ZYMUTEST Protein Z
Codice prodotto RK031A
(Kit ELISA completo per Proteina Z)
Solo per uso in vitro
Ultima revisione: 09/05/2007
DESTINAZIONE D’USO:
Il kit ZYMUTEST Protein Z è un test immunologico a un solo step, per la misurazione
della Proteina Z (PZ) nel plasma, o in ogni altro fluido biologico dove la PZ è presente.
2.
PRINCIPI DEL TEST:
L’immunoconiugato è un anticorpo policlonale specifico per PZ coniugato con una
perossidasi di rafano (HRP) che viene aggiunto in micropozzetti ricoperti con un altro
anticorpo policlonale specifico per PZ. Si aggiunge rapidamente il campione da analizzare
opportunamente diluito provocando l’inizio della reazione immunologica. Quando è
presente, la PZ è riconosciuta dall’anticorpo policlonale legato alla fase solida con un suo
epitopo e fissata all’anticorpo policlonale coniugato con HRP attraverso gli epitopi liberi. Si
effettua un passaggio di lavaggio, si aggiunge il substrato della perossidasi, la 3,3’,5,5’Tetrametilbenzidina (TMB), che in presenza di idrogeno perossido (H2O2) sviluppa una
colorazione blu. La reazione viene bloccata con l’aggiunta di acido solforico, che causa un
viraggio della colorazione a giallo. Il grado di colorazione ottenuto è direttamente
proporzionale alla concentrazione di PZ umana presente nel campione analizzato.
CAMPIONI DA TESTARE:
−
−
Plasma umano addizionato con l’anticoagulante trisodiocitrato o Na2EDTA.
Qualunque fluido biologico dove PZ deve essere misurata.
REAGENTI:
1.
COAT: piastra Micro ELISA, contenente 12 strips da 8 pozzetti, ricoperti con un
anticorpo policlonale specifico per PZ e poi stabilizzati; la piastra è impacchettata in
una busta di alluminio ermeticamente sigillata, in presenza di un diseccante.
2.
SD: 2 vials contenenti 50 ml di Sample Diluent, pronto per l’uso.
3.
CAL: 3 vials di PZ calibrator, liofilizzato. Risospendendo con 2 ml di Sample Diluent
si ottiene una soluzione contenente 100 ng/ml di PZ umana..
4.
CI: 1 vial contenente 0.5 ml di Plasma PZ Control I High liofilizzato (plama umano).
5.
CII: 1 vial contenente 0.5 ml di Plasma PZ Control II Low liofilizzato (plama
umano).
Nota: le concentrazioni di PZ e l’intervallo di confidenza dei controlli può variare da lotto a lotto, ma i
valori sono precisamente indicati per ciascun lotto sul foglietto illustrativo incluso nel kit.
6.
IC: 3 vials di Anti-(h)-PZ-1-HRP immunoconjugate, anticorpo policlonale coniugato
con HRP, liofilizzato.
7.
CD: 1 vial di 25 ml di Coniugate Diluent, pronta per l’uso.
8.
WS: 1 vial di 50 ml di Wash Solution concentrato 20 volte.
9.
TMB: 1 vial di 25 ml del substrato della perossidasi: 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina
contenente idrogeno perossido. Pronta per l’uso.
10. SA: 1 vial di 6 ml di 0,45 M di Acido Solforico (Stop Solution). Pronta per l’uso.
Nota: utilizzare solo reagenti provenienti dallo stesso lotto. Non mischiare i reagenti appartenenti a lotti
diversi quando si effettua il test.
REAGENTI E CORREDO RICHIESTO MA NON FORNITO:
•
•
•
•
•
Pipetta multi canale a 8 canali o pipette ripetitive che permettono di erogare 50300 µl.
Pipetta a 1 canale per volumi variabili: da 0 a 20 µl, da 20 a 200 µl e da 200 a
1000µl.
Strumentazione per il lavaggio e l’agitatore per la piastra Micro ELISA
Uno spettrofotometro per la piastra Micro ELISA, settata alla lunghezza d’onda di
450 nm
Acqua bidistillata
3.
4.
5.
e protetto dall’umidità con il disseccante, riposto nell’apposito sacchetto (minigrip),
conservate a 2-8°C e utilizzate entro 4 settimane.
Sample Diluent: è già pronto per l’uso. Una volta aperto può essere usato per 4
settimane se conservato a 2-8°C, evitando ogni contaminazione batterica durante
l’uso. Contiene 0,05% di Kathon CG.
Protein Z calibrator: risospendere con 2 ml di Sample Diluent in modo da ottenere
una soluzione contenente 100 ng/ml di PZ. La soluzione preparata è stabile per
almeno 8 ore a temperatura ambiente.
Plasma PZ Control I (human plasma, high) : risospendere con 0.5 ml di acqua
bidistillata.
Plasma PZ Control II (human plasma, low) : risospendere con 0.5 ml di acqua
bidistillata.
Nota: i controlli di PZ risospesi sono stabili per 24 ore a temperatura ambiente, 72 ore se conservati
a 2-8°C o 2 mesi se congelati a –20°C o a temperature inferiori.
Attenzione: i plasmi controllo I e II (4&5) e il calibratore (3) sono preparati a partire da plasma umano
normale. Quest’ultimo è testato con metodiche registrate ed è risultato negativo per gli anticorpi HIV,
HBs Ag e HCV. Comunque nessun saggio può garantire la totale assenza di agenti infettivi. Ogni
prodotto di origine umana deve essere maneggiato con tutte le precauzioni del caso e trattato come se
fosse potenzialmente infettivo.
6.
Anti-(h)-PZ-HRP immunoconjugate: ciascuna vial deve essere risospesa con 2 ml
del Coniugate Diluent. Sciogliere completamente l’eventuale particellato prima
dell’uso e agitare delicatamente la vial per omogenarne il contenuto. La soluzione
risospesa è stabile per almeno 24 ore a temperatura ambiente o per 4 settimane a
2-8°C.
7. Coniugate Diluent: è pronto per l’uso. Una volta aperto può essere usato per 4
settimane se conservato a 2-8°C, evitando ogni contaminazione batterica durante
l’uso. Contiene 0,05% di Kathon CG.
8. Wash Solution: incubare la vial in un bagnetto ad acqua a 37°C per 15-30 minuti,
fino alla completa dissoluzione di eventuale particellato, se presente. Agitare la vial e
diluire 1:20 la quantità richiesta in acqua bidistillata (i 50 ml contenuti nella vial
consentono la preparazione di 1 litro di Wash Solution). La Wash Solution deve
essere conservata nella sua vial originale a 2-8°C e utilizzata entro 4 settimane
dopo l’apertura. La Wash Solution diluita deve essere protetta da ogni
contaminazione, conservata a 2-8°C e utilizzata entro 7 giorni. Contiene 0,05% di
Kathon CG.
9. TMB substrate: è già pronto per l’uso. Una volta aperto può essere usato per 4
settimane se conservato a 2-8°C, evitando ogni contaminazione batterica durante
l’uso.
10. Stop Solution: è già pronta per l’uso.
Precauzioni: l’acido solforico, sebbene è diluito a 0,45 M, è caustico. Come per ogni reagente chimico
simile, maneggiare l’acido solforico con grande attenzione. Evitare il contatto con la pelle o con gli
occhi. Indossare occhiali di protezione e guanti quando lo si maneggia.
Nota: portare il kit a temperatura ambiente almeno 30 minuti prima dell’uso. Conservare i reagenti che
non vengono utilizzati a 2-8°C. Gli studi di stabilità condotti a 30°C dimostrano che i reagenti possono
essere spediti a temperatura ambiente senza il rischio di danneggiarsi.
PROCEDURA:
Raccolta del campione:
Il sangue (9 vol.) deve essere raccolto, con l’anticoagulante citrato 0,109 M (1 vol.). Il
surnatante del plasma viene decantato e centrifugato a 2.500 g per 20 minuti; il plasma
citrato deve essere testato entro 8 ore o conservato a –20°C, o a temperature inferiori,
per un periodo non superiore a 6 mesi e scongelato a 37°C per 15 minuti prima dell’uso. Il
campione scongelato deve essere analizzato entro 4 ore.
Può essere anche utilizzato il plasma umano raccolto con EDTA. Le condizioni di
conservazione sono le medesime del plasma citrato.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI, CONSERVAZIONE E STABILITA’:
I reagenti, prima dell’uso, se conservati chiusi a 2-8°C nella confezione originale sono
stabili fino al raggiungimento della data di scadenza indicata sulla scatola.
1. Piastra Micro ELISA: aprire il sacchetto di alluminio e prendere un numero di strips
da 8 pozzetti richieste per l’esperimento. Quando vengono estratte dalla confezione
di alluminio le strips devono essere utilizzate entro 30 minuti. Le strips inutilizzate
devono essere mantenute nel sacchetto di alluminio originale, ermeticamente chiuso
D.750.20/ZY/031A
Il plasma, il campione o i controlli da analizzare:
Il campione deve essere analizzato diluito 50 volte (1:50) nel Sample diluent. Per
concentrazioni di PZ attese > 5 µg/ml, il plasma o i campioni possono essere analizzati a
diluizioni maggiori, 1:100, 1:200 o superiori.
I Controlli I e II devono essere analizzati dopo essere stati diluiti 50 volte (1:50) con
Sample diluent.
Calibrazione:
Usando il calibratore della PZ concentrato 100 ng/ml incluso nel kit, preparare le seguenti
soluzioni standard.
Concentrazione
della PZ (ng/ml)
100
ng/ml
50 ng/ml
25 ng/ml
10 ng/ml
5 ng/ml
0 ng/ml
Vol. del
calibratore della
PZ
1 ml
0,5 ml
0,25 ml
0,1 ml
0,05 ml
0 ml
Vol. del
Sample Diluent
0 ml
0,5 ml
0,75 ml
0,9 ml
0,95 ml
1 ml
Miscelare delicatamente per una completa omogeneizzazione.
Le diluizioni standard sono stabili per almeno 8 ore a temperatura ambiente.
Procedura del test:
Prendere il numero richiesto di strips dal sacchetto di alluminio, per effettuare la serie di
misurazioni necessarie. Mettere poi le strips nella montatura fornita. Nei singoli pozzetti
della micro piastra ELISA pipettare i reagenti ed eseguire i vari passaggi del test come
indicato nella seguente tabella:
Reagenti
Volume
Procedure
Conjugate anti (h)-PZ-HRP.
(Risospeso con 2 ml di Conjugate
Diluent)
50 µl
Pipettare l’Anti-(h)-PZ-HRP immunoconjugate
nei pozzetti della micro piastra ELISA
Calibratore della PZ o campione da
analizzare o F-sample diluent
(bianco)
200 µl
Pipettare immediatamente le soluzioni degli
standard o i campioni da analizzare nei
corrispondenti pozzetti della piastra micro
ELISA
Miscelare delicatamente su una piastra agitante o manualmente
e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (18-25°C)
Wash Solution (diluita 20 volte in
acqua bidistillata)
300 µl
Effettuare 5 successivi lavaggi utilizzando una
strumentazione per il lavaggio (a)
Immediatamente dopo il lavaggio, pipettare il
substrato nei pozzetti.
TMB/H2O2 substrato
200 µl
Nota: la distribuzione del substrato, strip dopo
strip, deve avvenire in modo accurato e ad
esatti intervalli di tempo (b,c).
Incubare per 5 minuti esatti a temperatura ambiente (18-25°C) (c)
0,45 M di acido solforico
50 µl
Seguendo esattamente gli stessi intervalli di
tempo utilizzati nell’aggiunta del substrato,
bloccare lo sviluppo della colorazione,
aggiungendo acido solforico 0,45 M (b).
Attendere 10 minuti in modo da permettere la stabilizzazione della colorazione e misurare
l’assorbanza a 450 nm (A450). Sottrarre il valore letto dal bianco (d).
− In ciascun micropozzetto pipettare 200 µl di soluzione di calibrazione (preparata come
per la metodica con un solo passaggio) o 100 ul del plasma diluito da analizzare. Dopo
1 ora di incubazione a temperatura ambiente (18-25°C) e un lavaggio, aggiungere 200
µl/per pozzetto di immunoconiugato (IC). Dopo 1 ora di incubazione a temperatura
ambiente e un lavaggio, si aggiunge TMB (200 µl per pozzetto), si attende 5 minuti per
permettere lo sviluppo della colorazione e poi si blocca la reazione con 50 µl di acido
solforico (SA) 0,45 M. Si misura l’assorbanza a 450 nm. Le cautele da rispettare
durante le varie operazioni e i lavaggi, così come l’interpretazione dei risultati, sono i
medesimi raccomandati per la metodica a un solo passaggio.
ESPRESSIONE DEI RISULTATI:
− Disegnare un grafico cartesiano con le concentrazioni di PZ (ng/ml) sulle ascisse e le
corrispondenti assorbanze (A450) sulle ordinate.
− Costruire la propria curva di calibrazione, ottenuta usando i valori delle diluizioni dello
standard. Dalla curva ottenuta si ottengono le concentrazioni della PZ dei campioni
analizzati. Per calcolare le concentrazioni della PZ in questi campioni bisogna
moltiplicare i valori ottenuti con il fattore di diluizione utilizzato (Es. 50, 100, 200 …)
(vedi il foglietto illustrativo).
− Per il controllo I e II le concentrazioni misurate devono essere moltiplicate per 50.
− Alternativamente, per calcolare le concentrazioni, è possibile utilizzare un ELISA
sofware (Es. Dynex, Biolise, ecc…).
INTERVALLO ATTESO:
− La concentrazione significativa di PZ nella popolazione normale è 2.8mg/ml quando
viene misurata con il kit Zymutest PZ e può variare largamente tra gli individui (da circa
1 a 4µg/ml).
BIOCHIMICA:
− La PZ è una glicoproteina dipendente dalla vitamina K dal peso molecolare di 62,000
Dalton. Il complesso inibitore dipendente da PZ-PZ (ZPI) è un inibitore del fattoreXa in
presenza di calcio e fosfolipidi.
VARIAZIONI PATOLOGICHE:
Le associazioni cliniche della proteina Z sono ancora discusse ed ad oggi non vi è un
consenso univoco. Fra gli studi riportati si può indicare:
− Il complesso PZ-ZPI si suppone possa essere coinvolto nell’aumento del rischio
trombotico per pazienti affetti dalla sindrome antifosfolipidica (aPL).
− Carenze di PZ sono state descritte in pazienti con infarto ischemico e possono indurre
in donne un aumento del rischio di aborto spontaneo che potrebbe essere correlato con
l’incremento della formazione del immune con PZ favorendo uno stato di
ipercoagulabilità nella placenta.
− Il livello di antigene di PZ totale è estremamente basso in pazienti in terapia cronica
con warfarin. Bassi livelli di PZ plasmatici sono anche associati con sindromi
coronariche acute (ACS).
APPLICAZIONI:
− Analisi della PZ in campioni di plasma.
CARATTERISTICHE DEL TEST:
- Soglia di determinazione ≤ 0,25 µg/ml.
- Variabilità intra-test: 3-8%.
- Variabilità inter-tests: 5-10%.
- Nessuna interferenza significativa con eparina fino a 2 IU/ml.
Nota: distribuire I calibratori, I controlli e il campione da analizzare il più rapidamente possible
inm modo da ottenere una cinetica immunologica omogenea per il legame con la PZ. Un ritardo
troppo elevato (>15 minuti) tra la distribuzione nel primo e l’ultimo pozzetto può influenzare
negativamente la cinetica immunologica e produrre risultati errati.
a.
Onde evitare un eventuale essiccamento della piastra che potrebbe danneggiare i complessi ivi
immobilizzati si raccomanda di non lasciarla mai vuota e effettuare l’aggiunta dei reagenti e le
soluzioni di lavaggio entro 3 minuti. Se necessario tenere la piastra colma di Wash Solution e
svuotarla appena prima di pipettare un nuovo reagente. La procedura di lavaggio della piastra
deve essere eseguita delicatamente onde evitare un drastico svuotamento dei pozzetti che
potrebbe ridurre la reattività della piastra.
b.
L’ intervallo di tempo tra l’aggiunta del substrato TMB e il blocco della reazione deve essere
costante ed esattamente determinato per ciascuna strip.
c.
Evitare di esporre la piastra ai raggi solari durante l’incubazione e soprattutto durante lo
sviluppo della colorazione. E’ possibile utilizzare un agitatore per le micro piastre ELISA .
d.
Per le letture bicromatiche, deve essere usata una lunghezza d’onda come riferimento di 690
nm o di 620 nm.
BIBLIOGRAFIA:
PROCEDURE RAPIDE (METODICA CON 2 PASSAGGI):
6.
− Il test può anche essere eseguito con un metodo a due passaggi. La curva di
calibrazione deve essere fatta in un intervallo tra 0 e 100 ng/ml (come per la metodica
a un solo passagggio); il calibratore della PZ deve essere ricostituito con 2 ml di
Sample Diluent (SD).
− L’immunoconiugato (IC) deve essere risospeso con 7,5 ml di Conjugate Diluent (CD).
− Il plasma da analizzare deve essere usato diluito 5 volte (1:5) o, se necessario, a
diluizioni maggiori con Sample Diluent (SD).
7.
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D.750.20/ZY/031A