Di che cosa trattiamo?
Alcuni cenni sulla struttura delle PROTEINE
L’analisi informatica per la comprensione della
struttura
e
funzione
delle
proteine:
le
SIMULAZIONI AL CALCOLATORE
Biofisica
La struttura delle biomolecole è un
argomento di grande interesse per molti
settori della ricerca di base e applicativa
Funzione
STRUTTURA
Meccanismo
Origine/Evoluzione
Biofisica
La FISICA fornisce metodi computazionali e approcci
sperimentali molto potenti per indagare la struttura
delle macromolecole biologiche.
Biofisica
Le più importanti tecniche sperimentali e
teoriche per l’analisi delle strutture di
macromolecole
Difrattometria ai raggi X
Microscopie
Spettroscopie
Modellistica molecolare
Simulazioni al computer di dinamiche
molecolare e interazioni molecolari
Biofisica
Le proteine e gli acidi nucleici sono
polimeri
Le macromolecole sono costruite collegando insieme
unità strutturali definite MONOMERI
Proteine
20 amminoacidi
4 basi nucleotidiche
Acidi nucleici
Biofisica
LE PROTEINE (dal greco protos: principale) SONO LE
MACROMOLECOLE PIU’ ABBONDANTI E SVOLGONO
SVARIATE FUNZIONI, ad es.:
La luce prodotta
dalle lucciole
coinvolge la
proteina
luciferina;
Gli eritrociti
contengono la
proteina emoglobina
che trasporta
l’ossigeno;
La proteina cheratina
è il componente
strutturale dei
capelli, squame, corna,
lana, unghie etc.
Biofisica
Contengono 20 amminoacidi uniti tramite
un legame “peptidico”covalente
Amminoacido
Il legame peptidico
Biofisica
La sequenza degli amminoacidi costituisce
la struttura primaria
Ogni pallina corrisponde ad un amminoacido
Ribonucleasi: Mr 17000
da, 124 aa., secreta dal
pancreas.
Catalizza l’idrolisi di
acidi nucleici ingeriti con
la dieta
Biofisica
Le proteine hanno diversi livelli di struttura
Biofisica
Molte malattie sono dovute al difettoso
ripiegamento di una proteina
Alcune patologie derivano da proteine che non sono in grado di
raggiungere la loro struttura funzionale e che tendono a formare
grossi aggregati (fibrille o forme amiloidi): Alzheimer, Parkinson,
encefalopatia spongiforme, diabete di tipo II.
In altri casi mutazioni puntiformi generano proteine che non
raggiungono la loro locazione finale o che non sono più in grado di
svolgere la loro funzione perché incapaci di legare i loro substrati.
Fibrosi cistica: difetto nella proteina transmembrana che agisce come
un canale degli ioni cloro nelle cellule epiteliali (CFTR: 1480
amminoacidi). La mutazione più comune è la delezione di un
amminoacido (Phe 508) e la proteina mutata non si avvolge
correttamente.
Biofisica
Il problema del “folding”: che cosa
determina la struttura tridimensionale delle
proteine?
In genere la sequenza
amminoacidica contiene la
informazione completa per il
raggiungimento
della
struttura funzionale
Biofisica
DETERMINAZIONE DELLA
STRUTTURA TRIDIMENSIONALE
DELLE MACROMOLECOLE
BIOLOGICHE A LIVELLO ATOMICO
= determinare le coordinate spaziali xyz
per ogni singolo atomo, ovvero le
posizioni reciproche degli atomi nello
spazio
Biofisica
TECNICHE SPERIMENTALI
X-ray crystallography
(Kendrew and Perutz - 1961)
NMR spectroscopy
(Ernst and Wuthrich - 1983)
Diffrazione di raggi X
incidenti su cristalli di
biomolecole -> dipende dalla
spaziatura tra gli atomi
Assorbimento
di
radio
frequenze da parte di
biomolecole (solo certi tipi
di nuclei) IN SOLUZIONE e
immerse
in
un
campo
magnetico
->
dipende
dall’intorno del nucleo
Biofisica
Confronto NMR - diffrazione ai raggi X
NMR
Raggi X
Mioglobina
Con NMR si ottengono delle famiglie di strutture: si hanno informazioni sulla
mobilità delle porzioni di macromolecola, ma in molti casi il risultato finale è
molto simile
Biofisica
TECNICHE COMPUTAZIONALI
L’utilizzo COMPLEMENTARE di tecniche di
tipo sperimentale e di tipo computazionale è
l’approccio ottimale per lo studio dei sistemi e
dei processi biologici.
I limiti dell’una sono infatti superati dall’altra
Biofisica
Limiti delle tecniche sperimentali
risoluzione SPAZIALE
misure ad alta risoluzione di
strutture molecolari sono possibili solo per sistemi
relativamente rigidi
risoluzione ENERGETICA
analisi delle energie di
interazione atomica difficoltosa
risoluzione TEMPORALE
i primissimi eventi dei
processi biologici sono di difficile misurazione
Biofisica
Limiti delle tecniche computazionali
Sistemi biomolecolari troppo complessi
utilizzare approssimazioni
si devono
Simulazione del comportamento nel tempo di un sistema
molecolare su un computer
solo un numero limitato
(<NA) atomi o di gradi di libertà (di solito 102-105 atomi),
per un limitato periodo di tempo (103-104 picosecondi) può
essere simulato  piccoli sistemi, con tempi di
rilassamento brevi e/o utilizzo dei dati sperimentali per
restringere il numero di conformazioni possibili
Biofisica
Alcune Applicazioni
 MODELLIZZARE la struttura
risoluzione atomica della molecola
tridimensionale
a
Biofisica
 Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono
fornire indicazioni utili per il riconoscimento del sito
attivo o di strutture indispensabili all'attività della
molecola o dirette ad una certa funzione.
Biofisica
 Studiare le VARIAZIONI CONFORMAZIONALI
provocate dall’interazione della proteina con uno o più
LIGANDI, la quale fornisce l’attivazione (o
inattivazione) necessaria per compiere la propria
funzione biologica (o per impedirla).
Biofisica
 Monitorare i CAMBIAMENTI STRUTTURALI
indotti su peptidi o proteine da parte di MEMBRANE
BIOLOGICHE, i quali sembrano essere fondamentali
per il riconoscimento con il recettore o per
oltrepassare la fase lipidica e raggiungere zone
altrimenti inaccessibili.
Biofisica
 Comprendere il processo di FOLDING delle
proteine, ovvero il meccanismo di ripiegamento con
cui raggiungono la confomazione biologicamente
attiva.
Biofisica
Applicazioni
FARMACOLOGICHE:
viene
fornita
un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della
struttura opportuna in funzione del bersaglio del
farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture
calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto
raggio d’azione.
Biofisica
Biofisica
Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine
a singolo dominio)
 L’informazione
codificata
nella
amminoacidica
di
una
proteina
completamente la sua struttura nativa
sequenza
determina
 Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera
della proteina
Biofisica
Permette di costruire la struttura
tridimensionale di una proteina
sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA
con un’altra proteina
di struttura NOTA
che viene usata come STAMPO.
Biofisica
Si basa sulle seguenti osservazioni:
 le proteine appartengono ad un numero limitato di
famiglie strutturali
 proteine della stessa famiglia
tridimensionali molto simili
hanno
strutture
Biofisica
E’ molto importante l’allineamento di sequenza
con la proteina “stampo”
* aa identici
. aa simili
4mdh.aa
11BMD
1
1
SEPIRVLVTG AAGQIAYSLL YSIGNGSVFG KDQPIILVLL DITPMMGVLD
KAPVRVAVTG AAGQIGYSLL FRIAAGEMLG KDQPVILQLL EIPQAMKALE
*.** *** *****.**** . *. * ..* ****.** ** .*
* *.
4mdh.aa
11BMD
51
51
GVLMELQDCA LPLLKDVIAT DKEEIAFKDL DVAILVGSMP RRDGMERKDL
GVVMELEDCA FPLLAGLEAT DDPDVAFKDA DYALLVGAAP RKAGMERRDL
**.***.*** .*** . ** * ..**** * *.***. * *. ****.**
4mdh.aa
11BMD
101
101
LKANVKIFKC QGAALDKYAK KSVKVIVVGN PANTNCLTAS KSAPSIPKEN
LQVNGKIFTE QGRALAEVAK KDVKVLVVGN PANTNALIAY KNAPGLNPRN
* * ***
** **
** * ***.**** ***** * * *.**..
*
4mdh.aa
11BMD
151
151
FSCLTRLDHN RAKAQIALKL GVTSDDVKNV IIWGNHSSTQ YPDVNHAKVK
FTAMTRLDHN RAKAQLAKKT GTGVDRIRRM TVWGNHSSTM FPDLFHAEVD
*. .****** *****.* * *
* .. . .******* .**. ** *
4mdh.aa
11BMD
201
201
LQAKEVGVYE AVKDDSWLKG EFITTVQQRG AAVIKARKLS SAMSAAKAIC
GRP----ALE LVDME-WYEK VFIPTVAQRG AAIIQARGAS SAASAANAAI
..
* * . *
** ** *** **.* ** * ** ***.*
4mdh.aa
11BMD
251
246
DHVRDIWFGT PEGEFVSMGI ISDGNSYGVP DDLLYSFPVT IKDKTWKIVE
EHIRDWALGT PEGDWVSMAV PSQGE-YGIP EGIVYSFPVT AKDGAYRVVE
.*.** .** ***. ***.. *.*. **.* . ..****** ** . ..**
4mdh.aa
11BMD
301
295
GLPINDFSRE KMDLTAKELA EEKETAFEFL SSA
GLEINEFARK RMEITAQELL DEMEQVKALG LI
** **.*.* .*..** ** .*.*
.
Biofisica
Dopodichè si procede con…
…la costruzione dello scheletro…
…l’inserimento delle catene laterali…
…l’inserimento dei loop corrispondenti a “buchi”
nell’allineamento…
Biofisica
…per concludere con…
…l’ottimizzazione del modello..
…e il controllo della sua qualità
Biofisica
http://www.rcsb.org/pdb
Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n)
HEADER
TITLE
COMPND
COMPND
COMPND
COMPND
SOURCE
SOURCE
SOURCE
SOURCE
SOURCE
KEYWDS
EXPDTA
AUTHOR
REVDAT
REMARK
REMARK
REMARK
REMARK
OXYGEN TRANSPORT
22-JAN-98
1A3N
DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN
MOL_ID: 1;
2 MOLECULE: HEMOGLOBIN;
3 CHAIN: A, B, C, D;
4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER
MOL_ID: 1;
2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS;
3 ORGANISM_COMMON: HUMAN;
4 TISSUE: BLOOD;
5 CELL: RED CELL
OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE
X-RAY DIFFRACTION
J.TAME,B.VALLONE
1
29-APR-98 1A3N
0
1
2
2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS.
3
[…]
Biofisica
tipo di
atomo
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
tipo di
amminoacido
N
CA
C
O
CB
CG1
CG2
N
CA
C
O
CB
CG
CD1
CD2
N
CA
C
O
CB
OG
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
SER
SER
SER
SER
SER
SER
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
coordinate
X
Y
Z
10.720
10.228
8.705
8.164
10.602
10.307
12.065
8.091
6.624
6.176
6.567
6.020
6.386
5.998
5.730
5.380
4.831
3.725
3.095
4.308
3.076
19.523
20.761
20.714
20.005
22.000
23.296
21.951
21.453
21.451
22.578
23.730
21.707
20.649
21.119
19.337
22.237
23.237
24.027
23.717
22.429
21.786
6.163
6.807
6.878
6.015
5.966
6.700
5.544
7.775
7.763
6.821
7.022
9.129
10.198
11.577
9.795
5.852
4.928
5.568
6.591
3.727
3.991
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
21.36
24.26
18.62
19.87
27.19
31.86
31.74
16.19
17.31
18.55
18.72
18.34
17.39
17.99
16.96
15.02
16.59
14.84
14.40
16.47
14.91
N
C
C
O
C
C
C
N
C
C
O
C
C
C
C
N
C
C
O
C
O
…
Biofisica
1a3n
Deossiemoglobina catena A
C
O
N
S
EME
Fe
Biofisica
RASMOL v 2.7
http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm
Biofisica
Comprende tecniche come:
la DINAMICA MOLECOLARE,
la RICERCA DEL MINIMO DELL’ENERGIA
CONFORMAZIONALE,
e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE
(DOCKING).
Biofisica
Ad ogni conformazione molecolare è associata una
ENERGIA POTENZIALE
Biofisica
La forma più semplice DELL’ENERGIA POTENZIALE di una molecola è :
ENERGIA pot =
bending
Energia di ALLUNGAMENTO dei legami
+ Energia di PIEGAMENTO degli angoli di
legame
stretching
+ Energia di TORSIONE degli angoli diedri
+ Energia delle interazioni di NONLEGAME: repulsioni steriche, interazioni
di
Van
der
Waals,
interazioni
elettrostatiche
torsion
Biofisica
Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine
a singolo dominio)
 L’informazione
codificata
nella
amminoacidica
di
una
proteina
completamente la sua struttura nativa
sequenza
determina
 Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera
della proteina
Biofisica
Termodinamica del folding
imbuto di energia libera
visto
come
Si raggiunge il minimo
energetico
assoluto
percorrendo
anche
strade diverse
Ogni minimo relativo
corrisponde
a
stati
intermedi metastabili
Le
interazioni
idrofobiche di residui
non polari provocano il
“collasso idrofobico”
Scendendo
verso
il
basso
si
ha
una
diminuzione delle specie
Biofisica
Strategie di ricerca del minimo assoluto
Esistono metodi computazionali di ricerca del minimo
assoluto che implicano il campionamento dello spazio
conformazionale:
-il campionamento energetico sistematico
-l’annealing simulato
-la ricerca casuale
 enorme onere computazionale
 utilizzabili solo per peptidi corti
Biofisica
Permette lo studio di processi dinamici complessi che
avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni
conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio:
stabilità delle proteine
variazioni conformazionali
folding proteico
trasporto ionico
Biofisica
Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare = la
configurazione molecolare in funzione del tempo, ovvero
come variano nel tempo le posizioni, le velocità e le
accelerazioni degli atomi della molecola.
La traiettoria è generata da integrazioni simultanee
dell’ equazione del moto di Newton
Fi = mi  ai
per tutti gli atomi del sistema molecolare
Biofisica
Per calcolare una traiettoria c'è bisogno:
1. delle posizioni inziali ri : si ricavano da strutture
sperimentali (cristallografia raggi X, NMR ecc.) o
ottenute con modeling;
2. delle velocità iniziali vi : si ottengono dalla distribuzione
delle velocità alla temperatura assegnata;
3. delle accelerazioni : sono determinate da una relazione
che lega la forza che agisce su un atomo all'energia
potenziale.
Biofisica
Protocollo di simulazione
Struttura iniziale
Minimizzazione dell’ energia
rimuove interazioni di Van der Waals forti che
porterebbero a distorsioni locali
Solvatazione della proteina
nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le
molecole d’acqua
Minimizzazione dell’
energia in presenza del
solvente
Fase di riscaldamento
Fase di equilibrazione
per equilibrarlo con la struttura
si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura
 nuove velocità riassegnate periodicamente a T
leggermente più alta e così via fino al raggiungimento
della T di simulazione desiderata.
la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la
struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le
velocità), l'energia
Fase di simulazione vera e propria
Biofisica
Analisi dei risultati
Campionamento periodico di
coordinate (e velocità)
Calcolo dell’energia potenziale
media in funzione del tempo
Calcolo della differenza con la
struttura di partenza in
funzione del tempo
Energia potenziale (Kcal/mol)
200
100
0
-100
-200
-300
-400
-500
-600
-700
-800
-900
0
500
1000
1500
2000
tempo (ps)
media
1700ps
1600ps
1500ps
1400ps
1300ps
1200ps
1100ps
Calcolo della superficie
accessibile al solvente e del
raggio di girazione, in funzione
del tempo
1000ps
900ps
800ps
700ps
600ps
500ps
400ps
300ps
200ps
S1
Calcolo della struttura media
H1
H2
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
100ps
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
Residue number
Biofisica
Riconoscimento molecolare
E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi
biologici.
Le molecole interagiscono in una maniera altamente
specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e
Ehrilch)
Biofisica
La complementarità geometrica e chimica fra piccole
molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei
loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un
ruolo molto importante all’interno dei processi
biologici.
Biofisica
La capacità di un recettore di agganciarsi al suo ligando
selettivamente e con alta affinità è dovuta alla formazione
di una serie di legami deboli (legami H, ionici, interazioni di
Van der Waals) sommati ad interazioni favorevoli (es.
idrofobiche).
Gli atomi del sito di legame forniscono l’impalcatura
necessaria per conferire alla superficie un dato contorno
e particolari proprietà chimiche
Variazioni anche piccole di tali amminoacidi spesso
compromettono la funzionalità del recettore
Biofisica
docking
Metodi computazionali per la predizione della struttura
3D di complessi proteina-ligando.
Insieme di tecniche che consentono di simulare
interazioni tra vari sistemi (sito attivo di un enzima e una
nuova
molecola
di
inibitore)
e
di
valutare
approssimativamente le nuove interazioni che si creano.
Biofisica
In quest’ultimo caso, viene trovato il corretto modo di
legame di un composto tramite il campionamento dello
spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la
valutazione di funzioni che stimano l’energia di ogni
combinazione confomazionale ligando-recettore.
Tali funzioni valutano fattori quali:
•Complementarità fra superficie
•Interazioni elettrostatiche e idrofobiche
•Energia libera di solvatazione
Biofisica
algoritmi
AUTODOCK, DOCK, FlexX, GOLD, GRID…
Algoritmi di docking.
Posizionano ligandi - rigidi o flessibili - in siti di binding
proteici generalmente rigidi.
Il ligando durante il binding cambia la sua struttura tridimensionale in
termini di angoli di torsione per trovare il miglior adattamento
spaziale ed energetico nel sito di binding della proteina. Questa
assunzione segue il modello “chiave-serratura” citato in precedenza.
Prendendo in considerazione anche la flessibilità del
recettore allora andrebbero considerati centinaia o anche
migliaia di gradi di libertà.
Biofisica
farmaci
Elemento chiave:
scoperta di composti guida nuovi e innovativi
Composto guida = composto che mostra affinità per un
dato recettore, che ha attività biologica e che può essere
strutturalmente modificato per migliorare la bioattività
Biofisica
tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Ricerca del composto guida (1-2 anni)
Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni)
Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni)
Test tossicologici (1-3 anni)
Test per la sicurezza sull’uomo (1 anno)
Test per l’efficacia sull’uomo (1-2 anni)
Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni
Costo totale: circa $ 500 000 000
è di grande importanza l’identificazione
RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta
affinità
Biofisica
Screening sperimentale:
test in vitro di grandi
librerie di composti.
Ignora, in genere, le
proprietà strutturali del
recettore
Metodi computazionali
detti Rational Design:
si basano su
informazioni
strutturali del
recettore e/o del
ligando
Biofisica
Metodi computazionali
Struttura 3D del recettore NON nota
QSAR (Quantitaive
Structure-Activity
Relationship)
Stabilisce una relazione tra
la struttura molecolare e
l’attività biologica di una
serie di composti attivi.
Predice la attività e la
affinità di composti non
noti
dall’analisi
delle
similitudini e differenze
strutturali con composti
noti,
fornendo
anche
informazioni sui requisiti
strutturali del recettore.
Struttura 3D del recettore nota
Structure Based Drug Design
De Novo Design
I nuovi composti
vengono generati nel
sito di legame a
partire da atomi o
frammenti
preposizionati nel
sito e che
successivamente
vengono trasformati
in molecole intere da
softwares specifici.
Screening Virtuale
Librerie di molecole
(esistenti o ipotetiche)
vengono analizzate
cercando ligandi con
caratteristiche in
accordo con i requisiti
del sito di legame
Docking
Biofisica
Biofisica
Biofisica
Le tecniche computazionali rappresentano uno
strumento molto utile per:
•la modellazione di sistemi proteici
•la comprensione dei processi biologici
•la comprensione della relazione struttura-attività
•la scoperta e ottimizzazione dei composti guida
farmacologici
Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e
farmaceutico, riducendo i tempi e completando e
indirizzando le conoscenze sperimentali
Biofisica