ASPETTI TECNICO-METODOLOGICI DI VALUTAZIONE
IMMUNOISTOCHIMICA DELL’ESPRESSIONE PROTEICA SU
.
CAMPIONI DI LINEE CELLULARI
F. Savani, M. Cadei, L. Fontana, T. Gullotta, L. Orlandi e F. Facchetti
Laboratorio di Anatomia Patologica, Spedali Civili-Università di Brescia
Introduzione
L’immunoistochimica, tecnica che permette il riconoscimento di antigeni a livello di tessuti e cellule tramite la
formazione di un complesso Ag-Ab, viene eseguita routinariamente nei laboratori di Anatomia Patologica, su
campioni istologici. Negli ultimi anni, sempre più frequentemente, tale metodo viene applicato anche a campioni
citologici. Le cellule derivate da linea cellulare, pur non rientrando nei campioni “tipici” del nostro laboratorio,
sempre più vengono utilizzate per testare anticorpi e, di conseguenza, è fondamentale avere un protocollo
dedicato a questo tipo di materiale biologico.
Scopo del lavoro
Materiali e metodi
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di rielaborare
un protocollo di colorazione immunoistochimica che
meglio si adattasse a testare gli anticorpi CICLINA D1,
FOX M1 e MIB 1 su linea cellulare.
La linea cellulare, da noi utiizzata, è derivata da biopsia
di carcinoma ovarico, allestita e fornita dal Laboratorio
Nocivelli degli Spedali Civili di Brescia, per un progetto di
collaborazione scientifica. Da essa sono stati allestiti 211
vetrini citologici su cui si sono testate:
ESPERIMENTI IIC ESEGUITI IN CONDIZIONI ROUTINARIE
DI ANTIGEN RETRIEVAL E DILUIZIONE ANTICORPALE
CICLINA D1
FOX M1
MIB 1
Dil. 1:40; AR 10’ forno Dil. 1:400; AR 5’ forno Dil. 1:100; AR 5’forno
microonde
microonde
microonde
Risultati
I primi risultati ottenuti mantenendo le condizioni
routinarie della metodica IIC, non si sono dimostrati
soddisfacenti in quanto, pur presentando positività agli
anticorpi, mostravano un generalizzato effetto citopatico
che si è attributo all’effetto termico dell’Antigen Retrieval
(AR). Ciò è stato confermato dal confronto con le
colorazioni istochimiche sulle medesime cellule che hanno
dato buoni preparati dal punto di vista della citomorfologia. L’ipotesi di non trattare le cellule con AR, si è
dimostrata fallimentare in quanto l’immunoreazione non
avveniva; si è quindi deciso di cambiare la modalità di
incubazione modificando e riducendo
il tempo del
trattamento (5 minuti di bagno termostatato). Nelle
medesime sperimentazioni si è anche ricercata la miglior
diluizione dei tre anticorpi primari rispetto a quella
indicata in routine e si è cercato di dimostrare la
specificità della reazione cromogenica.
MIGLIORI RISULTATI
CICLINA D1
FOX M1
MIB 1
ESPERIMENTI IIC ESEGUITI VARIANDO I PROTOCOLLI DI
ROUTINE
CICLINA D1
FOX M1
MIB 1
-AR
5’
forno - Dil. 1:200; AR 5’ - Dil. 1:300; AR 5’ bagno
microonde;
forno microonde;
termostatato;
-AR
5’
bagno - Dil. 1:200; AR 10’ -Dil. 1:1000; AR 5’ bagno
termostatato
bagno termostatato;
termostatato
- Senza AR.
- Dil. 1:200; AR 5’
bagno termostatato
- Senza AR
EE, cellule di buona qualità
IIC, AR routine, effetto citopatico
Modifica dell’AR:
- riduzione tempo
- incubazione in
bagno termostatato
Ab
1:40
1:200
1:300
Dil.
5’ bagno
termostatato
5’ bagno
termostatato
5’ bagno
termostatato
AR
Conclusioni:
ISTOCHIMICA
EMATOSSILINA -EOSINA
PAPANICOLAOU
Prova senza AR:, negatività
della reazione: impossibilità
di omettere l’AR
Prova senza Ab primario,
negativa: specificità della
reazione
Prova con anti-HBcAg,
negativa: specificità della
reazione
dai risultati ottenuti si evince che la rimodulazione del tipo di smascheramento antigenico e una diluizione
più adeguata forniscono informazioni con maggior attendibilità scientifica. Buona qualità morfologica dei preparati e
specificità anticorpale sono due condizioni irrinunciabili per una valutazione ottimale del preparato al microscopio ottico.