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H. Curtis, N. S. Barnes, A. Schnek, G. Flores
Invito alla
biologia.blu
B – Biologia molecolare, genetica
ed evoluzione
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La regolazione
dell’espressione
genica
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Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012
L’importanza della regolazione
 La regolazione genica “è la capacità di una cellula di
controllare l’espressione dei suoi geni” e in tal modo di
regolare quel processo mediante cui l’informazione portata da
un gene viene trasformata in un prodotto funzionale di natura
proteica;
 i geni possono essere attivati o disattivati al momento
opportuno per evitare un inutile dispendio energetico :
“ tenere in funzione moltissimi geni anche quando non servono
comporta un dispendio di energia inutile”.
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L’importanza della regolazione
 In E. coli la presenza di
lattosio come alimento
induce la sintesi dell’enzima
beta-galattosidasi, che lo
scinde;
 la presenza
dell’amminoacido
triptofano nel terreno di
crescita inibisce invece la
produzione degli enzimi per
la sua sintesi interna.
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L’importanza della regolazione
Durante le diverse fasi dello sviluppo vengono espressi geni
diversi per l’emoglobina con diversa affinità per l’ossigeno.
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L’importanza della regolazione
L’esperimento di Gurdon
sulle rane ha dimostrato che
“nelle cellule mature non si
perde DNA funzionale e i
geni non sono inattivati in
modo definitivo”.
Quindi il differenziamento
delle cellule di un
organismo pluricellulare
dipende dall’inattivazione di
certi gruppi di geni e
dall’attivazione di altri.
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L’importanza della regolazione
 Il genoma è lo stesso per
tutte le cellule di un
organismo. Ciò che cambia
è il proteoma: l’insieme
delle proteine espresse da
una cellula;
 durante il differenziamento
i geni vengono espressi in
sequenza temporale
controllata.
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Il controllo genico nei procarioti
Il controllo può
avvenire in una delle tre
fasi che portano alla
sintesi proteica.
Avviene soprattutto
durante la trascrizione.
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17/08/12
Il controllo genico nei procarioti
I fattori di regolazione della trascrizione:
sono proteine codificate da geni regolatori;
si legano vicino alla sequenza promotore di un gene(all’operatore);
possono reprimere o attivare la trascrizione;
agiscono a volte con piccole molecole effettrici che ne modificano
la conformazione.
I geni costitutivi non subiscono questo controllo, sono sempre attivi
perché codificano per proteine indispensabili durante l’intera vita
della cellula.
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Il controllo genico nei procarioti
dell’operatore
A Attivatori e repressori sono
particolari proteine codificate
dai geni regolatori che si
legano in vicinanza del
promotore (all’operatore) e
possono agire o da controllo
negativo (repressori)
impedendo la trascrizione
dell’mRNA o da controllo
positivo (attivatori) favorendo
la sua trascrizione.
B Su questi attivatori o
repressori si legano anche
delle piccole molecole
effettrici che modificandone la
struttura li attivano o
disattivano.
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Il controllo genico nei procarioti
Nei procarioti i geni strutturali che codificano per polipeptidi con
funzione correlata[p.es. tre polipeptidi (enzimi) che lavorano in
un’unica sequenza biochimica] vengono spesso trascritti sullo
stesso segmento di mRNA.
La traduzione può già avere inizio all’estremità anteriore (5’) della molecola di mRNA
Anche se la restante parte della molecola è ancora in fase di trascrizione.
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Il controllo genico nei procarioti
Operone: promotore + operatore + geni strutturali.
I geni regolatori sono sparsi nel cromosoma, non fanno parte
dell’operone, ma codificano per attivatori e repressori della
trascrizione.
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Il controllo genico
nei procarioti
Gene regolatore
mRNA che codifica il repressore
I corepressori:
il triptofano, se presente
nel terreno di coltura, si
lega al repressore trp, ne
cambia la conformazione
permettendogli di legarsi
al sito dell’operatore;
insieme bloccano la sintesi
di triptofano. In questo
caso quindi il triptofano
attiva il repressore e
quindi è un corepressore
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Promotore Operatore
inattivo
Promotore
Operatore
(corepressore)
Repressore trp attivo
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Il controllo genico nei procarioti
(induttore)
Gli induttori:
il lattosio, se presente nel
terreno di coltura, si lega
al repressore lac inibendo
la sua capacità di legarsi
all’operatore; vengono
sintetizzati gli enzimi utili
alla degradazione del
lattosio. In questo caso il
lattosio disattiva il
repressore e quindi si
chiama induttore.
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La regolazione negli eucarioti
Come nei procarioti la capacità della RNA polimerasi di legarsi al promotore è
regolata da:
attivatori e repressori;
molecole effettrici.
Negli eucarioti la regolazione è più complessa perché :
maggior numero di proteine e tipi di cellule diverse;
non ci sono gli operoni(nei quali più geni strutturali venivano trascritti in
un’unica molecola di mRNA) perché ogni gene strutturale ha un proprio
sistema di controllo e viene trascritto separatamente;
inibizione della trascrizione attraverso l’aggiunta di un gruppo metile al DNA;
attivatori che alterano la struttura della cromatina in certe regioni del DNA
consentendo all’RNA polimerasi di riconoscere e raggiungere un gene per dare
avvio alla trascrizione. Es. l’enzima “istone –acetiltransferasi” che attacca
gruppi acetili alle code N-terminali delle proteine istoniche.
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La regolazione negli eucarioti
 Eterocromatina: cromatina più condensata;
 eucromatina: cromatina distesa, permette la
trascrizione, presente solo in interfase;
 istoni: proteine che mantengono la cromatina
spiralizzata;
 il grado di condensazione varia da un tipo di cellula
all’altro;
 eterocromatina permanente: corpi di Barr, centromeri,
telomeri e regioni non codificanti.
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La regolazione negli eucarioti
Corpo di Barr nel
nucleo in interfase
Il primo livello di organizzazione della cromatina.
(A) Rappresentazione grafica della fibra da
10 nm, o collana di perle: le perle sono i
nucleosomi, formati da proteine( istoni) e
DNA.
(B) Struttura di un tipico istone del core. La
coda N-terminale* è il target della maggior
parte delle modificazioni post-traduzionali.
Il dominio globulare, formato da tre
alfaeliche (cilindri), è implicato nelle
interazioni proteina-proteina e
nell'avvolgimento del DNA.
(C) Immagine schematica del nucleosoma. Il
cilindro grigio rappresenta l'ottamero
istonico, il tubo blu il DNA. Le code Nterminali degli istoni, non strutturate,
protrudono all'esterno del nucleosoma.
Ciascun istone dell'ottamero presenta una lunga coda N-terminale che si estende al di fuori
del nucleosoma: queste code possono subire numerose modificazioni promosse da specifici
enzimi che originano acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, fosforilazione della catena
laterale (residuo R). Tali modificazioni influiscono sulla struttura della cromatina facilitando la
trascrizione di un gene, o la sua inibizione




La regolazione negli eucarioti
Acetilazione: l’acetiltransferasi (un enzima) attacca gruppi acetili -COCH3
Fosforilazione: reazione chimica che consiste nell'addizione di un gruppo fosfato
(PO43-)
Metilazione: addizione di un gruppo metile -CH3
Acetilazione, fosforilazione avvengono sulle code N-terminali delle proteine istoniche,
che si allentano, lasciando libero il DNA per la trascrizione.
La metilazione avviene sia sulle code N-terminali che sulla citosina del DNA reprime
l'espressione genica, incrementando l'interazione tra il DNA e gli istoni.
Nei mammiferi ci sono 50 enzimi che modificano gli istoni, per compattare o
despiralizzare la cromatina.
Ogni pallino della coda N-terminale
corrisponde a un amminoacido: quelli chiari
sono stati acetilati (Arg, Lys) o metilati o
fosforilati (Ser).
L’acetilazione si ha trasferendo un gruppo acetile
-COCH3 ( il donatore è l’AcetilCoA ) su un residuo R
della lisina presente all’estremità N-terminale degli
istoni. La lisina perde così la carica positiva
normalmente presente sull’ N della catena laterale e
di conseguenza non si lega più con i gruppi fosfato
del DNA che hanno carica negativa.
In questo modo la cromatina diventa meno
compatta consentendo l’aggancio della RNA
polimerasi cioè il processo di trascrizione.
La fosforilazione (reazione chimica che consiste
nell'addizione di un gruppo fosfato PO43- ad un
amminoacido ) del gruppo ossidrilico presente nella
catena laterale (residuo R) della serina per produrre
fosfoserina da come risultato che essendo sia i gruppi
fosfato della serina che quelli del DNA negativi essi si
respingonoe quindi la cromatina diventa meno
compatta consentendo il processo di trascrizione.
Fosforilazione della serina
La metilazione (addizione di un gruppo metile
-CH3) ha solitamente luogo sui residui R di arginina
o lisina presenti all’estremità N-terminale degli istoni
e sulla citosina del DNA.
La metilazione reprime l'espressione genica,
incrementando l'interazione tra il DNA e gli istoni
Acetilazione della lisina e conseguenza sulla trascrizione
Lisina acetilata
eucrocromatina
Lisina non acetilata
eterocromatina
Metilazione (addizione di un gruppo metile
(-CH3)) ha solitamente luogo sui residui R di arginina o lisina
presenti all’estremità N-terminale degli istoni ma può avvenire
anche sulla base azotata citosina del DNA direttamente.
La metilazione di solito reprime l'espressione genica,
incrementando l'interazione tra il DNA e gli istoni
metilazione della citosina del DNA e delle code N-terminali e la
deacetilazione delle code N- terminali trasforma l’eucromatina in eterocromatina
La
nella quale l'espressione genica è repressa, essendo incrementata l'interazione tra il
DNA e gli istoni e quindi non essendo consentito l’aggancio della RNA polimerasi cioè il
processo di trascrizione
eucromatina
17/08/12
eterocromatina
17/08/12
Modificazioni degli istoni del core.
(A) In colore sono evidenziati i residui di H2A, H2B, H3 e H4
coinvolti in eventi di modificazioni post-traduzionali*. Più in
particolare, in viola sono indicate le lisine (K) acetilate, in
verde quelle ubiquitinate (L'ubiquitina è una piccola proteina
regolatoria) e in blu quelle metilate. Sempre in blu sono
indicate le arginine (R) soggette a metilazione, mentre in giallo
sone evidenziate le serine (S) fosforilate.
(B) I residui degli istoni modificati post-traduzionalmente
vengono selettivamente 'riconosciuti' da specifici domini
proteici. La figura illustra, a titolo esemplificativo, il legame di
alcune proteine a residui di H3 modificati. Si noti come la lisina
metilata può essere riconosciuta sia da proteine caratterizzate
dalla presenza di un cromodominio ( dominio proteico** che
riconosce la metilazione N-terminale degli istoni) che da un
dominio Tudor (dominio proteico originariamente identificato
come una regione di 50 amminoacidi presenti nella proteina
codificata Tudor in Drosophila). Lo specifico residuo modificato
e la presenza di vicine modificazioni post-traduzionali
influenzano quale proteina si debba legare. Le lisine acetilate
sono specificamente riconosciute da proteine dotate di un
bromodominio; ancora una volta la specificità della proteina
legata è funzione del residuo riconosciuto e delle altre
modificazioni presenti su quelli vicini.
*Una modificazione post traduzionale è la
modificazione chimica di una proteina
successivamente alla sua traduzione.
**Si definisce dominio strutturale (o dominio o
modulo) di una proteina un'unità globulare o fibrosa
formata da catene polipeptidiche ripiegate in più
regioni. I domini sono strutture supersecondarie
complesse delle proteine.
17/08/12
La regolazione negli eucarioti
Il promotore delle cellule eucariotiche è costituito non da una
sola unità ma da almeno tre regioni differenti
promotore basale
Inibitori ( silencer)
o
3° regione
1° regione
PROMOTORE
2° regione
La regolazione negli eucarioti
Il promotore è costituito da tre regioni differenti:
Promotore
basale
La prima regione detta TATA box, localizza il punto in cui
la trascrizione può avere luogo;
La seconda regione (dista 25 paia di B.A.) è il sito di inizio
della trascrizione, dove si inserisce la RNA polimerasi;
La terza regione cioè il sito degli elementi regolatori detti
enhancer o silencer, (a seconda che favoriscano o
inibiscano l’avvio della trascrizione) controllati da
proteine chiamate attivatori o repressori e da una
proteina chiamata mediatore se molto lontani dalla
sequenza promotore. (dista in genere 50 – 100 B.A. ma a
volte anche migliaia)
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La regolazione negli eucarioti
Fattori di trascrizione
Fattori di trascrizione generali GTF: sono 5 e si legano al
promotore basale per consentire l’attacco della RNA
polimerasi.
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La regolazione negli eucarioti
Meccanismo della trascrizione
 La trascrizione ha
inizio quando un
attivatore si lega
all’enhancer;
 gli enhancer sono
specifici per ogni tipo
di cellula.
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La regolazione negli eucarioti
Se gli enhancer sono lontani dal
promotore è necessaria la
presenza di un mediatore.
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Reazioni di maturazione di un mRNA eucariotico: il cappuccio in 5’
5’
Il capping è una delle tappe di maturazione
del pre-mRNA a mRNA che consiste
nell'aggiunta di un "cappuccio" di 7-metil
guanosina al residuo 5-terminale della
catena con un insolito legame 5,5' trifosfato
(condensazione di una molecola di GTP con
il trifosfato dell'estremità del trascritto e
metilazione in posizione 7).
Questa modificazione è importante per il
riconoscimento e l'aggancio appropriato
dell'mRNA al ribosoma. Può essere
importante anche per altri processi
essenziali, come lo splicing ed il trasporto.
In oltre questa modificazione rende più
stabile l'mRNA.
Reazioni di maturazione di un mRNA eucariotico: la poliadenilazione in 3’
La poliadenilazione è un processo che
contribuisce alla maturazione dell'pre-mRNA e
consiste nell'aggiunta di un numero elevato di
A all'estremità 3' della catena di pre-mRNA
nascente.In linea generale tutte le molecole di
pre-mRNA possono andare incontro alla
poliadenilazione ad esclusione delle molecole
che codificano per gli istoni. Potrebbe
sembrare scontato che queste unità vengano
inserite non appena la trascrizione del gene si
interrompe ma, in realtà, all'interno del premRNA si trovano sequenze altamente
conservate che indicano ad un complesso
enzimatico di effettuare un taglio
endonucleasico. Il complesso di
poliadenilazione, formato da diversi fattori,
opera tagli nucleosidici ed è responsabile
dell'aggiunta delle A in coda. Il numero di A
inserite è molto variabile ma è compreso tra
circa cento e duecentocinquanta.
Regolazione post-trascrizionale, traduzionale,
post-traduzionale
 Splicing alternativo: da un unico gene posso ottenere
diversi trascritti e quindi diverse proteine;
 modifiche chimiche alla sequenza leader che impediscono
l’attacco dell’mRNA ai ribosomi;
 RNA interference: piccole molecole di RNA, dette
microRNA (miRNA) o short-interfering RNA (siRNA), che
interferiscono con l’mRNA, lo neutralizzano o degradano.
 repressore traduzionale: si lega all’mRNA quando la
proteina è presente in quantità sufficiente;
 dopo la traduzione: blocco reversibile o rottura della
proteina non più necessaria.
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Regolazione post-trascrizionale
Splicing alternativo
Durante la maturazione dell’mRNA la
cellula è in grado di assemblare in varie
maniere le sequenze codificanti (esoni)
trascritte nel pre-mRNA e dare luogo
così a proteine diverse a partire dallo
stesso gene oppure un gene presente in
tipi diversi di cellule dello stesso
organismo può dare origine a molecole
proteiche diverse oppure lo stesso gene
può fornire proteine diverse in momenti
differenti dello sviluppo.
Le cellule così esibiscono un proteoma*
molto grande mantenendo minime le
dimensioni del genoma.
*l'insieme delle proteine di un organismo o di un sistema biologico, ovvero le proteine
prodotte dal genoma.
Regolazione post-trascrizionale
ro esempio di Splicing alternativo
Regolazione post-trascrizionale
La sequenza consenso
modificazione chimica
di Kozakdi mRNA
Non tutte le regioni della molecola
corrispondono ad un particolare
aminoacido. In particolare, vi è una regione
vicino all‘estremità 5’ della molecola nota
come la regione non‐tradotta (UnTranslated
Region”, UTR) o sequenza “leader”. Negli
mRNA umani la lunghezza media del 5’‐UTR
è di circa 70 nucleotidi.
La UTR è importante perché contiene un
sito di legame per il ribosoma. Nei
vertebrati si chiama ”Kozak box” ed è
costituita dalle basi ACCAUGG. Come è
rilevabile, all'interno della stessa sequenza
di Kozak è contenuta la tripletta AUG, il
codone d'inizio codificante per
la Metionina che determina l'avvio
della catena polipeptidica di nuova sintesi.
Una modificazione chimica della
configurazione di detta sequenza può
impedire temporaneamente l’attacco del
ribosoma all’mRNA e quindi la sintesi
proteica.
Lewin, IL GENE VIII,
Zanichelli editore S.p.A.
Copyright © 2006
Regolazione post-trascrizionale
RNA interference
E’ un fenomeno comune in natura volto a proteggere l’ospite da RNA a
doppio filamento (dsRNAs) estranei (virus) o endogeni (retrotrasposoni)
A volte i repressori sono piccole
molecole di RNA capaci di interferire
con l’mRNA. Si chiamano microRNA
(miRNA) e RNA interferenti (siRNA). La
loro azione consiste nel
(RNA induced
silensing complex)
Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2011
neutralizzare o demolire le
molecole di mRNA quando esse
hanno terminato la loro funzione o
quando portano informazioni che
possono danneggiare la cellula
come produrre proteine anomale
in grado di generare gravi malattie.
Queste brevi sequenze possono
essere sintetizzate in laboratorio e
offrono prospettive in campo
medico.
Regolazione traduzionale
repressore traduzionale
Regolazione post-traduzionale
Emivita e degradazione
La genetica dello sviluppo
• Studio dei cambiamenti da zigote a età adulta degli organismi
pluricellulari;
• il genoma di ogni individuo contiene le informazioni per la
differenziazione delle cellule e lo sviluppo dell’organismo;
• fattori di regolazione inducono i geni a spegnersi e
accendersi: regolazione genica differenziale.
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Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012
La genetica dello sviluppo
Lo sviluppo di Drosophila melanogaster:
Fase I - cellule specializzate trascrivono un gene detto bicoide
che si accumula nella parte anteriore, polarizzando la cellula
uovo e quindi l’embrione dopo la fecondazione.
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Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012
La genetica dello sviluppo
Lo sviluppo di Drosophila melanogaster:
Fase II - si attivano geni che inducono la formazione di un
modello corporeo segmentato. Ogni segmento dà origine a
parti del corpo dell’adulto (15 segmenti: 3 cefalici, 3 toracici e
9 addominali).
La genetica dello sviluppo
 Fase III - si attivano i geni omeotici che stabiliscono quali
parti del corpo si originano da ogni segmento. Tutti questi
geni conservano la stessa sequenza di 180 paia di basi dette
homeobox: codificano per proteine che si legano a enhancer
specifici, attivando o inibendo gruppi di geni.
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La genetica dello sviluppo
 Fase IV - le cellule si
differenziano. Le cellule
staminali totipotenti
danno origine a tutti i
tipi di cellule. Le cellule
adulte sono in grado di
originare solo cellule
del proprio tipo (cellule
unipotenti).
La proteomica
 Proteomica (termine coniato da Mark Wilkins, 1994):
comprendere le proteine espresse in una data cellula e
metterle in relazione con i geni;
 i proteomi di individui diversi presi dallo stesso tipo cellulare
saranno simili;
 ogni gene può codificare per più di una proteina (splicing
alternativo);
 trascrittoma: insieme degli mRNA di una cellula, spesso è
sufficiente per comprendere le proteine sintetizzate.
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La proteomica
Per capire quali proteine sono sintetizzate da una cellula in un
dato momento si usa l’elettroforesi su gel bidimensionale:
le proteine vengono separate in base alla carica netta a un
determinato pH;
le proteine vengono poi denaturate e separate in base alla loro
massa.
Le proteine sono quindi tagliate con enzimi specifici, le proteasi,
e identificate con la spettrometria di massa.
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Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012
La versatilità del genoma eucariotico:
la produzione degli anticorpi
Per produrre le combinazioni di anticorpi necessarie a difendere
l’organismo dagli antigeni non-self, è necessario un meccanismo
che produca anticorpi diversi fra loro.
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Sadava et al. Biologia La scienza della vita © Zanichelli editore 2010
La proteomica
Confrontare i proteomi di
cellule sane e malate aiuta
nello studio delle malattie
genetiche
Elettroforesi bidimensionale su gel (A – B)
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Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012