Lezione 15 - 16
mercoledì 20 aprile 2011
corso vettori biologici II
Biotec industriali
ore 14:00 -16:00 aula 6A
La reazione a catena della DNA polimerasi
PCR “polymerase chain reaction”
Descrizione della tecnica, metodo, componenti,
variabili, strumenti = termociclatori
Tecnica: amplificazione esponenziale a cicli successivi tramite
DNA polimerasi (adesso e’ termo resistente)
DNA polimerasi di “thermophilus aquaticus” (Taq polimerasi)
- salto di qualita’ del metodo, molto piu’ efficiente.
Le applicazioni si sono moltiplicate nella ricerca biologica e
medica, nella diagnostica e medicina forense (legale)
Il principio sfrutta l’efficienza (velocita’ di sintesi) della DNA
polimerasi utilizzando due inneschi (primers) artificiali scelti dallo
sperimentatore sulla sequenza da amplificare (modo esponenziale).
Come si fa la PCR, in cosa consiste
Reazione a Catena di Polimerizzazione RCP
PCR
- amplificazione tramite sintesi de-novo di nuovi filamenti di DNA
da parte della DNA polimerasi di Thermophilus aquaticus
- definizione: reazione ad amplificazione esponenziale con un
raddoppio teorico della quantità di DNA ad ogni ciclo di sintesi.
La DNA polimerasi di cosa ha bisogno ?
- del templato denaturato a singolo filamento (forca replicativa?)
- dei primers (inneschi)
- dei nucleotidi per la sintesi
- del tampone
- del Magnesio
le tre temperature
1 denaturazione del DNA a 94°C
2 appaiamento (“annealing”) dei primers al ssDNA templato,
temperatura misurata sulla t° di denaturazione dei
primers
3 temperatura ottimale di sintesi della Taq polimerase
72°C
che eviti rinaturazione e amplificaz.
aspecifiche
alla fine del ciclo prima si doveva riaggiungere la polimerasi
ogni fase del ciclo può durare da 30” ad 1’ o più minuti
secondo la lunghezza del frammento da amplificare
(oltre 1’ per più di 2 kb fino a 10’ per 10 kb)
applicazione del sistema naturale
la sintesi del DNA è semiconservativa (duplicazione)
le DNA polimerasi e anche le RNA pol sintetizzano tutte sullo
stesso modello di funzionamento:
con il verso 5’- 3’ su uno stampo (templato) antiparallelo 3’-5’
partendo dal 3’ libero di un innesco (primer) appaiato sul
templato
5’
3’
primer
3’
neosintesi
5’
anche in vitro si può sfruttare il metodo naturale di sintesi
l’invenzione geniale
dalla amplificazione lineare a quella esponenziale:
la sintesi in vitro di DNA già era stata usata anche per le
reazioni di sequenziamento, ma solo per una delle due eliche
5’
3’
primer
3’
neosintesi
5’
se aggiungiamo un primer sulla catena complementare:
5’
neosintesi 3’
5’
3’
otteniamo una amplificazione di tutte e due le eliche,
e poi ? se la reazione coninua è esponenziale !
attenzione al verso dei primers
la doppia elica di DNA ha i due filamenti antiparalleli dovuti al
sistema che è stato selezionato
in origine con le
polimerasi degli acidi nucleici che sintetizzano tutte nello
stesso verso 5’ 3’ da un 3’ libero e su un templato 5’ 3’
5’
3’
3’
5’
denaturazione
sintesi
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
sintesi
dopo la sintesi si otterrano 2 doppie eliche identiche alla prima
se la reazione in vitro continua
5’
3’
3’
5’
1 doppia elica
sintesi
5’
denaturazione
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
sintesi
2 doppie eliche
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
diventa una reazione esponenziale
la tabellina del 2
1x2=2
2x2=4
4x2=8
ma come è possibile fare avvenire la reazione senza
farla fermare ? da sola una doppia elica non si
duplica se non si ha la separazione (denaturazione)
delle due eliche neosintetizzate !
Il ciclo (non il velocipede)
Primer frw.
+
_
= seq +
Denaturazione
5’
3’
3’
5’
Primer rev.
= seq -
2 eliche
Annealing a ~ 50°- 60° C
pr. rev.
5’
3’
pr. frw.
3’
5’
Extension (Polimerizzazione)
3’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
I CICLO
5’
Denaturazione
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
4 eliche
Ciclo continuo
Annealing Extension (Polimerizzazione)
5’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
3’
5’
3’
II CICLO 4 eliche
5’
Denaturazione
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
8 eliche
IV ciclo
32 eliche…..
La crescita e’ esponenziale : teoricamente ad ogni ciclo un raddoppio di
DNA, ma dipende dalla messa a punto del protocollo di reazione,
molte variabili da ottimizzare
III CICLO
16 eliche
- senza contaminazioni amplificazione da quantita’ minime di DNA
(famtogrammi o singole cellule)
- genoma diploide
2 doppie eliche di templato in interfase
Le condizioni di reazione di ogni passaggio
vanno determinate per i tempi, temperature e
quantita’(conc.) ogni ciclo = 3 passaggi (fasi)
I
passaggio denaturazione (5-10 min. quella iniz. della reazione)
II passaggio appaiamento dei primers (annealing)
III passaggio di sintesi del DNA,
estensione del filamento di DNA a partire dai primers (inneschi)
Fine del ciclo
Alla fine dei cicli programmati viene fatta una estensione di
5 -10 min. per assicurare il completamento della sintesi di
tutti i nuovi frammenti iniziati e non terminati
i reagenti della reazione enzimatica
l’enzima sarà una Taq polimerasi (ne esistono diverse
ottenute da mutanti che aumentano la specificità,
efficienza e lunghezza del frammento amplificato
il DNA templato sufficientemente purificato se genomico
ad alto peso molecolare
i primers di sintesi prodotti da ditte specializzate (15-25 bp)
la concentrazione del Mg di solito 1,5 mM
il Buffer ottimale per la polimerasi
H2O per portare al volume finale di reazione ~ 50 microlitri
Le componenti per la reazione:
Volume di reazione: da 10 a 50 ml (max 100 ml) per una
preparativa.
Il DNA (templato), abbastanza pulito, non deve essere purissimo, la quantita’
puo’ essere molto poca, normamlmente si usano 10-100 ng di un genoma
eucariotico, più di 500 ng possono inibire della reazione
La Taq polimerasi, DNA polimerasi di “thermophilic eubacterium thermus
acquaticus” resiste a 95°, frequenza di errore superiore a quelle di eucarioti,
26 x10- 6, ora ce ne sono per diverse finalita’, a basso tasso di errore = high fidelity
8.5 x10- 6, e per frammenti lunghi genomici. Se ne usa da meno di 1U fino a 5 U,
ma se si fanno molti cicli conviene spezzare la reazione in due fasi e riaggiungerla
dNTPs: conc. standard 100 mM per ognuno
Il tampone: sale di Tris, il Mg concentrazione empirica tra 0. 5 mM e 4. 5 mM,
ogni Taq pol. ha un tampone con concentrazioni saline (buffer) ideali
I primers: scelti per funzionare in coppia, evitare GC ed AT finali, palindromi,
sequenze complementari, devono avere TM(melting) simili,
H2O q.b. sterile incontaminata per arrivare al volume finale
nel caso del pyrosequencing
la PCR si utilizza per amplificare i frammenti random da
sequenziare a cui sono stati attaccati dei primers tramite
ligasi e che fanno da inneschi, prima per la PCR e poi per
la reazione di pirosequenziamento delle palline collocate
nelle celle in cui entra una pallina solamente.
La reazione è colorimetrica tramite un metodo che
vedremo più avanti
applicazioni della PCR
RT-PCR, nested PCR
RACE 3’ e RACE 5’
PCR inversa
Mutagenesi
Pcr quantitativa e semiquantitativa competitiva
variazioni sul tema PCR multiplex
Real Time PCR abbreviata = RT-PCR da non confondere
AFLPs
(uso di adapters anche col random sequencing e PCR)
3C = chromosome conformational capture e varianti
Ricerca di un vettore
Per inserzione random nel genoma
Per inserzione sito specifica nel genoma
Cosa cambia?
Cambia la regione limitrofa
Gene targeting deve avere regioni limitrofe note a)
Random recombination ha regioni limitrofe ignote b)
Due tipi di PCR per poter fare l’analisi delle regioni limitrofe
a) PCR classica con primers interni ed esterni alla regione
che ricombina col vettore
b) PCR inversa per identificare le regioni limitrofe
Altre possibilità di analisi tramite PCR
- perfezionamenti delle tecniche e degli enzimi
- nuove macchine con determinazione in tempo reale (realtime PCR) tramite laser (light-cycler) del DNA o cDNA
amplificato proporzionale al templato iniziale presente nel
campione in analisi.
Questa è la PCR quantitativa, diversa dalla PCR
semiquantitativa o competitiva.
La PCR quantitativa da un valore assoluto rispetto ad un
amplicone di riferimento a quantità nota con la così detta
curva di taratura da cui si ricava un c/t value (threshold cycle)
Altre possibili applicazioni della PCR
- abbiamo visto RT-PCR
tramite reverse transcriptase da mRNA
RT-PCR è il metodo per determinare l’espressione o meglio la
trascrizione di un gene
- alternativa all’analisi Northern ma non determina la lunghezza
del mRNA, solo la presenza e volendo la quantità trascritta
applicazione RT-PCR
nuovo esercizio: se devo retrotrascrivere un mRNA per
ottenere un un cDNA
devo fare prima una retrotrascrizione con random priming
con esanucleotidi
e poi la PCR per vedere se il gene è espresso (trascritto)
esperimento sostitutivo di un Northern, ma non dice la
lunghezza del messaggero
i primers come li scelgo ? : sulla sequenza coding che è
quella depositata in banca dati e che non è il cDNA che
sarebbe il DNA complementare all’mRNA dopo retrotrascriz.
quindi si selezionano i primers come per una normale PCR
purchè si abbia la sequenza corrispondente a quella coding
= al mRNA = sequenza codificante (quella in banca dati)
La reverse trascrittasi RT
L’uso della reverse trascrittasi risale a quando furono scoperti i
meccanismi molecolari con cui i virus ad RNA si replicavano
all’interno delle cellule infettate.
Le più utilizzate sono quelli della Murine Moloney leukemia
virus MMLV, Avian myeloblastosis virus AMV che poi sono
state anche trasformate per resistere meglio ad alta
temperatura per fare la “one step RT-PCR”
Oltre alle RT anche le Taq polimerasi sono state migliorate per
efficienza ed affidabilità (riduzione di errori di sintesi).
RT-PCR: cosa si analizza
= analisi della trascrizione di un gene o isolamento di un cDNA senza Northern
blot o screening di una cDNA library (si deve avere una sequenza nota).
La RT-PCR: da RNA totale di cellule per verificare che sia trascritto quel
particolare gene. Basta una quantità di RNA molto piccola a differenza di un
northern dove per ogni corsa ci occorrono 2-3 mg di poly A mRNA o 7-10 mg di
RNA totale. Nel caso di una cDNA library la quantita’iniziale di RNA e di lavoro
e’assai maggiore.
RT-PCR classica:
- Primo filamento o con primer di oligo dT o random priming con esanucleotidi. L’enzima funziona a 37°C; mutanti resistono fino a 60°C.
- Si retrotrascrive tutto l’mRNA o tutto l’RNA, nel caso in cui i trascritti siano
molto lunghi e l’enzima potrebbe non completare la retrotrascrizione a partire dal
polyA.
- Dall’RNA va eliminato il DNA genomico.
- Dopo la sintesi del primo filamento di DNA si puo’ far partire una normale PCR,
ma si fa un trattamento di RNase per eliminare l’RNA, gli esanucleotidi e l’oligo
dT; ci sono protocolli in cui si fa un’unica reazione perche’ la temperatura della
PCR e’ selettiva e la Taq hot-start non si attiva prima di essere portata oltre 70°C.
stratagemmi della RT-PCR
Accorgimento: quando si estrae l’RNA si deve evitare il DNA
e si puo’ fare un trattamento di DNAse,
e/o scegliere i primers a cavallo di due esoni
I filamento con rev transcript. a bassa temp.
II filamento con Taq polymerase, I coppia di primers
(sulla sequenza del mRNA). Non si vede tutto il trascritto, come in un
Northern, non se ne puo’ valutare il peso, ma solo se quel frammento
e’ trascritto (cioe’ se c’e’ quel mRNA), non si vede lo “splicing”
alternativo salvo scelta dei primers su esoni diversi
Valgono tutte le cose che si sanno per la PCR compreso rischio di
amplificazioni aspecifiche, la reazione va messa a punto ogni volta.
A differenza del Northern la buona amplificazione del frammento
(amplicone) puo’ dipendere non solo dal fatto che c’e’ molto mRNA,
ma anche dall’efficienza della PCR, quindi così non e’ quantitativa.
la retrotrascrizione
Per RT si intende reverse transcriptase su templato di RNA
Per avere un cDNA (DNA complementare ad un RNA messaggero) si deve
retrotrascrivere l’mRNA cioe’ farlo diventare DNA
I retrovirus ad RNA fanno la sintesi del DNA complementare al loro cromosoma
ad RNA tramite una DNA polimerasi specifica che usa come templato RNA
anziche’ DNA.
Pero’ sempre con la sintesi in direzione 5’-3’come ogni polimerasi.
L’enzima “reverse transcriptase” o trascrittasi inversa che si utilizza non e’
termoresistente, ma deriva da un retrovirus eucariotico, AMV avian
myeloblastosis virus, M-MuLV Moloney leukemia virus murino ed anche altri.
Piu’ recentemente sono state isolate e clonate delle RT mutanti che resistono a
temperatura piu’ alta di 37°C fino a 60°C per aumentare specificità.
Le tecniche precedenti per lo studio della trascrizione erano l’analisi Northern e
l’isolamento dei cDNA da libraries clonate in vettori vari.
vantaggi della RT-PCR
Analisi della trascrizione tramite PCR
Analisi a partire da piccole quantità di RNA totale,
svantaggio: non si sa la lunghezza del cDNA o mRNA
Analisi della trascrizione e non determinazione del PM
dei trascritti (Northern)
Analisi dei livelli di trascrizione più fine per la sensibilità
del metodo, se si vedessero tramite Northern le stesse
quantità il Northern sarebbe più informativo (anche PM)
Ampliconi possibilmente a cavallo di introni, perché ?
come si fa una RT-PCR
Si deve ottenere il retrotrascritto cioè il cDNA ( DNA
complementare all’ mRNA)
Si parte da estratti di RNA totali o arricchiti per poly +(A) su
resina con oligo dT
La retrotrascrizione può avvenire con primers di esanucleotidi
random o con poly T, a seconda della lunghezza dei trascritti e
se si vogliono tutte le regioni trascritte o sempre a partire dal
3’ poliadenilato.
RNA è molto instabile e vanno usati degli inibitori delle Rnasi
per evitare che si degradino. Il cDNA è molto più stabile e si
conserva meglio e più a lungo.
Il cDNA si utilizza per la PCR però c’è un solo filamento
complementare al trascritto con senso 5’-3’ inverso.
RT-PCR dal II filamento in poi
Accorgimenti e controlli della RT-PCR
Prima di retrotrascrivere il cDNA si tratta l’RNA con DNAse per
eliminare ogni traccia di DNA genomico che potrebbe dare falsi
positivi.
Ottenuto il cDNA dalla reverse trascrittasi si passa alla PCR
vera e propria con i primers specifici della regione del
messaggero che vogliamo amplificare.
Come accorgimento si può (si deve quando è possibile)
amplificare un amplicone che comprende due porzioni di due
esoni diversi e così non si amplifica il frammento di DNA
genomico che è molto più lungo in quanto contiene l’introne.
Naturalmente la lunghezza dell’amplicone è sempre
ragionevole e non c’è nessun bisogno di amplificare esoni interi,
ma sequenze dalle 150 alle 500 pb.
genomic & coding sequence, mRNA, cDNA
genomic sequence con esoni ed introni
5’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
coding sequence, solo esoni (gene bank)
mRNA = coding sequence
cDNA primo filamento
3’
3’
RT
PCR su cDNA a due filamenti
5’
3’
5’
Correzione parametri di una PCR
La PCR deve dare dei prodotti che corrispondono agli attesi
Quando i prodotti non sono gli attesi:
Smear - poca specificità nonostante i primers specifici
- si gioca sulla temperature di “annealing”, temp.
su
- cicli troppo lunghi rendono aspecifica l’amplificazione
Bassa amplific. - stringenza “annealing” alta, temp.
giù
- ciclo troppo corto, allungare tempi di annealing o extension
Ritocco dei parametri del protocollo, le variabili, il ciclo,
sequenza di un cDNA dalla banca dati
per aumentare specificità?
facciamo una doppia PCR :
la seconda interna alla prima = nested PCR
se abbiamo provato ad ottimizzare in ogni modo la nostra PCR
e vediamo che si amplificano altri frammenti si prova a fare
una seconda PCR sul primo prodotto con nuovi primers
amplificazioni
aspecifiche,
peso
molecolare
diverso
dall’amplicone
prescelto
la sequenza 5’- 3’ di un cDNA
GGATCCCTGT
ATTTTGAAAT
TGAGTCCTGT
AGTGGTGGAG
CACTGGTAGA
CAGAGGGGTG
AGGCCCTGTG
GACTTAGCAC
AGGGGAGGCC
CCTCTTGAAT
GAGTCATTGT
GTTCTGAGAA
CCTGAGCGAG
AGTCAGCTAG
CAACCACGGT
GAGAGAGACA
AGACAGACAC
CAGGGAGGGA
AGAAAGAGAG
ATGGGAGAAA
TCCTGATCAC
CTGATTCCTT
CTGATTTCTG
GGAGCTCCAG
TGAAGAAATG
TGTAGGCCCC
AGTACACCCA
TGGGGAGGGG
ATGCCGTTTG
AGACCTGCAG
GAACACAGCC
ACATGCCCCA
GGGCTGCAGC
GGCTTTCCAG
CTATCTGAGG
GGGATGGGGA
AGAGAGAGAG
CAGAGGCGAG
AGAGATGAGA
AAGAGAGGAG
TGATCTCTGG
TTCTGAGCAT
AGCCTTGGCC
GGGAGCCGAG
ACCCCAATGA
AGGAGGACTT
GCCCCAGCCC
GTACAGTACA
TATTCTCTTG
AAATACCCAA
CAGGTCAGGT
AAACCGAGAC
CACAGGTAGG
GTCCAGGGTT
GGAGAGACAA
GAGACAAGAG
ATGGGGATGG
GCCAGTGACA
TGAGAGAGAT
ATGGGAACAG
TTCTTTTATT
GTATCAGTCT
CTCATGAGTA
ACCCTCTCAG
TTGCTCCATT
GGTGGGGAGA
CTAAGGGGTC
GGAGTGGGGA
CTTTTCTCTC
AATAGCCCTG
GTTCCAGCCA
CTGGCCAGGT
CCCAGCCCCA
AGGCAGAGGT
GAGACACAGA
AGACAGGAAA
AGAGAGATAA
GAGACAGAGT
CAGAAGAAAC
GAAAAAGAGA
ATGCATATTC 50
GACTAGACAC
calcolate:
AGTGACCTGC
TGCATGTACT la T°C e
CTTCCAGGCT
lunghezza
AGACCAGCCC
GCCAGGTCTC ampliconi
CAGGAAGGTG
da bp a bp
TCTCCTGAAG
TGGGGTGGCT 500
GAGAACTGCT
GTGCCTGGGG
scrivete i
ACCAGCCCAG
CAGCCAGGGT
primers
GACATAGAGA
da 5’ a 3’
GGAGAGACAA
GAGACAGGGA
TACAAGAGAC
GGAGACACAG
CATGGAGACA 1000
I coppia rossa amplicone + lungo
II coppia celeste nested amplicone + corto
una nested PCR
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
gatcacaggt
cgtctggggg
gcagtatctg
acaggcgaac
acaattgaat
aacccccccc
aaacaaagaa
acttttaaca
atctcatcaa
taccccgaac
aagcaataca
tcctagcctt
gttcaccctc
tcaaaacgct
aaacgaaagt
gcggtcacac
cctccccaat
actacgaaag
ctatcaccct
gtgtgcacgc
tctttgattc
atacctacta
gtctgcacag
tccccccgct
ccctaacacc
gtcacccccc
tacaaccccc
caaccaaacc
ctgaaaatgt
tctattagct
taaatcacca
tagcctagcc
ttaactaagc
gattaaccca
aaagctaaaa
tggctttaac
attaaccact
gatagcattg
ctgcctcatt
aagtgtgtta
ccgctttcca
tctggccaca
agcctaacca
aactaacaca
gcccatccta
ccaaagacac
ttagacgggc
cttagtaaga
cgatcaaaag
acacccccac
tatactaacc
agtcaataga
ctcacctgag
atatctgaac
cacgggagct
cgagacgctg
ctattattta
attaattaat
cacagacatc
gcacttaaac
gatttcaaat
ttattttccc
cccagcacac
cccccacagt
tcacatcacc
ttacacatgc
ggacaagcat
gggaaacagc
ccagggttgg
agccggcgta
ttgtaaaaaa
acacaatagc
ctccatgcat
gagccggagc
tcgcacctac
gcttgtagga
ataacaaaaa
acatctctgc
tttatcttta
ctcccactcc
acacaccgct
ttatgtagct
ccataaacaa
aagcatcccc
caagcacgca
agtgattaac
tcaatttcgt
aagagtgttt
ctccagttga
taagacccaa
ttggtatttt
accctatgtc
gttcaatatt
cataataata
atttccacca
caaaccccaa
ggcggtatgc
catactacta
gctaacccca
tacctcctca
ataggtttgg
gttccagtga
gcaatgcagc
ctttagcaat
gccagccacc
tagatcaccc
cacaaaatag
actgggatta
1frw
2frw
2rev
1rev
determinare lunghezza posizione T melting dei primers
lunghezza ampliconi = da bp n.x a bp n.y e posizione
i controlli essenziali
Controlli, negativi, positivi,
(i controlli ci fanno capire se l’esperimento è venuto bene)
Cosa è il controllo negativo? E quello positivo?
A cosa servono?
Rischio contaminazione (il DNA templato potrebbe essere
presente nell’ambiente dove si esegue l’esperimento)
Perché si ha contaminazione ?
procedure
a differenza del Northern si può usare quantità minime di RNA
la Rev Transcript virale a 37°C, mutanti max 65°C
oligo dT, random priming con esanucleotidi,
dal cDNA in poi PCR
sistemi onnicomprensivi con entrambe le reazioni
PCR con primers esonici
Primers: le stesse condizioni di scelta di PCR diretta
precauzioni
estrarre RNA eliminando DNA genomico che falsifica il
risultato
cosa si vuole vedere con RT-PCR: la trascrizione di un gene
come eliminare il DNA: con estrazioni specifiche con
gradiente in ClCs o con solventi specifici (Guanidina)
dopo l’estrazione trattamento con DNAse
scelta di primers su esoni diversi: il DNA contaminante ha
peso molecolare maggiore (introni)
può essere quantitativa?
la RT-PCR può essere quantitativa
l’amplificazione è proporzionale alla quantità di templato
l’amplificazione è proporzionale alla quantità iniziale
dopo un certo numero di cicli c’è saturazione
saturazione = impossibilità di rilevazione delle differenze o
di crescita lineare del prodotto di amplificazione, si perde la
proporzionalità di amplificazione e quindi una risposta di
tipo quantitativo, resta solo una indicazione qualitativa.
perchè quantitativa ?
l’amplificazione è proporzionale al templato iniziale,
perchè si conserva la proporzionalità anche dopo molti cicli
di amplificazione ?
rispondete perchè già lo sapete!
la rivelazione su gel
dopo elettroforesi su gel di agarosio si rivela il DNA
amplificato come intensità di banda
QuickTime™ and a
TIFF (LZW) decompressor
are needed to see this picture.
controllo di RT-PCR
altro controllo negativo :
assenza di amplificazione sui campioni di RNA non
retrotrascritti
se si amplifica cosa vuol dire?
altro controllo positivo nel caso che il trascritto sia assente
o debolissimo:
amplificazione con primers per un gene house-keeping
Controlli della PCR
Controlli di estrazione: quali?
- ripetibilità della amplificazione
- ripetibilità su campioni indipendenti
- univocità di amplificazione col protocollo ottimizzato
Controlli di contaminazione: quali?
- a. estrazione di controllo con i prodotti di estrazione
- assenza di amplificazione su a.
- b. assenza di amplificazione
su tutti i prodotti di reazione della PCR:
primers
taq polimerase
nucleotidi
tampone
acqua di diluizione
R.A.C.E.
Con la RT-PCR si amplifica solo un frammento del cDNA
Se si vuole identificare l’intero cDNA e non si conosce e si vuole
evitare lo :screening” di una “library” si può ricorrere alla RACE
Rapid amplification of cDNA ends 5’ or 3’ unknown
-I) retrotrascrizione fatta con primers random o con poly T
-quale è la differenza nella scelta di una strategia o dell’altra?
-se si cerca il 5’ si userà il random priming (esanucleotidi)
-se si cerca il 3’ si usaerà oligo dT
a meno che non si voglia usare un primer specifico anche per
la RT
3’
5’
AAAAA
mRNA
Principi della RACE
(Rapid Amplification of cDNA Ends)
La RACE è una tecnica per l’amplificazione di sequenze
nucleotidiche, usando come stampo un mRNA tra una ben
definita regione interna ad esso ed una sua estremità (3’ o 5’).
Questa tecnica, nota anche come “one-sided” PCR o “anchored”
PCR, puo’ essere considerata una variante della più classica PCR.
LIMITE PRINCIPALE
La RACE richiede almeno una regione a sequenza nota e interna
all’mRNA che si vuole tipizzare.
Differenze nella ricerca di 5’ o 3’ ignoti
AAAAA 3’
5’
mRNA
oligo esa nucleotidi random
poly TTTTT 5’
3’
cDNA primo filamento prodotto dalla RT (completi e non)
3’
5’
TTT 5’
3’
3’
5’
I cDNA ottenuti possono avere estremità diverse a secondo
dell’efficienza della RT, e dei primers usati
Cerchiamo il 3’ sconosciuto
In questo caso si usa un oligo dT per sintetizzare il cDNA
-Prima della RT si può effettuare una reazione di DNase per
eliminare il DNA genomico che potrebbe dare falsi positivi
perché contamina l’ RNA e successivamente il cDNA
-Dopo la reazione di RT si può fare una reazione di RNase per
eliminare RNA
regione nota
cDNA
regione ignota
3’
RT = reverse transcriptase / trascrittasi inversa
TTTTT
5’
Cosa serve per fare la RACE
Un aiuto non indifferente è dato:
Dalle banche EST (expressed sequence tags);
Da studi di funzione (per esempio EXON e PROMOTER
TRAPPING);
Dall’IBRIDAZIONE con sequenze conservate evolutivamente
e/o funzionalmente.
Race ricerca del 3’ ignoto
5’ noto
mRNA
3’ ignoto
3’
poly A
TTTTTT
5’
sintesi del I filamento di cDNA con RT con
primer oligo dT
trattamento con RNase
PCR con primer frw. noto e primer rev. con
coda aggiunta
TTTTTT
5’
5’ noto
3’
TTTTTT
3’
5’
3’ ignoto
prim.frw
prim rev.
Scelta dei primers per la RACE 3’
Il primo primer obbligato è quello per la RT (poly T)
Il secondo primer viene scelto nella regione nota e deve
essere specifico
regione nota
cDNA
regione ignota
TTTTT
3’
5’
primer specifico
Una amplificazione con un solo primer specifico potrebbe dare
dei prodotti anche aspecifici.
Quale strategia si può adottare ? Esiste una possibilità per
aumentare la specificità di reazione, per ottenere il prodotto
specifico corrispondente a ciò che sto cercando ?
RACE 3’
1 - Annealing tra la coda di polyA dell’mRNA e un primer contenente una
coda di oligo(dT) all’estremità 3’ e retrotrascizione
5’
5’
3’
mRNA
poly(A) tail
AAA….AAAn
TTT…..TTT
5’
AAA….AAAn
TTT…..TTT
Alla facile degradabilità dell’RNA;
All’alta probabilità di avere un RNA con
strutture secondarie;
Alla bassa specificità di questa fase;
5’
Nested PCR o PCR interna
regione nota
cDNA
3’
regione ignota
TTTTT
I primer specifico
5’
II primer specifico
Il secondo primer specifico dovrà corrispondere ad una regione
interna a quella nota e più al 5’ del cDNA e cioè più al 3’ nella
regione nota dell’ mRNA (coding sequence)
La seconda amplificazione perderà la regione corrispondente al
primo primer,
-si tratta di sequenza già nota e non si perde informazione,
-probabilità alta di avere un frammento specifico
- probabilità bassa che due sequenze omologhe siano limitrofe
due volte nel genoma.
- in casi estremi si può ricorrere ad un terzo primer interno.
un trucco che inganna la
polimerasi
5’ primer 3’
3’
5’
5’
3’
3’
la polimerase estende da un 3’ libero su un templato
la polimerase estende da un 3’ libero purchè appaiato
5’
poco importa se ha una parte al 5’ non appaiata, verrà
inglobata lo stesso nell’amplicone e ne farà parte dalla
amplificazione successiva in cui serve da templato
Race fasi successive
2 - Degradazione del templato di RNA
3’
TTT…..TTT
5’
3 - Amplificazione per PCR usando un primer specifico del gene (GSP)
ed uno specifico alla nuova estremità 5’(AUAP o UAP)
3’
GSP
TTT…..TTT
…e la
specificità???
5’
UAP
AUAP
gsp = gene specific primer
Uap = universal amplification primer
Auap = abridget univ.ampl. primer
Specificità GSP2
La SPECIFICITA’ può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un
secondo primer gene specifico (GSP2)
GSP 2
5’
3’
TTT…..TTT
3’
5’
UAP
- SEQUENZIAMENTO DIRETTO;
- CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO;
- STUDI FUNZIONALI;
AUAP
I primers UAP e AUAP servono per avere
delle T melting su cui disegnare i GSP
PCR nested RACE 3’
Nel caso di una RACE 3’ cambia solo il verso dei primers interni alla regione
nota ed il primer del 3’ ignoto può essere anche un poly T con una coda per
avere una T° melting più consona ai primers interni
seq nota
mRNA
5’
AAAA 3’
RT reverse trascrittasi
cDNA
3’
I filamento
TTTT 5’
RACE 3’
3’
5’
I filamento
TTTT 5’
II filamento
AAAA 3’
I prim
II prim
prim esterno con coda
eventuale
TTTT
Solammente il primer della seq
nota si può cambiare con un
secondo più interno
amplicone finale contenente il 3’ ignoto
RACE 5’ Cerchiamo il 5’ ignoto
Dobbiamo comunque ottenere il cDNA ed utiliziamo gli
stessi metodi utilizzati per ottenere il cDNA della ricerca del
3’ ignoto. C’è anche la possibilità di fare la RT direttamente
con un primer noto. L’unico problema è che pochi sono gli
enzimi RT che funzionano ad alta temperatura per cui è
possibile che il primer specifico non faccia una RT molto
specifica. Per questo motivo si tende a fare una RT di tutti i
messaggeri (retro-trascrittoma).
Dopodichè si deve fare una terminal transferasi come
spiegato nelle diapositive successive, si preparano dei
primers con una coda che possono aumentare l’efficienza
rispetto al primer poly C. Si devono usare invece i primers
interni specifici nested in maniera simile alla RACE 3’.
Race 5’ fase I
1 - Annealing tra una regione interna dell’mRNA e un primer gene specifico
(GSP1); oppure con poly T o random priming (esanucleotidi random).
5’
mRNA
poly(A) tail
AAA….AAAn
GSP1
GSP1
NON deve essere interno o sovrapposto
ad introni;
NON deve avere una Tm molto alta
(lavora circa a 42°C);
NON deve avere una bassa specificità o
omologia con altri geni;
Race 5’ fase II
2 - Retrotrascrizione e tailing all’estremità 3’ del cDNA
5’
5’
3’
AAA….AAA n
GSP1
3’
5’
GSP1
Degradazione
mRNA
Purificazione del
cDNA
3’
CCC….CCC
5’
GSP1
Race 5’ fase III
3 - Amplificazione per PCR usando un secondo primer specifico al gene
(GSP2) ed uno contenente una coda di oligo(dC) all’estremità 3’
5’
3’
GIG…..GGI
CCC….CCC
5’
GSP2
GSP1
La SPECIFICITA’ può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un altro primer gene
specifico (GSP2)
5’
3’
I inosina
GIG….GGI
CCC….CCC
GSP3
GSP2
3’
5’
race 5’ignoto riepilogo
5’
mRNA
poly A
Sintesi del I filamento di cDNA tramite rev.transcript.
3’
primer rev. specifico
rev. transcript. a temp. restrittiva con enzima mutante RH-
5’
3’
cDNA singolo filamento
3’
5’
trattamento con RNase
trattamento con terminal transferase
CCCC
3’
cDNA singolo filamento
primer frw di poly G
CCCC
3’
c c cc c c
c c c c 5’
sintesi secondo filamento
5’
cDNA singolo filamento
primer rev. specif.
PCR selettiva
Race 5’ ricapitolazione
dopo la sintesi del I filam. di cDNA e la terminal
transferase, PCR selettiva con II primer rev. selettivo interno
5’
3’
CCCC
3’
GGGGG
CCCCC C
II primer rev. spec.
interno (nested)
I primer rev. specif.
5’ sconosciuto
II primer rev. spec.
interno (nested)
Clonaggio in un vettore per inserzione con estremita’ coesive per
restrizione dell’adattatore o con A-T
5’
Clonaggio dei prodotti PCR
Clonaggio in plasmidi dedicati con prodotti PCR
con TAQ polymerase w.t. si hanno aggiunte di A terminali spuri
TAQ proof reading o altri producono ampliconi “blunt ends”
Secondo che enzima si usa, si sceglie un plasmide adeguato.
Esistono in vendita:
- plasmidi gia’ linearizzati con coda di T terminale per facilitare la
ligasi tra l’amplicone ed il plasmide
- plasmidi con topoisomerasi coniugata all’estremita’ del plasmide
che attacca direttamente l’amplicone senza bisogno di ligasi