Un caso di paternità deficitaria: stima delle
mutazioni con il kit PowerPlex Y23 System
Dott.ssa Stefania Ceccardi
Laboratorio di Genetica Forense,
Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche
Università di Bologna
5° Giornata di Genetica Forense
Aula Giacomini- La Sapienza
Roma, 5 giugno 2013
L’analisi del cromosoma Y mediante l’uso di un
numero maggiore di STR più informativi
aumenta il potere di discriminare aplotipi
riducendo la possibilità di macht avventizi
In questo studio sono state analizzate 60 coppie
padre/figlio (58 Caucasici e 2 Africani) di cui era
stata stimata la probabilità di paternità 0,999999 e
già tipizzati con 17 Y-STR
Caso di paternità deficitaria
si chiedeva di accertare la paternità di un presunto figlio F2
avendo a disposizione il figlio riconosciuto F1 ed uno zio
paterno P1
• La fonte di DNA era costituita da:
 tamponi buccali
 unghie prelevate da cadavere
 striscio di origine bronchiale
 sangue prelevato in sede di autopsia
• il DNA da tampone buccale è stato estratto con
metodica Chelex 5%, mentre per gli altri tessuti si è
utilizzato un kit del commercio
• tutti gli estratti sono stati quantificati mediante
NanoDrop 2000c (Thermo Scientific)
la reazione di PCR è stata allestita secondo i protocolli
forniti dalla ditta produttrice del kit
PowerPlex Y23 5X Master Mix
5,0 µl
PowerPlex Y23 10X Primer Pair Mix
2,5 µl
Templato 0,5ng/µl
Acqua
fino a 17,5 µl
x un volume finale di 25 µl
il DNA di controllo 2800M alla concentrazione di 0,5
ng/µl, è stato amplificato per gli stessi marcatori ed
aggiunto ad ogni corsa elettroforetica per controllo
della tipizzazione
Reazione di amplificazione
è stata realizzata su amplificatore 9700 (Life
Technologies) secondo i protocolli forniti dalla ditta
produttrice del kit
30 cicli
incubazione
iniziale
denaturazione
annealing
estensione
estensione
finale
temperatura
finale
96°C
2 minuti
94°C
10 secondi
61°C
1 minuto
72°C
30 secondi
60°C
20 minuti
4°C
10 minuti
Corsa elettroforetica
•
•
•
•
•
è stata eseguita su ABI PRISM 310 Genetic Analyzer
è stato impiegato il polimero POP-4TM (Life Technologies)
capillare corto (47cm x 50µm)
settaggio dei parametri del software come da protocollo
preparazione dei campioni aggiungendo ad 1 µl di prodotto
di amplificazione, 1µl di CC5 ILS500 Y23 ed 11µl di
formamide
• parametri di corsa modificati
• l’analisi dei frammenti è stata eseguita con GeneMapper ID
v3.2
Parametri di corsa standard
con una run temperature standard (60°) il ladder allelico
PowerPlex Y23 System mostrava per:
•il marcatore DYS19 la mancata assegnazione degli alleli
•il marcatore DYS391 l’errata assegnazione degli alleli
il tempo di corsa di 30 minuti non era sufficiente per
completare la corsa elettroforetica
Ladder allelico (60°C)
dalla letteratura si evince che la temperatura
potrebbe influire sulla velocità della corsa
elettroforetica
Parametri di corsa modificati
aumento della temperatura (70°C): ha permesso
la corretta attribuzione degli alleli
aumento del tempo di corsa (37 minuti): ha
permesso il completamento della corsa
elettroforetica
Ladder allelico (70°C)
Risultati
la tipizzazione dei 23 Y-STRs è stata ottenuta per
i tessuti analizzati, compresi i campioni prelevati
da cadavere e lo striscio bronchiale
confermate le mutazioni precedentemente
osservate: non più di una per coppia e solo in
quelle caucasiche
Risultati
Etnia
Caucasici
Locus
Allele
Tipo di mutazione
Padre
Figlio
DYS576
18
17
perdita di un repeat
DYS576
19
20
aggiunta di un repeat
DYS19
15-17
15-17
duplicazione
DYS481
25
26
aggiunta di un repeat
DYS549
14
15
aggiunta di un repeat
DYS456
16
17
aggiunta di un repeat
5 mutazioni ed una duplicazione sono state riscontrate per un
totale di 65 differenti aplotipi
DYS576
DYS19 – DYS456
DYS459 – DYS481
Y filer 17 STR :
2 mutazioni zio P1-nipote riconosciuto F1
DYS439/DYS385
1 mutazione zio P1-presunto nipote F2
DYS439
1 mutazione figlio riconosciuto F1-figlio presunto F2 DYS385
PowerPlex Y23: non si sono evidenziate ulteriori mutazioni confermando il typing
Tasso di mutazione
dipende dalla struttura molecolare dei rispettivi loci
Locus
Tasso di mutazione
DYS439
5,2 x 10-3
DYS385
2,1 x 10-3
DYS576
1,5 x 10-2
DYS481
4,4 x 10-3
DYS549
DYS456
1,4 x 10-3
4,2 x 10-3
Tassi di mutazione: YHRD.ORG3.0
Locus
Numero
mutazioni
osservate
Numero
di meiosi
Tasso
di mutazione
95% CI
DYS576
2
60
0,03333
0,00406 - 0,11528
DYS481
1
60
0,01667
0,00042 - 0,0894
DYS549
1
60
0,01667
0,00042 - 0,0894
DYS456
1
60
0,01667
0,00042 - 0,0894
Per ogni singolo locus si evincono:
tasso di mutazione viene stimato come il numero di eventi mutazionali diviso per il
numero totale di trasmissioni alleliche
intervallo di confidenza calcolato usando la teoria della distribuzione della
probabilità binomiale (http://statpages.org/confint.html)
aumentando il numero di STR tipizzati, il tasso di
mutazione deve essere tenuto in considerazione
specialmente quando il grado di polimorfismo è
elevato e più correlati in linea paterna devono
essere sottoposti ad indagine *.
*Kayser M, Sajantila A. Forensic Sci. Int. 118 (2001) 116-121; Goedbloed M et al. J. Legal Med. 123 (2009) 471482; Ballantyne KN et al. Am. J. Hum. Genet. 87 (2010) 341-353
I risultati mettono in evidenza che:
i profili ottenuti confermano i typing
i loci DYS576, DYS549 e DYS481 sono i più
informativi e maggiormente proni a mutazione
il locus DYS576 ha mostrato il più alto tasso di
mutazione in accordo con i dati riportati in
letteratura *
*Vermeulen M et al. Forensic Sci. Int. Genet. 3 (2009) 205-213; Geppert M et al. Leg. Med. 11 (2009) S109-S110
Conclusioni
L’analisi di 23 Y STR fornisce un valido supporto
per l’indagine forense in quanto permette di
discriminare aplotipi condivisi non appartenenti
alla stessa linea paterna, tuttavia è utile
conoscere il tasso di mutazione di questi loci,
specialmente quando applicati nell’indagine di
parentela