Il file PDB
http://www.rcsb.org/pdb
Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n)
HEADER
TITLE
COMPND
COMPND
COMPND
COMPND
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SOURCE
SOURCE
SOURCE
SOURCE
KEYWDS
EXPDTA
AUTHOR
REVDAT
REMARK
REMARK
REMARK
REMARK
fisica24ore
OXYGEN TRANSPORT
22-JAN-98
1A3N
DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN
MOL_ID: 1;
2 MOLECULE: HEMOGLOBIN;
3 CHAIN: A, B, C, D;
4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER
MOL_ID: 1;
2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS;
3 ORGANISM_COMMON: HUMAN;
4 TISSUE: BLOOD;
5 CELL: RED CELL
OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE
X-RAY DIFFRACTION
J.TAME,B.VALLONE
1
29-APR-98 1A3N
0
1
2
2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS.
3
[…]
Biofisica
tipo di
atomo
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
fisica24ore
tipo di
amminoacido
N
CA
C
O
CB
CG1
CG2
N
CA
C
O
CB
CG
CD1
CD2
N
CA
C
O
CB
OG
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
SER
SER
SER
SER
SER
SER
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
coordinate
X
Y
Z
10.720
10.228
8.705
8.164
10.602
10.307
12.065
8.091
6.624
6.176
6.567
6.020
6.386
5.998
5.730
5.380
4.831
3.725
3.095
4.308
3.076
19.523
20.761
20.714
20.005
22.000
23.296
21.951
21.453
21.451
22.578
23.730
21.707
20.649
21.119
19.337
22.237
23.237
24.027
23.717
22.429
21.786
6.163
6.807
6.878
6.015
5.966
6.700
5.544
7.775
7.763
6.821
7.022
9.129
10.198
11.577
9.795
5.852
4.928
5.568
6.591
3.727
3.991
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
21.36
24.26
18.62
19.87
27.19
31.86
31.74
16.19
17.31
18.55
18.72
18.34
17.39
17.99
16.96
15.02
16.59
14.84
14.40
16.47
14.91
N
C
C
O
C
C
C
N
C
C
O
C
C
C
C
N
C
C
O
C
O
…
Biofisica
1a3n
catena A
C
O
N
S
EME
Fe
fisica24ore
Biofisica
RASMOL v 2.7
http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm
fisica24ore
Biofisica
Tecniche computazionali
L’utilizzo complementare di tecniche di tipo
sperimentale e di tipo computazionale è
l’approccio ottimale per lo studio dei sistemi
e dei processi biologici.
Questa considerazione riguarda in particolare gli
aspetti strutturali del problema, ovvero la
conoscenza della conformazione, o variazione di
conformazione, di una molecola biologica in
relazione alla sua attività.
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Biofisica
Limiti delle tecniche sperimentali
risoluzione spaziale
strutture molecolari
relativamente rigidi
misure ad alta risoluzione di
sono possibili solo per sistemi
risoluzione energetica
analisi delle energie di
interazione atomica difficoltosa
risoluzione temporale
i primissimi eventi dei processi
biologici sono di difficile misurazione
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Biofisica
Limiti delle tecniche computazionali
Sistemi biomolecolari troppo complessi
meccanica
classica con funzioni di interazione semi-empiriche per
descrivere le interazioni tra gli atomi di un sistema
molecolare
Simulazione del comportamento di un sistema molecolare
su un computer
solo un numero limitato (<NA) atomi o
di gradi di libertà (di solito 102-105 atomi), per un limitato
periodo di tempo (102-104 picosecondi) può essere
simulato  piccoli sistemi, con tempi di rilassamento brevi
Campionatura limitata dello spazio delle conformazioni di
una macromolecola
utilizzo dei dati sperimentali per
restringerlo
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Biofisica
importanza della
COMPLEMENTARITA’
DELL’APPROCCIO TEORICOSPERIMENTALE
fisica24ore
Biofisica
Alcune Applicazioni
 In primis: conoscere la struttura tridimensionale a
risoluzione atomica della molecola per comprendere,
spiegare, e a volte anche modificare ed utilizzare, la
sua attività biologica.
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Biofisica
 Monitorare i cambiamenti strutturali indotti su peptidi o
proteine da parte di MEMBRANE BIOLOGICHE, i quali
sembrano essere fondamentali per il riconoscimento con il
recettore o per oltrepassare la fase lipidica e raggiungere
zone altrimenti inaccessibili.
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Biofisica
 Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono fornire
indicazioni utili per il riconoscimento del sito attivo o di
strutture indispensabili all'attività della molecola o dirette
ad una certa funzione.
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Biofisica
 Studiare le variazioni conformazionali provocate
dall’interazione della proteina con uno o più LIGANDI, la
quale fornisce l’attivazione (o inattivazione) necessaria
per compiere la propria funzione biologica (o per
impedirla).
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Biofisica
 Comprendere il processo di FOLDING delle proteine,
ovvero il meccanismo di ripiegamento con cui
raggiungono la confomazione biologicamente attiva.
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Biofisica
Applicazioni
FARMACOLOGICHE:
viene
fornita
un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della
struttura opportuna in funzione del bersaglio del
farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture
calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto
raggio d’azione.
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Biofisica
Modellizzazione molecolare
fisica24ore
Biofisica
Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine
a singolo dominio)
 L’informazione
codificata
nella
amminoacidica
di
una
proteina
completamente la sua struttura nativa
sequenza
determina
 Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera
della proteina
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Biofisica
Diagramma di flusso
della modellizzazione
proteica
Sequenza proteica
Allineamento multiplo
di sequenza
Proteina
omologa
nella banca dati
PDB?
Dati sperimentali
Ricerca nelle
banchedati
No
Sì
Modellizzazione
comparativa
Modello tridimensionale
della proteina
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Assegnazione
dei domini
Predizione della
struttura secondaria
Predizione
del fold
Analisi della famiglia
del fold
Allineamento delle
strutture secondarie
Allineamento della
sequenza alla struttura
Sì
E’ stato
predetto
un fold?
No
Predizione della
struttura terziaria
Biofisica
Permette di costruire la struttura
tridimensionale di una proteina
sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA
con un’altra proteina
di struttura NOTA
che viene usata come STAMPO.
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Biofisica
Passi fondamentali
1. Allineamento di sequenza con la/le proteina/e
“stampo”
* aa identici
. aa simili
fisica24ore
4mdh.aa
11BMD
1
1
SEPIRVLVTG AAGQIAYSLL YSIGNGSVFG KDQPIILVLL DITPMMGVLD
KAPVRVAVTG AAGQIGYSLL FRIAAGEMLG KDQPVILQLL EIPQAMKALE
*.** *** *****.**** . *. * ..* ****.** ** .*
* *.
4mdh.aa
11BMD
51
51
GVLMELQDCA LPLLKDVIAT DKEEIAFKDL DVAILVGSMP RRDGMERKDL
GVVMELEDCA FPLLAGLEAT DDPDVAFKDA DYALLVGAAP RKAGMERRDL
**.***.*** .*** . ** * ..**** * *.***. * *. ****.**
4mdh.aa
11BMD
101
101
LKANVKIFKC QGAALDKYAK KSVKVIVVGN PANTNCLTAS KSAPSIPKEN
LQVNGKIFTE QGRALAEVAK KDVKVLVVGN PANTNALIAY KNAPGLNPRN
* * ***
** **
** * ***.**** ***** * * *.**..
*
4mdh.aa
11BMD
151
151
FSCLTRLDHN RAKAQIALKL GVTSDDVKNV IIWGNHSSTQ YPDVNHAKVK
FTAMTRLDHN RAKAQLAKKT GTGVDRIRRM TVWGNHSSTM FPDLFHAEVD
*. .****** *****.* * *
* .. . .******* .**. ** *
4mdh.aa
11BMD
201
201
LQAKEVGVYE AVKDDSWLKG EFITTVQQRG AAVIKARKLS SAMSAAKAIC
GRP----ALE LVDME-WYEK VFIPTVAQRG AAIIQARGAS SAASAANAAI
..
* * . *
** ** *** **.* ** * ** ***.*
4mdh.aa
11BMD
251
246
DHVRDIWFGT PEGEFVSMGI ISDGNSYGVP DDLLYSFPVT IKDKTWKIVE
EHIRDWALGT PEGDWVSMAV PSQGE-YGIP EGIVYSFPVT AKDGAYRVVE
.*.** .** ***. ***.. *.*. **.* . ..****** ** . ..**
4mdh.aa
11BMD
301
295
GLPINDFSRE KMDLTAKELA EEKETAFEFL SSA
GLEINEFARK RMEITAQELL DEMEQVKALG LI
** **.*.* .*..** ** .*.*
.
Biofisica
2. Costruzione dello scheletro
fisica24ore
Biofisica
3. Inserimento delle catene laterali
fisica24ore
Biofisica
4. Inserimento dei loop corrispondenti
a “buchi” nell’allineamento
fisica24ore
Biofisica
5. Ottimizzazione del modello
Regolarizzazione
di legami, angoli e
torsioni
Eliminazioni di
clash strutturali
Minimizzazione
energetica
fisica24ore
Biofisica
6. Controllo della qualità del modello
fisica24ore
Biofisica
Meccanica molecolare
Comprende la DINAMICA MOLECOLARE,
la RICERCA DELL’ENERGIA CONFORMAZIONALE,
e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE
(DOCKING).
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Biofisica
Ad ogni conformazione molecolare è associata un’ENERGIA
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Biofisica
La meccanica molecolare considera gli atomi come sfere e i legami
come molle.
La forma più semplice dell’energia potenziale di una molecola è :
ENERGIA pot =
Energia di ALLUNGAMENTO dei legami
+ Energia di PIEGAMENTO degli angoli di legame
+ Energia di TORSIONE degli angoli diedri
+ Energia delle interazioni di NONLEGAME: repulsioni steriche, interazioni
di
Van
der
Waals,
interazioni
elettrostatiche
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Forma equazione + parametri = force field
Biofisica
Ricerca dell’energia conformazionale
Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine
a singolo dominio)
 L’informazione
codificata
nella
amminoacidica
di
una
proteina
completamente la sua struttura nativa
sequenza
determina
Fi   V ri
 Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera
della proteina
fisica24ore
Biofisica
La superficie dell'energia libera configurazionale di una
proteina è tipicamente "rugosa", poichè esistono molti
stati metastabili, alcuni dei quali hanno un'energia molto
vicina al minimo globale (problema della ricerca del minimo
assoluto)
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Biofisica
Conformazione energeticamente preferita
minimo globale dell'energia potenziale
risultante delle forze nulla Fi   V ri
equilibrio
stato più popolato
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Biofisica
Minimizzazione dell’energia
Minimizzare l'energia potenziale di una molecola significa trovare un
percorso (costituito dalle variazioni dei gradi di libertà intramolecolari) che
conduca da una conformazione iniziale alla conformazione a minima energia
più vicina (MINIMO LOCALE), usando il minor numero di calcoli possibile.
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Biofisica

Campionamento energetico sistematico:
L’energia viene campionata ad intervalli regolari sull’intera estensione di
ciascun grado di libertà (tipicamente rotazioni dei legami).
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Biofisica
 Annealing simulato:
riscaldamento ad alta temperatura che modifica la
struttura superando le barriere energetiche, seguito da
un raffreddamento lento.
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Biofisica
 Ricerca casuale:
campionamento che genera strutture in maniera casuale,
le quali vengono poi minimizzate
 Dinamica molecolare:
superamento delle barriere energetiche conformazionali
(più basse dell'annealing) e analisi della stabilità
strutturale.
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Biofisica
Dinamica molecolare
Permette lo studio di processi dinamici complessi che
avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni
conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio:
stabilità delle proteine
variazioni conformazionali
folding proteico
trasporto ionico
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Biofisica
Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare = la
configurazione molecolare in funzione del tempo, ovvero
come variano nel tempo le posizioni, le velocità e le
accelerazioni degli atomi della molecola.
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Biofisica
La traiettoria è generata da integrazioni simultanee
dell’ equazione del moto di Newton
Fi = mi  ai
per tutti gli atomi del sistema molecolare
Tenendo presente che la forza si può esprimere come
gradiente dell'energia potenziale:
Fi = - dV/dri
si combinano le due equazioni e si ottiene:
- dV/dri = mi d2ri/dt2
che collega la derivata dell'energia potenziale alle
variazioni di posizione in funzione del tempo ed è
quella che viene integrata.
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Biofisica
Perciò per calcolare una traiettoria c'è bisogno:
1. delle posizioni iniziali degli atomi (coordinate
atomiche)
2. delle velocità iniziali
3. delle accelerazioni
1. le posizioni inziali ri si ricavano da strutture sperimentali
(cristallografia raggi X, NMR ecc.) o ottenute con
modeling;
2. le velocità iniziali vi si ottengono dalla distribuzione delle
velocità ad una data temperatura;
3.
le accelerazioni sono
dell'energia potenziale.
fisica24ore
determinate
dal
gradiente
Biofisica
Le posizioni e le velocità iniziali (t = 0) determinano
le posizioni e le velocità a tutti gli altri tempi t.
In pratica si considerano intervalli di integrazione
finiti Dt. Dt tipicamente va da 0.1 a 10 fs per i sistemi
molecolari  una simulazione di 100 ps coinvolge 105106 intervalli di integrazione.
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Biofisica
Sistema allo zero assoluto
Riscaldamento lento alla temperatura di simulazione
Riequilibrazione dell’energia tra gli atomi
Temperatura di simulazione desiderata
Energia cinetica totale del sistema
Distribuzione iniziale di velocità vi
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Biofisica
Struttura iniziale
Minimizzazione dell’ energia
rimuove interazioni di Van der Waals forti che
porterebbero a distorsioni locali
Solvatazione della proteina
nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le
molecole d’acqua
Minimizzazione dell’
energia in presenza del
solvente
Fase di riscaldamento
Fase di equilibrazione
per equilibrarlo con la struttura
si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura
 nuove velocità riassegnate periodicamente a T
leggermente più alta e così via fino al raggiungimento
della T di simulazione desiderata.
la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la
struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le
velocità), l'energia
Fase di simulazione vera e propria
fisica24ore
Biofisica
Analisi dei risultati
Campionamento periodico di
coordinate (e velocità)
Calcolo dell’energia potenziale
media in funzione del tempo
Calcolo della differenza con la
struttura di partenza in
funzione del tempo
Energia potenziale (Kcal/mol)
200
100
0
-100
-200
-300
-400
-500
-600
-700
-800
-900
0
500
1000
1500
2000
tempo (ps)
media
1700ps
1600ps
1500ps
1400ps
1300ps
1200ps
1100ps
1000ps
900ps
Calcolo della superficie
accessibile al solvente e del
raggio di girazione, in funzione
del tempo
800ps
700ps
600ps
500ps
400ps
-strand
300ps
-helix
200ps
S1
H1
H2
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
100ps
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
Residue number
Calcolo della struttura media
fisica24ore
Biofisica
Riconoscimento molecolare
E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi
biologici.
Le molecole interagiscono in una maniera altamente
specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e
Ehrilch)
fisica24ore
Biofisica
La complementarità geometrica e chimica fra piccole
molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei
loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un
ruolo molto importante all’interno dei processi
biologici.
fisica24ore
Biofisica
Elemento chiave:
scoperta di composti guida nuovi e innovativi
Composto guida = composto che mostra affinità per un
dato recettore, che ha attività biologica e che può essere
strutturalmente modificato per migliorare la bioattività
fisica24ore
Biofisica
tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Ricerca del composto guida (1-2 anni)
Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni)
Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni)
Test tossicologici (1-3 anni)
Test per la sicurezza sull’uomo (1 anno)
Test per l’efficacia sull’uomo (1-2 anni)
Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni
Costo totale: circa $ 500 000 000
è di grande importanza l’identificazione
RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta
affinità
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Biofisica
Screening sperimentale:
test in vitro di grandi
librerie di composti.
Ignora, in genere, le
proprietà strutturali del
recettore
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Metodi computazionali
detti Rational Design:
si basano su
informazioni
strutturali del
recettore e/o del
ligando
Biofisica
Metodi computazionali
Struttura 3D del recettore NON nota
QSAR (Quantitaive
Structure-Activity
Relationship)
Stabilisce una relazione tra
la struttura molecolare e
l’attività biologica di una
serie di composti attivi.
Predice la attività e la
affinità di composti non
noti dall’analisi delle loro
similitudini e differenze
strutturali,
fornendo
informazioni sui requisiti
strutturali del recettore.
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Struttura 3D del recettore nota
Structure Based Drug Design
De Novo Design
I nuovi composti
vengono generati nel
sito di legame a
partire da atomi o
frammenti
preposizionati nel
sito e che
successivamente
vengono trasformati
in molecole intere da
softwares specifici.
Screening Virtuale
Librerie di molecole
(esistenti o ipotetiche)
vengono analizzate
cercando ligandi con
caratteristiche in
accordo con i requisiti
del sito di legame
Docking
Biofisica
Predice la struttura 3D di complessi proteina-ligando.
Trova il corretto modo di legame di un composto, tramite
il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di
legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano
l’energia di ogni combinazione confomazionale ligandorecettore.
Tali funzioni valutano:
•Complementarità fra superficie
•Energia libera di solvatazione
•Interazioni elettrostatiche e idrofobiche
fisica24ore
Biofisica
fisica24ore
Biofisica
fisica24ore
Biofisica
Le tecniche computazionali rappresentano uno
strumento molto utile per:
•la modellazione di sistemi proteici
•la comprensione dei processi biologici
•la comprensione della relazione struttura-attività
•la scoperta e ottimizzazione dei composti guida
farmacologici
Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e
farmaceutico, riducendo i tempi e completando e
indirizzando le conoscenze sperimentali
fisica24ore
Biofisica