aliquote più
consistenti di filtrato si osservava una diminuzione della velocità di reazione. Sembra possibile la
presenza di qualche sostanza che ha un ruolo di inibitore sull’enzima.
Lo stesso enzima, GlDH, poiché la reazione catalizzata è reversibile, può essere utilizzato per la
misura quantitativa del glutammato. La figura seguente mostra una curva di calibrazione per il
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glutammato, in cui si nota che il range lineare è piuttosto limitato, dato che già al di sopra di 1mM
di osserva un consistente appiattimento.
0.002
y = 0.0004x + 9E-06
0.0018
R
deltaA340nm/sec
0.0016
2
= 0.9977
0.0014
0.0012
0.001
0.0008
0.0006
0.0004
0.0002
0
0
1
2
3
4
5
6
[glutammato], mM
Fig. 7 Retta di taratura per la misura spettrofotometrica del glutammato con GlDH.
Anche in questo caso la misura di campioni di filtrato da colture di Lattobacilli non ha dato buoni
risultati confermando piuttosto la presenza di inibitori dell’enzima dato che in presenza di aliquote
di filtrato la velocità di reazione viene diminuita anche aggiungendo quantità note di glutammato.
Per queste ragioni la misura elettrochimica di questi analiti non è stata eseguita. Sarà infatti
necessario proseguire la ricerca tentando altri sistemi enzimatici oppure sistemi di pretrattamento
dei campioni da analizzare.
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Realizzazione di elettrodi con la tecnica screen-printing
Gli elettrodi screen-printed, grazie alla loro economicità ed alla flessibilità del metodo di
realizzazione, si prestano bene ad applicazioni di tipo biosensoristico, in particolare in campo
diagnostico, ambientale ed alimentare. E’ infatti in questi settori che maggiormente si apprezza la
possibilità di realizzare biosensori usa e getta, adatti a screening di popolazioni o campionamenti
direttamente in situ mediante l’utilizzo di sistemi analitici trasportabili.
Per la realizzazione degli elettrodi serigrafati è stata utilizzata una macchina screen-printer
manuale VEGA VACUUM 70 N fornita dalla Argon S.r.l.. Il tavolo di stampa è dotato di un
dispositivo di aspirazione ed è particolarmente adatto alla stampa di piccole e medie serie di
supporti sia rigidi che flessibili. Il piano di stampa è registrabile mediante viti micrometriche
Le pellicole, i telai e le incisioni sono stati realizzati dalla SERICARTON di Giannitrapani
Fabio. Le intelaiature sono in alluminio di dimensione 45x60 cm.
La rete è stata realizzata in poliestere svizzero bianco (sefar.pet 1000) con tessuto di differente
trama a seconda del tipo di inchiostro da stampare:
• tessuto 120 fili T/HD per gli inchiostri a base d’argento e di cloruro d’argento
• tessuto 90 fili T/HD per l’inchiostro a base di grafite
• tessuto 77 fili T/HD per il dielettrico
La racla è stata realizzata con un foglio di poliuretano da 75 durometri di dimensione
11x30 cm bloccato tra due lastre di plexiglas che conferiscono la sufficiente rigidità necessaria per
l’impugnatura.
Gli inchiostri utilizzati sono inchiostri polimerici per tecniche a film spesso per dispositivi medici
e sono stati forniti dalla Acheson Italiana S.r.l.:
• Electrodag® PF-410: inchiostro conduttivo costituito da particelle di argento finemente
suddivise disperse in una resina termoplastica
• Electrodag® 6038 SS: inchiostro conduttivo costituito da una miscela di particelle di
argento e cloruro d’argento finemente suddivise disperse in una miscela di resine
termoplastiche.
• Electrodag® 423 SS: inchiostro conduttivo costituito da particelle di grafite finemente
suddivise disperse in una resina termoplastica
• Electrodag® 452 SS: inchiostro dielettrico che polimerizza tramite UV utilizzabile come
strato isolante.
I supporti utilizzati per la stampa degli elettrodi sono fogli di acetato di cellulosa.
Sono state effettuate due diverse serie di stampe, utilizzando comunque sempre lo stesso
substrato. In entrambi i casi, comunque, si è utilizzato un sistema a tre elettrodi: elettrodo di
lavoro (working), elettrodo di riferimento (reference) e controelettrodo (counter).
Il primo tipo di elettrodo ha una forma della parte di lavoro che è circolare e si presta
meglio ad un utilizzo in flusso nel momento in cui si deve sigillarlo, tramite un o-ring, all’interno
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di una cella di misura. Il secondo tipo di elettrodo ha una forma più “classica” ed una dimensione
minore ed è stato pensato prevalentemente per un utilizzo in batch.
Per la stampa di elettrodi composti da più materiali è necessario che al termine di ciascuna
operazione di stampa gli inchiostri siano fatti asciugare mediante essiccamento in stufa prima di
procedere alla stampa successiva, questo per evitare che l’inchiostro fresco si attacchi al telaio
durante il passaggio della racla, distruggendo l’immagine precedentemente stampata.
Le stampe in argento, grafite e cloruro d’argento sono quindi state fatte asciugare per 30
min a 60 °C in stufa ventilata. Le stampe in dielettrico, che invece richiede curatura UV, sono
stato esposte per 30 min alla luce di un trans-illuminatore UV GENT M della BIO-RAD.
La pulizia dei telai, della racla e della spatola è stata effettuata con metil-etil-chetone,
servendosi di carta molto morbida.
A
B
C
D
Fig.8: Disegno schematico dei telai utilizzati nei diversi passaggi della stampa del primo
tipo di elettrodi fabbricati mediante lo screen-printing: a) stampa delle piste di argento; b) stampa
del controelettrodo in cloruro d’argento; c) stampa dell’elettrodo di lavoro in grafite; d) stampa
dell’isolante.
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Fig.9: Disegno schematico del primo tipo di elettrodi fabbricati mediante lo screenprinting: veduta dal lato inferiore.
A
B
C
D
Fig.10: Disegno schematico dei telai utilizzati nei diversi passaggi della stampa del
secondo tipo elettrodi fabbricati mediante lo screen-printing: a) stampa delle piste di argento; b)
stampa dell’elettrodo di lavoro in grafite; c) stampa del controelettrodo in cloruro d’argento; d)
stampa dell’isolante.
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Fig.11: Disegno schematico del secondo tipo di elettrodi fabbricati mediante lo screenprinting: veduta dal lato inferiore.
Dopo la realizzazione, alcuni elettrodi sono stati osservati al microscopio allo scopo di
verificare l’uniformità e la qualità della ricoperture delle sovrastampe. Dall’analisi microscopica
la ricopertura appare continua ed uniforme.
Gli elettrodi sono stati caratterizzati anche mediante misure di resistenza effettuate con un
multimetro che hanno dato i seguenti risultati:
Materiale
Resistenza ( Ω )
Argento
1,7 ± 0,5
Cloruro di Argento
2,1 ± 0,5
Grafite
43,4 ± 12,3
Misure elettrochimiche
Le misure elettrochimiche sono state effettuate con un Autolab PGSTAT10 e con un µAutolab
Type II. Le tecniche elettrochimiche che sono state utilizate sono:
• Voltammetria ciclica (CV) in cui un’onda di potenziale triangolare è applicata all’elettrodo e
viene registrata la corrente corrispondente. In questa tecnica i potenziali di picco e le forme dei
picchi contengono informazioni sulla cinetica del trasporto di carica..
• Cronoamperometria (CA) in cui un singolo potenziale è applicato di continuo ad un elettrodo e
la corrispondente risposta in corrente viene registrata come funzione del tempo.
Analisi voltammetrica del terreno di coltura e del filtrato da coltura di Lattobacilli:
Utilizzando gli elettrodi serigrafati realizzati come descritto sopra si è osservato che nella finestra
di potenziali negativi (tra 0 e –1 V) il controelettrodo d’argento tendeva a scurirsi nel corso delle
misure e rendeva impossibile ottenere un segnale stabile in tempi ragionevoli. Poiché questo
inconveniente non sembrava verificarsi a potenziali positivi si è provato ad effettuare le misure
invertendo i collegamenti ovvero effettuando le misure a potenziali negativi utilizzando l’elettrodo
di grafite come controelettrodo e quello d’argento come elettrodo di lavoro, e viceversa nella
finestra di potenziali positivi.
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Una analisi voltammetrica del mezzo di coltura e del filtrato dopo la crescita dei Lattobacilli è
stata effettuata separatamente nelle due finestre di potenziale. Come si può osservare la variazione
osservata a potenziali negativi è un’ordine di grandezza maggiore rispetto a quella che si ottiene a
potenziali positivi (3.4µA contro 0.142µA). Tuttavia in questa analisi non si fa uso di enzimi per
cui la variazione osservata è il risultato cumulativo di una alterata composizione del mezzo che
non fornisce alcuna informazione quali/quantitativa sulle sostanze ivi contenute.
-0.025x10-4
-0.075x10-4
i/A
-0.125x10-4
-0.175x10-4
-0.225x10-4
-0.275x10-4
-0.325x10-4
-1.000
-0.750
-0.500
-0.250
0
E/V
Fig. 12. Voltammetrie cicliche effettuate con un elettrodo serigrafato connesso in modo da avere il
working in argento e il counter in grafite.Curva rossa: Na fosfato100 mM pH 6.5; blu: MRS
Broth; verde: filtrato da coltura di Lattobacilli al termine della crescita (6x1010 cell/ml). La
differenza in corrente a –500mV tra la curva blu e la verde è pari a 3.4µA
0.177x10-5
0.152x10-5
0.127x10-5
i/A
0.102x10-5
0.077x10-5
0.052x10-5
0.027x10-5
0.002x10-5
-0.023x10-5
0
0.250
0.500
0.750
1.000
E/V
Fig. 13. Voltammetrie cicliche effettuate con un elettrodo serigrafato con working in grafite e il
counter in argento.Curva verde: Na fosfato100 mM pH 6.5; curva rossa: MRS Broth; curva blu:
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filtrato da coltura di Lattobacilli al termine della crescita (6x1010 cell/ml). La differenza in
corrente a +370mV tra la curva rossa e la blu è pari a 0.142µA.
Analisi cronoamperometrica
Misura amperometrica del glucosio mediante Glucosio ossidasi
I risultati di questa parte di lavoro sono stati già inseriti in una precedente relazione
intermedia sull’attività del progetto, per tanto di seguito si riporta soltanto un breve riassunto.
L’enzima glucosio ossidasi, (GOD), catalizza la reazione di ossidazione del glucosio ad
acido gluconico con la contemporanea riduzione dell’ossigeno ad acqua ossigenata:
GOD
Glucosio + O2 → Acido Gluconico + H2 O2
La reazione catalizzata dalla GOD può essere seguita amperometricamente in due
differenti maniere:
• polarizzandosi a 700 mV per vedere l’ossidazione anodica dell’acqua ossigenata:
H2 O2 → 2e- + 2H+ + O2
•
polarizzandosi a -700 mV per vedere la riduzione catodica dell’ossigeno:
O2 + 2H2 O + 4e- → 4HO -
Sia il consumo di ossigeno sia la produzione di acqua ossigenata corrispondono
stechiometricamente alla quantità di glucosio ossidato. Si può quindi ricavare, riportando la
corrente di plateau misurata in funzione della concentrazione iniziale di glucosio, una retta di
taratura utilizzabile per la determinazione di concentrazioni incognite di glucosio.
Per determinare le condizioni migliori in cui effettuare le prove enzimatiche sugli elettrodi
screen-printed preparati, sono state effettuate delle CV per individuare quale fosse il potenziale
ottimale a cui polarizzarsi per seguire il procedere della reazione mediante CA.
E’ stato osservato che la maggior variazione di segnale è rilevabile a -700 mV e per questo motivo
le misure sono state effettuate polarizzandosi a questo potenziale.
Sono state condotte misure di cronoamperometria in svariate condizioni:
• con l’enzima disciolto in soluzione
• con l’enzima immobilizzato su membrana PALL con e senza reticolazione con
poliazetidina prepolimero (PAP)
• con membrana di acetato di cellulosa contenente o meno un elettrolita di supporto
(tetraetilammonioperclorato o tetrabutilammoniobromuro)
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I risultati dei vari sistemi analizzati sono riportati nella tabella sottostante in cui si
confrontano le differenti sensibilità, i coefficienti di correlazione R2 e la “rumorosità” dei segnali
ottenuti. Mentre i primi due valori sono grandezze fisicamente definite, la rumorosità è una
valutazione empirica della qualità del segnale.
Sensibilità
(µA/mM ⋅cm2 )
Rumore*
R2
AC
AC-Br-
AC-Br-/PAP
AC-ClO4 -
AC-ClO4 -/PAP
6,7
7,8
11,5
13,0
6,9
+
+++
++
+
++
0,9890
0,9991
0,9979
0,9346
0,9999
* + = rumoroso; ++ =poco rumoroso; +++ = segnale non affetto da rumore
Come si può osservare il risultato migliore in sensibilità si ottiene per il sistema con il
(CH3 CH2 )4 NClO 4 in cui l’enzima viene immobilizzato sulla membrana per semplice
adsorbimento. Risulta comunque difficile mettere in relazione i dati ottenuti con il tipo di
elettroliti di supporto utilizzati e la presenza o meno di PAP come agente reticolante. Infatti i
risultati ottenuti sono “simmetrici” rispetto a queste due variabili.
Per quanto riguarda il rumore, il risultato migliore si ottiene per il sistema con il
(CH3 CH2 CH2 CH2 )4 NBr in cui l’enzima viene immobilizzato sulla membrana per semplice
adsorbimento. Possiamo però osservare che i sistemi mediamente meno affetti da rumore sono
quelli in cui l’enzima viene immobilizzato mediante la PAP. Questo fatto è probabilmente dovuto
all’ulteriore azione di schermatura rispetto ad interferenti svolta dalla struttura reticolata della
PAP, oltre a quella di trattenere l’enzima.
Il coefficente di correlazione indica la qualità della linearità delle misure effettuate. Il
risultato migliore si ottiene per il sistema con il (CH3 CH2 )4 NClO 4 in cui l’enzima viene
immobilizzato sulla membrana mediante la PAP. Possiamo però osservare che i sistemi
mediamente più lineari sono quelli in cui è presente (CH3 CH2 CH2 CH2 )4 NBr come elettrolita di
supporto.
In tutti casi comunque si osserva un miglioramento notevole rispetto agli elettrodi in cui
non è stata utilizzata la membrana di AC. In quel caso infatti non era possibile neppure a ricavare
una retta di tarartura ed il segnale era oltremodo rumoroso.
Complessivamente il sistema che presenta i risultati migliori è quello con membrana AC(CH3 CH2 CH2 CH2 )4 NBr ed enzima immobilizzato sulla membrana mediante la PAP.
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Misura amperometrica dell’acido lattico
Come riportato sopra nella sezione rigurdante le misure spettrofotometriche, la misura dell’acido
lattico mediante sistemi enzimatici si può basare su diversi sistemi: ad esempio sull’enzima lattico
deidrogenasi (LDH) seguendo lo schema riportato di seguito:
acido lattico
NAD+
MED red
NADH
MED ox
L-LDH
acido piruvico
eElettrodo
Questo sistema ha il vantaggio generale di poter operare in condizioni di potenziale più basso in
valore assoluto, cioè più vicino allo zero, poiché generalmente i mediatori elettrochimici hanno
proprio la funzione di facilitare lo scambio elettronico con la superficie dell’elettrodo, riducendo il
contributo di eventuali interferenti presenti nel mezzo analizzato e anche l’incidenza del fouling o
inquinamento dell’elettrodo durante la misura.
Si è deciso di provare un metodo bienzimatico in quanto più efficace nello spostare l’equilibrio
termodinamico della reazione della lattico deidrogenasi, che, come accennato precedentemente, è
spostato a favore della ossidazione dell’acido piruvico. Lo schema di reazione adottato in questo
caso è il seguente:
Acido lattico + NAD+
L-LDH
acido piruvico + NADH + H+
alla reazione della lattico deidrogenasi è stata accoppiata alla reazione catalizzata dall’enzima
diaforasi che ossida il NADH riducendo il ferricianuro:
diaforasi
NADH + Fe(CN)6 3+
NAD+ + Fe(CN)6 4+
Il ferricianuro di potassio dà luogo alla voltammetria ciclica mostrata nella figura seguente; in
seguito alla reazione la curva viene traslata verso l’alto, cioè verso correnti più positive e il
potenziale a cui si osserva la differenza massima è intorno a +0.1 V: questo è il valore scelto per
polarizzare il sistema nel corso della cronoamperometria che è stata usata per effettuare le rette di
taratura per l’acido lattico e le misure sui terreni e i filtrati da colture batteriche.
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0.075x10-4
0.050x10-4
i/A
0.025x10-4
0
-0.025x10-4
-0.050x10-4
-0.075x10-4
-0.100x10-4
0
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
E/V
Fig. 14. Voltammogrammi relativi al ferricianuro di potassio. Linea rossa: filtrato di coltura
batterica in terreno minimo con lievito contenente K3 Fe(CN)6 2mM; linea blu: lo stesso dopo
l’aggiunta di NAD+ 5mM, LDH e Diaphorase.
La calibrazione del sistema è stata ottenuta aggiungendo concentrazioni di acido lattico nel range
da 0.096 a 4mM. La cronoamperometria effettuata polarizzando l’elettrodo di lavoro (in grafite) a
+0.1V. I campioni in esame sono filtrati da coltura batterica a cui si aggiunge K3 Fe(CN)6 2mM,
NAD+ 5mM, LDH e Diaphorase.
Il pH del terreno prima della crescita batterica, e quello del filtrato della coltura vengono
aggiustati con NaOH 1M a valori intorno a 8.6. La reazione viene fatta partire con l’aggiunta di
diaphorase e successivamente aggiunte di acido lattico vengono effettuate per ottenere una
taratura interna dalla quale si estrapola il valore di acido lattico originariamente presente nel
campione (metodo delle aggiunte multiple). Questo viene estrapolato con valore negativo poiché
le aggiunte vengono graficate come se fossero l’unica fonte di acido lattico presente nel campione
essendo il valore iniziale incognito.
[acido lattico], mM
5
y = 2.0717x + 7.6689
4
2
R = 0.9859
3
2
1
0
-1
-5
-4
-3
-2
corrente, µA
-1
0
Fig. 15. Esempio di curva di taratura interna ottenuta con un campione di filtrato di coltura
batterica in terreno minimo con lievito.
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Questo metodo tuttavia è stato abbandonato perché non sufficientemente sensibile, un valore
medio di sensibilità ottenuto è di 0.47µA/mM, e purtroppo poco riproducibile.
Come alternativa si è provata la misura amperometrica dell’acido lattico con l’enzima lattato
ossidasi (LOD). La reazione catalizzata, come riportato nella sezione dedicata alle misure
spettrofotometriche, è la seguente:
acido lattico + O2
acido piruvico + H2 O2
Come si può notare la reazione è simile a quella catalizzata dalla GOD e il metodo di rilevamento
è del tutto analogo. Anche in questo caso si può decidere di misurare la diminuzione dell’ossigeno
disciolto nel mezzo a potenziali negativi o la produzione di acqua ossigenata a potenziali positivi.
Anche in questo caso la variazione di corrente è molto più marcata nella finestra negativa ed è per
questa ragione che la maggior parte delle misure è stata condotta a potenziali negativi.
Di seguito si riporta una cronoamperometria eseguita con polarizzazione a -900mV con elettrodo
di lavoro in argento e controelettrodo in grafite, per i motivi già spiegati nella sezione dedicata
all’analisi voltammetrica.
-0.193x10-5
-0.293x10-5
i/A
-0.393x10-5
-0.493x10-5
-0.593x10-5
-0.693x10-5
-0.793x10-5
76.102
176.102 276.102 376.102 476.102 576.102 676.102 776.102 876.102 976.102
t/s
Fig. 16 Cronoamperometria a –900 mV con elettrodo di lavoro in argento e controelettrodo in
grafite; tampone Na fosfato 0.1 M pH 6.5, LOD 5µg/ml acido lattico aggiunte di 0.05mM.
Da cronoamperometrie di questo tipo sono state derivate rette di taratura come quella riportata di
seguito in cui si nota che la riproducibilità tra misure effettuate sullo stesso elettrodo è piuttosto
buona. Per questo motivo si è deciso di effettuare la taratura su ogni elettrodo prima di eseguire la
misura su campioni di filtrato da colture di Lattobacilli. Inoltre la sensibilità del metodo,
14µA/mM è notevolmente più alta di quella del metodo basato sulla LDH.
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0
corrente, µA
-1
-2
-3
-4
-5
y = 14.193x - 5.7461
R2 = 0.9969
-6
-7
0
0.1
0.2
0.3
[acido lattico], mM
0.4
Fig. 17 retta di taratura per l’acido lattico dedotta da tre CA successive eseguite sullo stesso
elettrodo. Le CA sono state eseguite a –900 mV con elettrodo di lavoro in argento e
controelettrodo in grafite; tampone Na fosfato 0.1 M pH 6.5, LOD 5µg/ml acido lattico aggiunte
di 0.05mM.
4.00E+10
3.50E+10
cellule/ml
3.00E+10
2.50E+10
2.00E+10
1.50E+10
1.00E+10
5.00E+09
0.00E+00
0
10
20
30
40
[acido lattico], mM
50
60
Fig. 18 Misura elettrochimica della concentrazione di acido lattico in campioni prelevati da una
coltura di Lattobacilli.
Le misure riportate fin qui sono state eseguite con la LOD in soluzione, ma ovviamene, è
dispendioso utilizzare l’enzima per una sola misura, e, nell’uso in un sistema di misura a flusso,
l’immobilizzazione dell’enzima è necessaria. Sono stati quindi provati due sistemi di
immobilizzazione:
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•
Il primo metodo, per semplicità, consiste nel semplice adsorbimento di una goccia (2µl, pari a
20µg) di enzima che viene depositata e lasciata asciugare a temperatura ambiente
sull’elettrodo di lavoro.
• Il secondo metodo di immobilizzazione consiste nell’adsorbimento/intrappolamento su
membrana; nel nostro caso sono state usate le membrane della PALL, Biodyne A, B e C.
Le misure effettuate con la LOD immobilizzata per adsorbimento diretto sull’elettrodo di lavoro
hanno fornito rette di taratura per l’acido lattico molto simili (cioè con sensibilità paragonabile) a
quelle ottenute con l’enzima in soluzione, tuttavia assolutamente non riproducibili nelle misure
successive. Infatti sembra che l’enzima adsorbito mantenga gran parte della sua attività in seguito
all’immobilizzazione, ma purtroppo si distacca dall’elettrodo e quindi non è più disponibile per
misure successive (parte dell’attività enzimatica era rilevabile in soluzione).
Per quanto riguarda le prove di immobilizzazione su membrana si rimanda a più avanti, nella
sezione relativa alle misure in flusso.
Misure di cronoamperometria in flusso: sistema di flow injection
E’ stata progettata e costruita una celletta di misura in flusso in plexiglass dotata di un o-ring che
assicura la tenuta e delimita un volume interno di circa 20 µl. L’area delimitata dall’o-ring
permette di esporre al liquido la parte attiva dei tre elettrodi, mentre un tubo di ingresso e un di
uscita, connessi ad una pompa peristaltica permettono il passaggio del flusso di tampone e degli
analiti. La celletta ha poi un alloggiamento per il connettore appositamente costruito, che assicura
i contatti elettrici tra le piste dei tre elettrodi serigrafati e l’elettronica di pilotaggio e acquisizione.
Fig. 19 Cella di misura in flusso per il sistema sensoristico flow-injection.
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Prove preliminari di misura con il sistema in flusso sono state eseguite polarizzando l’elettrodo di
lavoro (in grafite) a + 1V e iniettando in cella aliquote di acqua ossigenata. Il tipo di segnale
ottenuto è mostrato nella figura seguente.
0.325x10-4
0.275x10-4
i/A
0.225x10-4
0.175x10-4
0.125x10-4
0.075x10-4
0.025x10-4
-0.025x10-4
0
250.000
500.000
750.000
1000.000
t/s
Fig. 20 Acquisizione del segnale in corrente dalla celletta di misura in flusso. L’elettrodo di lavoro
(in grafite) è polarizzato a +1V. La linea di base corrisponde al passaggio in cella di tampone Na
fosfato 0.1 M pH 6.5, i picchi a iniezioni successive (volumi compresi tra 1 e 5 µl) di acqua
ossigenata 100 mM.
Una retta di taratura può essere costruita graficando le correnti di picco (in µA) o,
alternativamente le aree dei picchi (in Coulomb x 10-5 ) in funzione dei volumi di acqua ossigenata
iniettati, ricavandone così una relazione quantitativa.
corrente di picco, µA
30
25
20
15
10
y = 4.4038x + 5.3895
2
R = 0.954
5
0
0
1
2
3
4
5
6
acqua ossigenata, µl
Fig. 21 Retta di taratura dell’acqua ossigenata ricavata dalla cronoamperometria in flusso.
La corrente di picco è graficata contro i volumi iniettati.
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Sono state poi effettuate delle prove di misura il flusso dell’acido lattico. In questo caso l’enzima
lattato ossidasi, LOD, è stato immobilizzato su dei quadratini 3x3mm di membrana PALL, di
diversi tipi (Biodyne A, B e C) che sono stati inseriti nello spazio delimitato dall’o-ring della
camera di misura in flusso.
Le caratteristiche principali di queste membrane sono le seguenti:
Biodyne A Membrane: Amphoteric Nylon 6,6
Biodyne B: Positively-charged Nylon 6,6
Biodyne C Membrane: Negatively-charged Nylon 6,6
I risultati più incoraggianti sono stati ottenuti con le membrane Biodyne B, in cui la percentuale di
gruppi carichi positivamente è prevalente: questa caratteristica della membrana sembra più adatta
a trattenere l’enzima in forma cataliticamente attiva.
Tuttavia, nelle misure effettuate si osservano dei problemi di interferenza piuttosto pesante da
parte di componenti dei mezzi di coltura dei Lattobacilli. Infatti il segnale dovuto all’iniezione in
cella di volumi di filtrato da colture è anormalmente alto all’inizio, ma dopo ripetute iniezioni si
abbassa e sembra creare problemi di “avvelenamento”, in quanto anche i picchi relativi all’acido
lattico sono molto più bassi in seguito a iniezioni di filtrato; solo dopo numerose iniezioni di acido
lattico il segnale torna gradualmente ai valori iniziali.
Controllo del circuito idraulico nel sistema di flow-injection
Il sistema di misura in flusso è stato progettato sulla base di uno schema che è illustrato
nella figura seguente: come si può notare si fa uso di quattro elettrovalvole a due vie in quanto si è
pensato che questa configurazione fosse la più semplice ed economica per assicurare tre possibili
stati del sistema idraulico e cioè una fase di caricamento del loop (load), una fase di attesa (wait) e
una di iniezione (injection).
B
C
S
B
S
B
W
C
W
C
S
W
Fig. 22 Schema del sistema idraulico realizzato per la misura di campioni in flow-injection.
Le lettere B, S, C, W, riportate in figura corrispondono, rispettivamente a: tampone, campione,
cella di misura e scarico.
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Il loop è costituito da un’ansa di tubo di lunghezza definita e quindi di volume preciso. Il sistema
automatico di flow-injection, con il caricamento del loop e l’iniezione in cella assicura la
riproducibilità delle misure riguardo ai volumi e alla modalità di iniezione (velocità del flusso,
pressione etc.).
E’ stato realizzato quindi uno strumento, che presenta sul lato superiore, le quattro elettrovalvole a
due vie che regolano il flusso della soluzione tampone e del campione da analizzare.
Fig. 23. Iniettore automatico per il sistema di misura in flow-injection.
Il pannello frontale (vedi fig. seguente) ospita:
1. L’interruttore di accensione
2. Led “controllo via PC”. Se acceso indica che il sistema è controllato dal software
3. Led “Iniezione”. Indica, lampeggiando, che è in corso l’iniezione in cella di misura, del
campione
4. Led “Caricamento”. Indica, lampeggiando, che è in corso il caricamento del loop; resta
acceso al termine del caricamento, indicando che il loop è pieno di campione, per poi
spegnersi all’inizio del processo di iniezione.
5. Pulsante “Caricamento”. Permette all’utilizzatore di effettuare il riempimento del loop.
Posiziona le elettrovalvole in modo da deviare il flusso del campione dentro il loop.
6. Pulsante “Iniezione”. Permette all’utilizzatore di effettuare l’iniezione del campione in
cella. Posiziona le elettrovalvole in modo da deviare il flusso, attraverso il loop, verso la
cella di misura .
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4
5
6
1
2
3
Fig. 24 Schema raffigurante il pannello anteriore dell’iniettore automatico per il sistema di misura
in flow-injection.
E’ possibile utilizzare lo strumento in due modalità: manuale o controllato via software.
In modalità manuale si effettuano il caricamento del loop e l’iniezione premendo gli appositi
pulsanti sopra indicati, la durata del caricamento può essere variata impostandola via software.
Resterà memorizzata per gli utilizzi successivi.
La durata dell’iniezione è maggiore della durata del caricamento di alcuni secondi in modo da
essere certi del completo svuotamento in cella del contenuto del loop. Qualora l’utilizzatore
cercasse, in modalità manuale, di eseguire un’iniezione senza aver prima riempito il loop
vedrebbe lampeggiare per due volte il led del caricamento senza che l’iniezione venga eseguita. Il
loop pieno viene indicato dal led del caricamento che rimane acceso.
In modalità “controllo via software” i pulsanti sul pannello vengono disabilitati.
La comunicazione con il PC avviene per via seriale tramite una normale porta RS232 (COM2).
Il software.
L’uso del software di controllo è molto semplice. E' necessaria una fase preliminare di
impostazione del sistema, tale impostazione si esegue grazie al pannello di fig.2 in cui compaiono
i vari parametri da impostare o calcolati:
1.
2.
3.
4.
5.
Diametro del tubo utilizzato
Velocità della pompa peristaltica che fa fluire il tampone e il campione
Tempo di attività, in fase di calibrazione, della pompa peristaltica
Quantità di fluido pompato durante la calibrazione
Volume desiderato del loop
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Direzione e Sede Legale: via A. Moro n. 15 – 57033 Marciana Marina (Li) Tel. ++39-0565-904461-3 Facs ++39-0565-904447
SOCIETA’ DI RICERCA INDUSTRIALE AVANZATA
6.
7.
8.
9.
Lunghezza del loop (in mm)
Volume di soluzione per mm di tubo
Velocità del flusso
Tempo necessario al riempimento del loop
1
2
3
4
7
5
8
6
9
Fig. 25 Finestra “pannello di impostazione” attraverso la quale si definiscono i parametri necessari
per il controllo automatico del caricamento e dell’iniezione di campioni nella cella di misura.
Calibrazione del sistema:
•
•
•
Stabilire per quanto tempo si vuol mantenere attiva la pompa peristaltica.
Avviare la pompa premendo l’apposito pulsante (si accende il led alla destra dello stesso)
Trascorso il tempo impostato la pompa si fermerà, misurare la quantità di liquido aspirato
dalla pompa ed inserirla nel controllo (4)
• Inserire nel controllo (5) il volume desiderato del loop
A questo punto in (6) è indicata la lunghezza che dovrà avere lo spezzone di tubo che
costituisce il loop; il tempo di riempimento calcolato viene utilizzato dal programma per la
temporizzazione delle operazioni.
Premendo “OK” il pannello di impostazioni scompare.
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6
3
Utilizzo del sistema tramite PC:
7
4
Il pannello per l’utilizzo è il seguente:
9
8
5
1
2
10
11
14
Fig. 26. Pannello di controllo
12
15
13
Breve descrizione dei controlli:
partendo dalla sinistra del pannello troviamo:
1. POWER: se premuto imposta lo strumento in modalità “controllo da PC” disabilitando i
pulsanti
2. Impostazioni: permette di accedere al pannello di impostazione sopraccitato
3. Permette di stabilire quanti secondi devono trascorrere tra il termine del caricamento del
loop e la sua iniezione in cella
4. Indica quanto tempo manca all’iniezione
5. Permette di stabilire quanti secondi devono trascorrere tra le successive iniezioni
6. Esegue il caricamento del loop
7. Esegue l’iniezione in cella
8. Esegue il lavaggio del loop facendovi fluire la soluzione tampone
9. Indica lo stato di riempimento del loop
10. Indica che il loop è completamente carico
11. Indica che è in corso il lavaggio del loop
12. Indica che è in corso il riempimento del loop
13. Indice che è in corso l’iniezione in cella
14. Indica quanto tempo manca all’inizio del prossimo caricamento
15. Avvia il processo di carico-iniezione temporizzate
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Il tempo di caricamento del loop viene impostato in base al tempo stimato più tre secondi, quello
di iniezione in base al tempo stimato di caricamento più tredici secondi.
L’aspetto del sistema di misura in flow-injection nel suo insieme è quello mostrato nella foto
seguente in cui si vede come la cella di misura in flusso sia collegata mediante l’iniettore
automatico e la pompa peristaltica ad un reservoir di soluzione tampone e al fermentatore da cui si
prelevano delle aliquote da analizzare a tempi definiti.
Fig. 27. Sistema di misura in flow-injection.
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