Scuola di
Scienze Matematiche
Fisiche e Naturali
Corso di Laurea in Chimica
Curriculum Scienze Chimiche
Studio dell’interazione di un
composto del Platino con Ca-ATPasi
Study about the interaction of a
Platinum compound with Ca-ATPase
Relatore
Maria Rosa Moncelli
Correlatore
Francesco Tadini-Buoninsegni
Candidato
Giacomo Sordi
Anno Accademico 2013/2014
2
Dedicato alle persone senza le quali tutto ciò non sarebbe stato possibile.
Al personale di laboratorio , persone meravigliose,in particolare alla prof.ssa
Maria Rosa e a Francesco, per la pazienza, la fiducia e l ’immensa disponibilità;
Alla mia famiglia, che mi ha sempre sostenuto;
Alla mia dolce Eva, la mia forza e il mio rifugio.
3
4
Indice
CAPITOLO 1: Introduzione
1.1 Membrana cellulare e proteine di membrana
1.2 Diversi tipi di trasporto
1.3 Pompe ioniche
1.4 Le ATPasi
1.4.1 Le P-ATPasi come target farmacologico
1.5 Ca2+-ATPasi
1.5.1 Struttura
1.5.2 Meccanismo di funzionamento
1.5.3 SERCA: la svolta farmacologica
1.6 Lo ione Ca2+e la vita
1.7 Una nuova scoperta
CAPITOLO 2: Materiali e Metodi
2.1 Prodotti chimici
2.2 Modello sperimentale di membrana biologica: solid supported
membrane (SSM)
One
2.3 Lo strumento SURFE2R
2.4 Metodo del salto di concentrazione
CAPITOLO 3: Risultati e Discussione
3.1 Obiettivo
3.2 Misura del transiente di corrente
3.3 Risultati e discussione
Conclusioni
Bibliografia
5
OBIETTIVO.
Data l’importanza dei composti del platino nei trattamenti dei tumori, il nostro scopo è
stato di iniziare uno studio sull’interazione del cis-platino con la Ca2+-ATPasi, in
quanto questa proteina è over-espressa in molte forme tumorali.
6
Capitolo 1
Introduzione
7
8
1.1 MEMBRANA CELLULARE E PROTEINE DI
MEMBRANA
La membrana cellulare è il rivestimento, spesso 5-10 nm ( 50-100 Å ), che circonda
ogni cellula e la separa dall'ambiente esterno. Essa è costituita per lo più da fosfolipidi
che presentano una parte polare, testa, e una parte apolare, coda, i quali si dispongono
formando il cosiddetto doppio
strato fosfolipidico: le teste
polari si affacciano sulla parte
citosolica e verso l'ambiente
esterno ponendo tra loro le
code apolari che costituiscono
l'ambiente idrofobico interno
alla
membrana.
Altri
componenti minori della
membrana, ma con funzioni
molto importanti, sono le
proteine, il colesterolo e i
carboidrati (fig. 1.1).
In condizioni fisiologiche sia
le componenti lipidiche che le
proteine sono in grado di
Figura1.1 Rappresentazione schematica della membrana
cellulare e dei suoi scomparti. Immagine tratta da
muoversi
all’interno
del
http://it.wikipedia.org/wiki/Membrana_cellulare.
monostrato di appartenenza. I
fosfolipidi
posseggono
un’alta mobilità e possono anche dare origine ad un flip-flop da una parte all’altra del
bistrato. Le proteine di membrana hanno una mobilità molto più ridotta imposta dalla
loro natura. Questo perché la membrana si trova in uno stato fisico detto liquidocristallino, in cui le catene carboniose dei lipidi si trovano allo stato fluido e quindi
hanno una notevole libertà di movimento.
Lo scopo principale della membrana cellulare è quello di isolare e proteggere la cellula
dall'ambiente esterno, ma anche quello di monitorare l'entrata o l'uscita delle diverse
sostanze utili o nocive alla vita della cellula. Più nel dettaglio, l'idrofobicità dell'interno
del doppio strato fosfolipidico limita di molto la permeabilità di sostanze polari o
polarizzabili, che sono le più numerose in un ambiente acquoso come quello
plasmatico, impedendo così un diffondersi incontrollato di sostanze tra citosol e
ambiente esterno. A poter passare attraverso la membrana per semplice diffusione sono
piccole molecole gassose come O2, N2, CO2, molecole lipidiche a basso peso
molecolare, acqua e altre molecole polari di piccole dimensioni come etanolo e
glicerolo che riescono ad attraversarla molto lentamente, come anche molecole prive di
carica di grandi dimensioni quali alcuni ormoni. Le specie cariche, come gli ioni e le
sostanze con gruppi carichi, sono incapaci di diffondere attraverso la membrana
indipendentemente dalle loro dimensioni. Se da una parte la membrana cellulare funge
più come barriera, dall'altra le proteine di membrana gestiscono, attraverso meccanismi
più complessi, una giusta regolazione di tutte le sostanze, ma sono importanti anche
per altre funzioni. Le proteine, infatti, hanno diversi ruoli: sono enzimi che catalizzano
varie reazioni chimiche, trasportatori attraverso la membrana (canali ionici, pompe
ioniche, carrier), molecole strutturali che mantengono la forma della cellula, recettori
9
che riconoscono i diversi segnali chimici provenienti dall'ambiente, ecc.
Le proteine di membrana sono suddivise in due categorie: le estrinseche, o proteine
periferiche, e le intrinseche, o proteine transmembrana o integrali (fig. 1.2).
Le proteine estrinseche si legano alla membrana tramite legami non covalenti con le
proteine transmembrana o
con le teste polari dei
fosfolipidi.
Esse
non
attraversano
l'intera
membrana, ma si affacciano
soltanto sulla parte interna o
esterna della cellula.
Le proteine transmembrana
Figura 1.2. Rappresentazione della membrana cellulare
attraversano l’intero doppio
con i vari componenti che la costituiscono indicate dalle
strato fosfolipidico anche più
didascalie in figura, da http://www.oilproject.org.
volte,
affacciandosi
da
entrambi i lati della cellula.
Soltanto queste possono funzionare da trasportatori di sostanze attraverso la membrana.
Per il loro importante ruolo biologico di trasportatori, e mediatori nelle interazioni
della cellula con l'ambiente esterno, le proteine di membrana sono un importantissimo
target farmacologico.
1.2 DIVERSI TIPI DI TRASPORTO
Ci sono due tipi di trasporto: il trasporto passivo, se la specie trasportata segue il
gradiente di concentrazione (diffusione), e il trasporto attivo, se, viceversa, la specie è
trasportata contro gradiente di concentrazione.
Nel trasporto passivo la proteina partecipa facilitando l'immissione o l'emissione di un
determinato soluto attraverso la membrana, e non si ha dispendio di energia. Le
proteine che attuano un trasferimento passivo sono di due tipi: i carriers ed i canali
ionici. I carriers mediano il trasporto di carboidrati, aminoacidi e nucleosidi. Una volta
legato il soluto, dalla parte dove esso è più concentrato, all'interno o all'esterno della
cellula, il carrier cambia conformazione rilasciandolo dall'altra parte dove la
concentrazione è più bassa. I canali proteici, invece, formano dei pori attraverso la
membrana che a seconda dei vari stimoli si aprono e si chiudono permettendo il
passaggio di determinate sostanze.
A differenza del trasporto passivo, nel trasporto attivo è necessario un apporto di
energia. In questo tipo di meccanismo le sostanze si muovono contro gradiente
chimico, elettrico o elettrochimico. Si distinguono due classi principali di trasporto
attivo: quello primario e quello secondario. Nel trasporto primario avviene un
dispendio di energia al fine dello spostamento diretto di una sostanza, mentre in quello
secondario il trasporto di una sostanza avviene di conseguenza a quello primario di
un'altra. Le ATPasi sono un esempio molto importante di proteine che utilizzano
l’energia dovuta all’idrolisi di ATP (adenosintrifosfato) in ADP (adenosindifosfato) per
il trasporto di ioni contro il loro gradiente elettrochimico. Nel trasporto secondario
non c'è un consumo diretto di energia perché sfrutta il gradiente formato durante il
trasporto primario, ma dipende comunque dall'energia necessaria al primo trasloco.
Esistono due forme di trasporto: l'uniporto, e il cotrasporto del quale fanno parte il
simporto e l'antiporto (fig. 1.3).
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L'uniporto è il trasporto di
una sola sostanza. Il
cotrasporto è il trasporto
contemporaneo di due
sostanze: per il simporto il
movimento delle due
specie avviene nella stessa
direzione attraverso la
membrana e per l'antiporto,
invece,
in
direzione
Figura 1.3. Schematizzazione dei meccanismi di uniporto,
opposta.
simporto e antiporto, da http://academic.brooklyn.cuny.edu
Quando a venir trasportati
attraverso la membrana cellulare sono degli ioni, il processo può essere ulteriormente
contraddistinto da un punto di vista delle cariche, ovvero si definisce trasporto
elettrogenico un movimento di carica complessiva diversa da zero, invece si ha un
trasporto elettroneutrale se non c'è stato un movimento di carica netto.
1.3 POMPE IONICHE
I trasportatori ionici prendono spesso il nome di pompe ioniche. Esse hanno precisi
siti di legame specifici per un determinato soluto, che legandosi, scatena un susseguirsi
di cambi conformazionali nella proteina fino ad essere portato al di là della barriera
fosfolipidica. Per avvenire tutto ciò, però, la proteina deve essere attivata da una fonte
di energia. La fonte più comune per il nostro organismo è l'ATP. Comunemente
l'idrolisi dell'ATP, processo che libera molta energia, permette ad un gruppo fosfato di
legarsi al proprio sito di legame sulla proteina, e, di conseguenza, si innesca il cambio
di conformazione necessario allo svolgersi del trasporto. Altre fonti di energia oltre
all'ATP possono essere la radiazione UV, o l'energia derivante dal trasporto di un altro
soluto il cui gradiente chimico e elettrochimico sia esoergonico, cioè fornisca energia.
Reazioni di questo genere sono di tipo enzimatico. La specificità della proteina per la
sostanza o le sostanze di cui si occupa è molto alta.
1.4 LE ATPasi
Possono essere classificate in più categorie: F, V, E, A , P.
Le F-ATPasi sono localizzate nelle membrane dei mitocondri, dei cloroplasti e dei
batteri. Sono le prime produttrici di ATP, che rigenerano, sfruttando il gradiente
protonico della fosforilazione ossidativa.
Le V-ATPasi si trovano principalmente nei vacuoli (organelli cellulari) e si occupano
della riduzione del pH all'interno di quest'ultimi.
Le A-ATPasi funzionano come le F-ATPasi, ma sono presenti negli Archea, batteri che
vivono in ambienti solfurei che si pensa popolassero la Terra ai suoi primordi.
Le E-ATPasi sono presenti nelle membrane cellulari e si occupano dell'idrolizzazione
di numerosi nucleotidi non solo dell'ATP.
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Le ATPasi di tipo P si occupano del trasporto selettivo di diversi ioni come H+, Na+, K+,
Ca2+, Zn2+, Cu2+, attraverso diversi tipi di membrane biologiche. A differenza degli
altri tipi di ATPasi, quelle di tipo P, hanno una struttura più semplice, con una subunità
α, che contiene tutti i componenti essenziali per il trasporto e l'attività enzimatica.
Un'altra differenza dalle altre ATPasi è che il meccanismo di reazione prevede un
intermedio fosforilato: il Pi (fosforo inorganico) è trasferito ad un residuo interno di
aspartile[1]. Per le conoscenze che si hanno in materia su questo tipo di enzimi, si può
affermare che abbiano tutte una simile struttura di base, e di un meccanismo analogo
per il trasporto degli ioni. Infatti un passo molto importante per capire il complesso
meccanismo riguardo queste pompe ioniche, è stato fatto quando è stata determinata la
struttura atomica della Ca2+-ATPasi del reticolo sarco(endo)plasmatico, proveniente
dal muscolo scheletrico del coniglio[2]. Questa struttura rivelò la generale architettura
delle subunità catalitiche
delle P-ATPasi, la quale
comprende: tre domini
citoplasmatici A, P e N, un
segmento transmembranale
di 10 eliche (da TM1 a
TM10) recanti i due siti di
legame per i due ioni Ca2+.
Più recentemente sono state
descritte anche le strutture
di altre
proteine della
famiglia delle P-ATPasi : la
Na+,K+-ATPasi, dal rene di
Figura 1.4. Post-Albers scheme: qui in particolare è preso
maiale, la H+-ATPasi e la
come esempio il ciclo della Ca2+-ATPasi. C. Roy, D.
Lancaster, “Structural biology: Ion pump in the movies”,
Cu-ATPasi. Il meccanismo
Nature 432, 286-287 (18 November 2004).
generale di funzionamento
di molte delle P-ATPasi
consiste nell’antiporto di due ioni: Na+-K+, ma anche Ca2+-H+. Il ciclo di reazione è
sintetizzato nel “Post-Albers scheme” (fig. 1.4) nel quale si può vedere che le pompe
attuano una conversione tra due conformazioni principali: E1 ed E2.
1.4.1 LE P-ATPasi COME TARGET FARMACOLOGICO [1]
Le proteine di membrana sono un importante bersaglio farmacologico. Non sono da
meno le P-ATPasi, che anzi, per la loro funzione di trasportatori di ioni, sono tra le
proteine più importanti per la fisiologia cellulare. Infatti il loro ruolo è centrale nella
sopravvivenza della cellula, per questo, sono collegate a numerose malattie anche
molto gravi. Ad esempio alcune malattie neurodegenerative sono dovute ad una
mutazione della Na+,K+-ATPasi, e una mutazione nel reticolo sarcoplasmatico della
Ca2+-ATPasi (SERCA) può causare diversi tipi di miopatie (sindrome dovuta ad
alterazioni delle cellule o del tessuto interstiziale dei muscoli volontari), a seconda
dell'isoforma specifica implicata (SERCA1 o SERCA2). La Ca2+-ATPasi può,
sopratutto, interagire con il meccanismo apoptodico (morte programmata della cellula)
che è innescato da un alta concentrazione citoplasmatica di Ca2+.
La Na+,K+-ATPasi è invece designata come target per la cura dell'insufficienza
cardiaca. I CTS ( cardiotonic steroids) sono degli ottimi inibitori di questa proteina.
L'inibizione della Na+,K+-ATPasi attraverso il legame con i CTS provoca un
innalzamento della concentrazione di Na+ all'interno della cellula. Come risultato, il
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trasporto secondario di Ca2+, verso l'esterno della cellula, è rallentato e la contrattilità
del muscolo cardiaco aumenta ( effetto inotropo positivo).
Per lo sviluppo di inibitori specifici, per le ATPasi, sono molto importanti le
informazioni che si possono ottenere sulla struttura e sul meccanismo di trasporto degli
ioni.
1.5 Ca2+-ATPasi[3]
Le Ca2+-ATPasi sono enzimi della classe delle P-ATPasi, che trasferiscono ioni Ca2+, e
sono fondamentali per molti processi fisiologici. A seconda della localizzazione nella
cellula le Ca2+-ATPasi si dividono in due sottocategorie:
•
SERCA (Sarco-(Endo)Plasmic Reticulum Calcium ATPase) presente nel
reticolo sarcoplasmatico delle cellule muscolari con la funzione di sequestrare ioni
Ca2+, e portarli all'interno del reticolo sarcoplasmatico.
•
PMCA (Plasma Membrane Calcium ATPase) presente nella membrana
plasmatica delle cellule, e ha la funzione di pompare ioni calcio verso l'ambiente
esterno alla cellula.
La SERCA è presente nel
nostro organismo in tre diverse
isoforme, che sono specifiche
per il tessuto in cui sono
collocate. La SERCA1 si trova
nel
tessuto
muscolare
scheletrico, la SERCA2 nel
tessuto muscolare cardiaco e la
SERCA3 in altri tessuti. Tutti i
tipi di SERCA hanno un
importante ruolo in numerosi
Figura 1.5. Immagine al microscopio di vescicole del
meccanismi
citosolici
di
reticolo sarcoplasmatico. G. Inesi, C. Toyoshima;
segnalazione dove è richiesto il
Catalytic and Transport Mechanism of the Sarco2+
sequestro di Ca2+.
(Endo)Plasmic Reticulum Ca -ATPase (SERCA); da
L'isoforma specifica usata in
“Handbook of ATPases” a cura di M. Futani, Y. Wada, J.
H. Kaplan, (2004) 63-87.
questo studio è la SERCA1.
Essa è contenuta in vescicole
(fig. 1.5) ottenute dal muscolo scheletrico del coniglio che viene omogenizzato e
ripetutamente centrifugato. L'esperimento viene fatto direttamente con queste
vescicole che permettono la misura dell'attività ATPasica e del trasporto di Ca2+ per lo
studio del meccanismo di funzionamento di questo enzima[3].
1.5.1 STRUTTURA
Gli studi strutturali per le Ca2+-ATPasi sono stati eseguiti proprio con l'isoforma
SERCA1. Questa proteina è costituita da 994 aminoacidi distribuiti principalmente tra
la parte transmembranale attraverso il doppio strato fosfolipidico e la parte citosolica. I
primi studi al TEM (transmission electron microscopy) e i successivi ai raggi X
dell'enzima cristallizzato, hanno dimostrato che la parte transmembranale è costituita
da dieci segmenti per lo più in conformazione ad elica. La regione esterna alla
membrana include tre diversi domini denominati A, N e P. La struttura cristallina è
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ottenuta in presenza di Ca2+ nella conformazione chiamata E1, che è la conformazione
di maggiore affinità per il legame con gli ioni calcio (fig.1.6).
Il dominio P è quello in cui avviene la fosforilazione di un residuo di aspartato da parte
dell'ATP ed è formato da sette β-foglietti fiancheggiati da otto piccole eliche. Questo
dominio è connesso direttamente ai residui trans-membranali che collegano tra loro la
parte citosolica della proteina e quella interna, nel lumen del reticolo sarcoplasmatico.
Il dominio P è inoltre collegato al il sito catalitico, dove avviene il legame con gli ioni
Ca2+, che è in una posizione centrale nella parte esterna, e ben accessibile.
Il dominio N è collegato al dominio P attraverso due segmenti. La sua funzione è
quella di legare l'ATP che deve poi essere idrolizzato. Questo dominio si compone di
sette β-foglietti come il dominio P, ma con soltanto altre due α-eliche legate insieme. I
residui nucleotidici dell'adenosina trifosfato si pongono all'interno di una “tasca” che si
forma tra i β-foglietti e le α-eliche.
Figura 1.6. Struttura della SERCA. Sono indicati i domini P, N e A. Si può notare come essi
cambino di orientazione nelle diverse conformazioni E1 ed E2 che la proteina assume durante
il suo funzionamento. Immagine tratta da: C. Tpyoshima, S. Iwasawa, H. Ogawa, A. Hirata, J.
Tsueda, G. Inesi, “Crystal structures of the calcium pump and sarcolipin in the Mg2+-bound E1
state”, Nature, 495, 260-264 ( 2013).
Il dominio A è una parte citoplasmatica posta tra due segmenti trans-membranali. Esso
si compone prevalentemente di β-foglietti ed è coinvolto nei cambi conformazionali
che regolano il trasporto degli ioni. Il dominio A include anche dei segmenti Nterminali piegati in due piccole α-eliche adiacenti alla struttura dei β-foglietti.
Le dieci eliche che compongono la parte trans-membrana dell'enzima sono collegate
direttamente al dominio P. La principale caratteristica di questa regione è il dominio di
legame per gli ioni Ca2+ che si compone di due siti (sito I e il sito II) formati da
parecchi residui che partecipano alla stabilizzazione del legame con questo ione.
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1.5.2 MECCANISMO DI FUNZIONAMENTO
Il trasporto attivo da parte della SERCA avviene in presenza di ATP, con un perfetto
rapporto di due ioni Ca2+ trasportati, per molecola di ATP che viene idrolizzata, dal
citoplasma della cellula all’interno del lumen del reticolo sarcoplasmatico. Il trasporto
degli ioni calcio avviene contro un gradiente elettrochimico molto elevato perché la
concentrazione di Ca2+ differisce di ben 4 ordini di grandezza: 10-7 M nel citoplasma e
10-3 M nel lumen del reticolo. È stato anche dimostrato che il trasporto di due ioni Ca2+
all'interno del lume del reticolo è accoppiato ad un contro trasporto di due ioni H +,e
quindi, che la pompa è elettrogenica. Il legame con i due ioni avviene in modo
sequenziale e cooperativo, con due differenti costanti di equilibrio. Infatti, è il cambio
di orientazione del sito I legato al primo ione Ca2+ a permettere il legame con il Ca2+ al
sito II. I due legami, poi, comportano un ulteriore cambio conformazionale che rende
l'enzima propenso al legame con l'ATP. L'ATP si lega al domino N dell’enzima e
fosforila un residuo di aspartato nel dominio P, ciò è reso possibile dall’ione Mg2+.
Questo ione non è tanto importante affinché l'ATP si leghi all'enzima, ma è
fondamentale perché possa avvenire la scissione del gruppo fosfato dall’ATP e quindi
l’idrolisi. Il magnesio infatti stabilizza l’intermedio di reazione tra proteina legata con
l’ATP e proteina ad idrolisi avvenuta, fornendo, quindi, un vantaggio cinetico.
L'energia libera richiesta per il trasporto attivo di Ca2+ all'interno del reticolo
sarcoplasmatico è data da:
ΔG= RT ln ([Ca2+]in / [Ca2+]out ) + zFΔV ≈ 51 KJ/(mol.)
dove [ Ca2+ ]in e [ Ca2+]out sono rispettivamente la concentrazione di calcio all'interno
del reticolo sarcoplasmatico e la concentrazione nel citosol, z è la carica elettrica degli
ioni trasportati, R è la costante dei gas, F la costante di Faraday, e ΔV è il potenziale
elettrico attraverso il bistrato fosfolipidico. È stato provato che l'energia libera richiesta
allo svolgersi di tutto il meccanismo di trasporto è comparabile con il potenziale
chimico che l'ATP può offrire.
Il legame dell'ATP con l'enzima, che avviene attraverso un fosfato terminale, non
sarebbe possibile se prima la proteina non si legasse agli ioni Ca2+. Lo ione calcio
infatti attiva l'enzima permettendo una rapida formazione dell'intermedio fosforilato, a
seguito del trasferimento del fosfato terminale su un residuo aspartilico. Avvenuto ciò,
si può innescare lo spostamento vettoriale dei due ioni Ca2+. C'è da dire anche che il
ciclo di questa ATPasi descritto adesso è altamente reversibile. Tutto il processo
dell'enzima si basa sulla conversione tra due conformazioni: lo stato E1, che ha alta
affinità per gli ioni Ca2+ e i siti di legame orientati verso il lato citoplasmatico, e lo
stato E2 che ha scarsa affinità per gli ioni calcio e l'orientazione dei siti verso il lume
del reticolo sarcoplasmatico. Tutto il meccanismo può essere capito meglio
analizzando le varie reazioni parziali e le loro costanti di equilibrio:
(Reazione 1) E 2H+ + 2Ca2+out ↔ E 2Ca2+ + 2H+out
( K1=1012 M-2 )
(Reazione 2) E 2Ca2+ + ATP ↔ ATP E 2Ca2+
( K2=105 M-1)
(Reazione 3) ATP E 2Ca2+
↔ ADP E-P 2Ca2+
( K3=1 )
(Reazione 4) ADP E-P 2Ca2+
↔ E-P 2Ca2+ + ADP
( K4=10-4M )
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(Reazione 5) E-P Ca2+ + 2H+in ↔ E-P 2H+ + 2Ca2+in
( K5=10-6 M2 )
(Reazione 6) E-P 2H+ ↔ E 2H+ Pi
( K6=1 )
(Reazione 7) E 2H+ Pi ↔ E 2H++ Pi
( K7= 10-2 M )
dove il simbolo ( - ) indica un legame covalente e il simbolo ( ) un legame non
covalente. Le costanti si riferiscono ad una temperatura di 25°C e ad un pH 7.
Nella prima reazione si può notare l'alta affinità del legame con i due ioni Ca2+, che
attiva l'enzima permettendo l'utilizzazione dell'ATP e la formazione dell'intermedio
fosforilato ( reazioni 2, 3, 4). A sua volta l'enzima fosforilato abbassa l'affinità e
cambia l'orientazione dei siti di legame con l’ione calcio affinché essi possano essere
rilasciati nel lume del reticolo sarcoplasmatico (reazione 5). Nelle ultime due reazioni
viene rilasciato il Pi e l'enzima ritorna alla conformazione iniziale. L'energia derivante
dall'ATP serve all'enzima per poter rilasciare l’ione Ca2+ perché, come si può vedere
dalla K1 e dalla K5, l'affinità da parte dell'enzima per il calcio è molto alta e quindi
serve energia affinché avvenga la dissociazione.
1.5.3 SERCA: LA SVOLTA FARMACOLOGICA
Non è molto tempo che la SERCA viene studiata come possibile target farmacologico.
È stata la scoperta che l’inibizione di questa proteina porta all’innesco del processo
apoptodico, a indirizzare la ricerca su questa strada. In particolare la SERCA
sembrerebbe un ottimo target, a dispetto di altri, per la cura del cancro alla prostata. Si
tratta, infatti, di un tipo di tumore, che presenta un basso tasso di proliferazione da
Figura 1.7. Rappresentazione di vari inibitori per SERCA. A destra struttura della SERCA con
ingrandimento della parte citosolica. S. Krishna, S. Pulcini, C. M. Moore, B. H.-Y. Teo, H. M.
Staines; “Pumped up: reflections on PfATP6 as the target for artemisinins”; Trends in
Pharmacological Sciences (2014), Vol. 35 n°1.
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parte delle cellule malate, caratteristica questa molto insolita. Ciò rende inefficaci le
normali chemioterapie anti-proliferazione usate nelle cure per gli altri tumori. Una via
alternativa di cura si potrebbe quindi identificare con un percorso specifico, che
permetta di individuare un requisito per la sopravvivenza esclusivamente proprio delle
cellule tumorali della prostata. Un modo efficace potrebbe essere quello di inibire la
Ca2+-ATPasi delle cellule tumorali[4], ma usare, per esempio, la tapsigargina
significherebbe colpire tutte le Ca2+-ATPasi poste in tutte le cellule. Quindi il problema
è piuttosto complicato. In uno studio incrociato tra ricercatori di alcune università
statunitensi e danesi è stato presentato lo sviluppo di un pro-farmaco chiamato G202.
Il G202 consiste di PSMA (carboxypeptidase prostate-specific membrane antigen), una
glicoproteina iper-espressa nelle cellule tumorali della prostata, accoppiato con la
tapsigargina[5]. Il meccanismo di azione del G202 con la membrana delle cellule
tumorali è piuttosto complesso e protetto da brevetto. Comunque si può dire che questo
pro-farmaco riconosce solo l’antigene specifico e quindi si ha, poi, un’interazione della
tapsigargina solo con la Ca2+-ATPasi delle cellule tumorali. Questo tipo di approccio è
molto interessante e promettente.
La SERCA sembra dimostrarsi importante anche per trovare cure alternative per il
cancro ai polmoni dove i normali trattamenti anti-tumorali falliscono. Infatti tra cellule
epiteliali bronchiali normali e cellule malate è stata riscontrata una minore espressione
di SERCA nel reticolo sarcoplasmatico. Questa differenza tra cellule sane e malate
potrebbe, così, rappresentare un buon target per la cura di questa malattia perché
garantirebbe l’auspicabile possibilità di poter colpire le cellule tumorali salvando in
larga parte quelle sane[6].Altri studi hanno appurato che la SERCA è protagonista
nell’attività cardiaca. Essa, attraverso la modulazione tramite il fosfolambano, regola il
trasporto di Ca2+ controllando così la contrazione e il rilassamento del muscolo
cardiaco. Lo scompenso cardiaco e l’ipertrofia cardiaca sono dovuti ad un difetto
nell’assorbimento di Ca2+ da parte del reticolo sarcoplasmatico. Lo studio di una cura
efficace a queste malattie è riposta nella ricerca di composti che destabilizzino
l’interazione tra fosfolambano e SERCA[7]. L’ultimo esempio che riporto, per rendere
l’idea di quanto lo studio della SERCA risulti essere importante nella cura di malattie,
anche molto diverse tra loro, è la scoperta che l’artemisinina (il principale farmaco
antimalarico) agisca proprio inibendo le SERCA del Plasmodium falciparum, un
protozoo parassita che causa la malaria nell’uomo[8].
Data l’importanza acquisita nel tempo dalla SERCA come target farmacologico, sono
stati individuati via via diversi inibitori (fig. 1.7) come ad esempio la tapsigargina,
l'acido ciclopiazonico e il 2,5-di-(t-butil)-diidrossibenzene [tabella I][1,9]. A causa del
suo forte potere inibente, la tapsigargina, è anche molto tossica, tuttavia sono stati
studiati alcuni suoi derivati che costituiscono una buona promessa per il futuro dei
farmaci antitumorali. La tapsigargina interagisce con tutte le reazioni parziali descritte
in precedenza (par. 1.5.2), e induce la stabilizzazione dell'enzima nella forma E2,
quella con minore affinità per gli ioni calcio, legandosi in una posizione intermedia tra
i residui all'interno della membrana e la parte citosolica[1].
Gli inibitori della SERCA non agiscono tutti nello stesso modo e non hanno lo stesso
sito di legame. Si può fare una prima distinzione tra le molecole che stabilizzano la
SERCA nella conformazione E2 e quelli che la stabilizzano nella conformazione E1[9].
Per riassumere in breve e in modo abbastanza esaustivo le caratteristiche di alcuni
inibitori per la SERCA si riporta una tabella tratta dalla rivista “Biochemical Society
Transactions”[9], dove si riportano le costanti di inibizione.
17
Tabella I
Table 1 Potencies and conformational effects of some SERCA inhibitors
Inhibitor
Thapsigargin
Cyclopiazonic acid
BHQ
Nonylphenol
Bisphenol
Bisphenol A
TBBPA
4-Chloro-m-cresol
Orthovanadate
Quercitin
3,6-Dihydroxyflavone
Galangin
2APB
Curcumin
Paxilline
Alisol B
Mastoparan
Ivermectin
Cyclosporin A
Rapamycin
Chlorpromazine
Calmidazolium
Fluphenazine
DES
1,3-Dibromo-2,4,6-tris(methylisothiouronium)benzene (Br2-TITU)
Ki or IC50
0.21–12 nM
90–2500 nM
2–7 μM
6 μM
2 μM
233 μM
0.5–2.3 μM
2.8 mM
10–100 μM
9 μM
6 μM
9 μM
70–700 μM
7–15 μM
5 μM
27 μM
1 μM
15 μM
62 μM
77 μM
23 μM
0.5 μM
15 μM
20 μM
29 μM
E1-like or E2-like conformation
E2
E2
E2
E2
E2
E2?
E2
?
E2
E1
E1
E1
E1
E1
E1
E2
E1
E1
?
?
E1
E1
E1
?
E1
1.6 LO IONE Ca2+ E LA VITA
I meccanismi vitali di ogni organismo sono sempre molto complessi e dipendono da
una fitta rete di reazioni tra miriadi di molecole diverse, non c’è dubbio però, che gli
ioni calcio giochino un ruolo fondamentale nella vita delle cellule, della quale, esse
sono i mattoni.
Tra i processi regolati dal calcio i più importanti sono: la contrazione muscolare, la
trasmissione sinaptica, la proliferazione cellulare e l’apoptosi. Per questi processi e per
altri ancora è di vitale importanza che la concentrazione di calcio sia precisamente
controllata all’interno di un organismo. Nel corpo umano i livelli di Ca2+ extracellulare
sono dell’ordine di 1,2 mM e all’interno del citosol di circa 100 nM[10]. All’interno
della cellula si instaura un altro gradiente di calcio tra citosol e reticolo
sarcoplasmatico o endoplasmatico che sia, attraverso le Ca2+-ATPasi (SERCA nel caso
di reticolo sarcoplasmatico), che portano il Ca2+ all’interno del reticolo dove la
concentrazione di questi ioni raggiunge livelli molto più elevati che nel citosol. Il
reticolo funziona da serbatoio di ioni Ca2+ e lo rilascia di nuovo nel citoplasma quando
necessario. Tra l’altro un’alterazione dell’omeostasi del calcio è implicata nella
tumorigenesi e nella progressione tumorale[4,6,10]. Ci sono tre classi di proteine
direttamente coinvolte nell’omeostasi di questo ione: i canali, le ATPasi e gli
scambiatori. I canali, come le ATPasi sono sfruttati come target per farmaci
antitumorali. Nel tempo è stato scoperto che un’espressione alterata di queste proteine
è ricorrente e molto comune nelle cellule tumorali. Per esempio un aumento
18
dell’espressione di queste proteine di membrana, come le PMCA, fa aumentare il
flusso di Ca2+ verso il citosol, stimolando l’attività proliferativa della cellula, oppure,
un aumento dell’espressione delle SERCA fa aumentare l’assorbimento di calcio nel
reticolo sarcoplasmatico, conferendo una resistenza all’apoptosi. Addirittura anche una
localizzazione aberrante delle proteine che si occupano del trasporto del calcio basta a
modificare il delicato equilibrio di questo ione e a portare, quindi, ad un conseguente
tumore[10,12].
A far pensare che queste proteine possano essere ottimi target farmacologici è
sopratutto la loro partecipazione ai processi di proliferazione e apoptosi, in modo
particolare a quest’ultima.
L’apoptosi è definita come morte cellulare programmata. A differenza della necrosi,
che è la morte cellulare come conseguenza ad un trauma, l’apoptosi è un processo di
morte cellulare controllato geneticamente[11]. Il processo apoptodico, come detto, è
legato alla concentrazione di Ca2+ e, siccome è uno dei tantissimi processi legati a
questo ione, come è facile immaginare, si instaura attraverso un controllo plurimo di
molecole che interagiscono in modo diretto e indiretto con i trasportatori di Ca2+,
stimolando o inibendo la loro attività. Come se non bastasse non c’è un unico percorso
di innesco dell’apoptosi[4,10-12]. Comunque sia la stimolazione delle proteine del
reticolo endoplasmatico o sarcoplasmatico ad un maggior rilascio di Ca2+ nel citosol ha
come conseguenza l’aumento della concentrazione dell’ione nei mitocondri, e ciò dà il
via all’apoptosi[10,12]. Il dubbio che potrebbe sorgere è quello di come possa essere
possibile riuscire a sfruttare l’apoptosi per colpire selettivamente le cellule tumorali.
La risposta chiave sta nel fatto che nelle cellule tumorali si riscontra spesso
un’alterazione delle proteine che si occupano dell’omeostasi del calcio. Questo fa sì
che, mentre nelle cellule normali i processi derivanti da una modifica dell’equilibrio di
Ca2+ possono seguire percorsi multipli, nelle cellule tumorali ciò non è così. In questo
modo, trattando le cellule normali e malate con l’inibitore di uno specifico percorso,
vengono uccise soltanto le cellule tumorali che hanno solamente quella strada o poco
più per sopravvivere. Quindi se la cellula tumorale, come spesso accade, ha solamente
la possibilità di sfruttare l’attività della SERCA per controllare la concentrazione di
calcio all’interno dei mitocondri, e poche altre, inibendo questa proteina si è sicuri di
innescare con maggiore efficacia il processo di apoptosi nelle cellule tumorali[4-6,8,10].
1.7 UNA NUOVA SCOPERTA
Il cisplatino (cis-diamminodicloroplatino) è il composto più usato ed efficace nella
cura dei tumori. Esso viene usato perché si lega al DNA delle cellule impedendone la
replicazione e quindi anche la divisione cellulare. Siccome le cellule tumorali hanno
come peculiarità quella di avere un’attività molto più frenetica rispetto alle cellule
normali, la somministrazione del cis-platino colpisce per lo più le cellule malate perché
sono loro ad assorbire la maggior parte delle sostanze esterne. Quando è al di fuori del
citoplasma questo tipo di composto è relativamente poco reattivo per l’alta
concentrazione di cloro nei vasi sanguigni, mentre la sua attività è favorita nel citosol
per la bassa concentrazione di cloro al suo interno. Questo farmaco mostra un’attività
clinica contro una discreta varietà di tumori maligni come alle ovaie, ai testicoli, alla
testa e al collo dell’utero, ai polmoni, alla vescica e allo stomaco[14,17-21]. A volte il cisplatino è anche usato in combinazione con altri agenti citotossici e/o radiazioni
terapeutiche[18]. Ad oggi sono stati approvati tre farmaci di platino per usi clinici e cioè
il cis-platino, il carboplatino e l’ossaliplatino. Il meccanismo di citotossicità del cis-
19
platino è ben noto, ma il problema legato a questo tipo di farmaco è lo sviluppo di una
certa resistenza alla terapia prolungata nel tempo. Infatti sono stati fatti vari studi per
trovare come le cellule riescano a ridurre l’influsso e/o ad aumentare il deflusso del
farmaco attraverso la membrana, proteggendosi dal suo effetto dannoso per il DNA.
Questo tipo di studi, stanno riportando le prove dell’interazione del cis-platino con
alcune proteine di membrana. Riscontrando una sovrapproduzione della Cu-ATPasi
ATP7B nelle cellule resistenti del carcinoma alle ovaie, si era pensato all’interazione
tra cis-platino e questo tipo di proteina, ipotizzando che questa potesse trasportare in
modo attivo il farmaco al di fuori della cellula[20]. Immediati studi successivi hanno
confermato il legame tra ATP7B e cis-platino, ma si ponevano in contrasto con l’idea
di un trasporto attivo da parte di questa proteina. Infatti, un’inattivazione dell’ATP7B
non aumentava in alcun modo la sensibilità cellulare al cis-platino. Dallo studio risulta
che i siti di legame con il rame della Cu-ATPasi sono distinti da quelli che
interagiscono con il cis-platino e che questo induce l’intermedio catalitico fosforilato,
non cambiando quasi in alcun modo l’attività della proteina[19]. In altri studi il trasporto
di cis-platino per mezzo dell’ATP7B era stato dimostrato[20], ma soltanto ad un pH 4,6,
ben lontano da quello fisiologico, quindi non si può indicare questo trasporto come
determinante per la resistenza delle cellule. Il collegamento tra questa sovraespressione dell’ATP7B e resistenza al farmaco nelle cellule è stata così ricondotta ad
una diminuzione della concentrazione di rame nella cellula[19].
In anni successivi a questi lavori sono stati fatti vari studi sull’interazione del cisplatino con le sostanze all’interno della cellula, tanto da mettere in discussione che la
sua capacità di danneggiamento del DNA cellulare fosse la ragione primaria
nell’indurre la morte cellulare. Infatti, si è notato che solo una piccola quantità di
platino cellulare (<1%) si lega al DNA nucleare ed esiste una scarsa correlazione tra la
sensibilità delle cellule alla morte cellulare indotta da cisplatino e il grado di
platinazione del DNA. Diversi studi suggeriscono che il DNA mitocondriale, o altri
obiettivi mitocondriali, sono forse più importanti del danno al DNA nucleare, nel
portare alla morte cellulare indotta da cisplatino. Un danno al DNA mitocondriale
potrebbe essere più micidiale per la vita della cellula rispetto ad un danneggiamento al
DNA nucleare perché il primo ha una minore capacità di riparazione. Inoltre si è
scoperto che il cis-platino interagisce direttamente con i meccanismi di apoptosi,
attivando alcuni responsabili di questo fenomeno, come le caspasi e il rilascio di
citocromo c[21].
Un’altra scoperta significativa è stata fatta ricercando le ragioni della nefrotossicità di
questo farmaco. Per l’attività del rene il gradiente di Na+ è sfruttato per il trasporto
secondario di molte molecole come glucosio, Ca2+, e H+, e la Na,K-ATPasi riveste un
ruolo centrale per le funzioni di questo organo. Si è verificato, così, se il cis-platino
potesse inibire la Na,K-ATPasi, e quindi causare il danneggiamento del rene. È stata
ottenuta un’inibizione del 50% della Na,K-ATPasi in condizioni di saturazione (1:4
proteina:cisplatino)[14]. Studi appena successivi dimostrano che la Na,K-ATPasi è,
insieme ai trasportatori del rame, un’altra proteina che permette l’influsso del cisplatino all’interno della cellula, oltre ad essere inibita da questo farmaco della sua
naturale attività[17].
Tenuto conto di questi dati di letteratura il nostro laboratorio ha iniziato uno screening
sull’interazione di molecole antitumorali con la SERCA. In un lavoro pubblicato poco
fa (agosto 2014) si sono studiati nuovi composti antitumorali a base di rutenio e si è
studiata anche un’isoforma del cisplatino (cis-diammino-dicloro-platino(II)), molto
usata nella lotta contro il cancro[13].
I composti antitumorali a base di rutenio sono indicati con le sigle KP1019, indizolium
20
trans-[tetraclorobis(1H-indazole)ruthenate(III)]; NAMI-A, (imH[trans-RuCl4(dmsoS)(im)] e RAPTA-C, [Ru(6-arene)Cl2(pta). Tra questi, il composto più efficace per
l’inibizione della proteina, si è dimostrato il KP1019, ed è stata calcolata una costante
di semi inibizione (IC50) pari a 1.0 ± 0.1 µM. Da questo stesso studio è anche emerso
che probabilmente il KP1019 legandosi alla SERCA vada ad occupare dei siti nella
regione trans-membranale della proteina, impedendole di trasferire i due ioni Ca2+
all’interno della membrana. Inoltre è stato visto che il cis-diammino-dicloro-platino(II))
non ha una sostanziale capacità di inibizione della SERCA. Nell’ambito di questi studi
abbiamo, pertanto, concentrato il nostro interesse allo studio di una particolare
isoforma di un complesso del platino il cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)]. L’interazione tra la
SERCA e questa particolare molecola di cis-platino si è rivelata estremamente
interessante e, quindi, abbiamo esaminato, in dettaglio, questa interazione.
21
22
Capitolo 2
Materiali e Metodi
23
24
2.1 PRODOTTI CHIMICI















MOPS: Pm = 209,26 g/mol, purezza 95%, SIGMA ALDRICH, utilizzata una
soluzione stock 0,5 M;
KCl: Pm = 74,55 g/mol, purezza 99,5%, MERK;
MgCl2∙6 H2O: Pm = 203,30 g/mol, purezza 99%, MERK, utilizzata una
soluzione stock 0,5 M;
CaCl2∙2 H2O: Pm = 147,02 g/mol, purezza 99,5%, MERK, utilizzate due
soluzioni stock, 0,5 M e 0,05 M in H2O;
EGTA (Ethylene Glycol-Bis (β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid):
Pm = 380,4 g/mol, purezza 97%, SIGMA ALDRICH, utilizzata una soluzione
stock 0,1M;
KOH: Pm = 55,11 g/mol, purezza 85,0%, MERK.
ATP (Adenosina-5-trifosfato- sale disodico idrato): Pm = 551,15 g/mol (+H2O),
purezza ≥ 95%, FLUKA,utilizzata una soluzione stock 100mM in H2O;
Ottadecantiolo (C18SH): 286,57 g/mol, utilizzata una soluzione stock 1mM in
2-propanolo;
1,2-Diphytanoil-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Choline] (DPPC):
Pm = 870,17 g/mol, prodotto conservato in una soluzione 10 mg/ml in CHCl 3,
AVANTI POLAR LIPIDS, utilizzata una soluzione stock 7,5 mg/ml in decano;
A23187 (calcimicina, ionoforo): Pm = 523,62 g/mol, utilizzata una soluzione
stock 10 µM in DMSO;
SERCA1a: sospensione di vescicole native di reticolo sarcoplasmatico in
soluzione tampone ( MOPS 10 mM, saccarosio 30%, pH = 7 in H2O),
contenente 8,4 mg/ml di proteina, SERCA presente per circa il 50%
dell’ammontare totale di proteina, utilizzate aliquote stock da 20 µL ciascuna;
Tapsigargina (TG): 650,75 g/mol, utilizzata una soluzione stock 200 µM in
etanolo;
Cis-platino (cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] ): Pm = 343,1 g/mol, utilizzata una
soluzione stock 1mM in H2O;
L-Glutathione reduced (GSH): Pm = 307,3 g/mol, SIGMA ALDRICH;
Ditiotreitolo (DTT): Pm = 154,25 g/mol, SIGMA ALDRICH.
Composizione del buffer di lavoro:
 KCl: 100 mM;
 MOPS: 25 mM;
 MgCl2: 1 mM;
 CaCl2: 0,25 mM;
 EGTA: 0,25 mM;
 [Ca2+]libero = 10 µM
 pH = 7 ( soluzione portata a pH = 7 con KOH).
Il composto Cis-platino è stato fornito dal Prof. Fabio Arnesano e Prof. Giovanni Natile del
Dipartimento di Chimica dell’Università di Bari “Aldo Moro”.
La SERCA1a è stata ottenuta con un protocollo che prevede l’estrazione della proteina dal
muscolo scheletrico veloce delle zampe posteriori di un coniglio di razza New Zealand
White[22]. È stato utilizzato il metodo di Lowry[23] per determinarne la quantità nelle vescicole.
25
2.2 MODELLO SPERIMENTALE DI MEMBRANA
BIOLOGICA: SOLID SUPPORTED MEMBRANE (SSM)
Questo modello sperimentale
di membrana biologica è
usato, fra l’altro, per la
caratterizzazione funzionale
di
pompe
ioniche
e
trasportatori[24]. In questa
tecnica
vengono
fatti
adsorbire su un bistrato ibrido
alcantiolo/fosfolipide,
supportato da un elettrodo
d’oro, frammenti o vescicole
di membrana cellulare o
Figura 2.1. SSM: modello sperimentale di membrana
anche
proteoliposomi.
biologica. http://www.bioelectrolab.unifi.it .
L’adsorbimento sull’SSM di
vescicole o frammenti di
membrana, rende possibile l’analisi di un gran numero di proteine di membrana che
possono essere immobilizzate sull’elettrodo con un procedimento semplice e
spontaneo.
L’SSM si compone di vari strati (fig.2.1). Una
lamina d’oro è posta su un supporto di vetro
ricoperto di cromo per far aderire bene l’oro.
L’elettrodo d’oro, così costruito, viene fatto
incubare in una soluzione (50 µl) di ottadecantiolo
1 mM in 2-propanolo per circa 30 minuti a
temperatura ambiente. Dopo il periodo di
Figura 2.2. Sensore.
incubazione si sciacqua bene con acqua ultrapura
http://www.bioelectrolab.unifi.it .
per eliminare l’alcantiolo che non ha aderito alla
lamina d’oro. L’elettrodo viene poi asciugato con un flusso di N2. Quest’ultima
operazione è molto importante perché anche la minima traccia di umidità non
permetterebbe una buona formazione del bistrato. La formazione del bistrato viene
quindi ultimata depositando alla superficie dell’elettrodo 3,5 µl di 1,2-Diphytanoil-snGlycero-3-[Phospho-L-Choline] (DPPC), un fosfolipide a doppia catena, da una
soluzione 7,5 mg/ml in decano, e subito dopo 50 µl del buffer di lavoro. Si lascia
l’elettrodo a temperatura ambiente per circa 4h. Si forma così un bistrato ibrido
alcantilo/fosfolipide su oro attraverso un processo di auto-organizzazione (selfassembly): le code alchiliche dell’alcantiolo e
quelle del fosfolipide interagiscono tra loro per
formare un doppio strato, mentre le teste polari
del fosfolipide vengono a contatto con la
soluzione acquosa. Il bistrato ibrido che si ottiene
è particolarmente robusto perché il monostrato di
alcantiolo si lega all’oro con un legame
covalente.
Figura 2.3. Circuito RC con
Da un punto di vista elettrico l’SSM si può
resistenza e condensatore posti in
schematizzare con un circuito elettrico
parallelo.
equivalente RC (fig. 2.3) costituito da una
26
resistenza e un condensatore posti in parallelo. Se il bistrato su oro è stato ben
realizzato i valori di capacità sono compresi tra 10 e 30 nF, e quelli di conduttanza
(G=1/R) tra 0,5 e 4 nS. Essendo la superficie dell’elettrodo d’oro pari a 7 mm 2, la
capacità dell’SSM varia quindi tra 0,2 e 0,4 µF/cm2 e la conduttanza tra 7 e 57 nS/cm2.
Per verificare che i valori di capacità e conduttanza rientrino nei limiti sopra indicati, si
effettua una misura di C e G, applicando una differenza di potenziale di forma
triangolare di ampiezza pari a ± 50 mV.
Pertanto si ottiene un voltammogramma di forma rettangolare e, dalla differenza tra i
due valori limite di corrente misurata, si deduce il valore della capacità dalla seguente
espressione:
Δi = 2 ∙ C ∙ v
(2.1)
dove C è la capacità e v la velocità di scansione dV/dt, dove V è il potenziale ai capi
del condensatore. Il valore della resistenza, e quindi della conduttanza associata al
bistrato ibrido, si determina applicando al bistrato una differenza di potenziale elettrico
nota e costante (+100 mV); tramite il fitting del decadimento della corrente è possibile
ottenere una stima della conduttanza dell’SSM[25].
L’ultima operazione, prima di adsorbire la proteina sull’SSM, è di misurare la corrente
di off-set, che deve essere pari a zero, e di verificare che non siano presenti artefatti di
natura elettrica. Ciò viene valutato attraverso scambi del solo buffer di lavoro in
prossimità dell’SSM. Si raccolgono più misure e si mediano tra loro: il risultato di
questa operazione è considerato come bianco. Se non sono presenti artefatti di tipo
elettrico o irregolarità sulla linea di base e se la corrente di off-set è prossima al valore
zero, è possibile procedere con l’esperimento.
L’adsorbimento della proteina sull’SSM viene realizzato nel modo seguente. Si
prelevano 20 µl di una sospensione
di vescicole contenenti SERCA alla
concentrazione 4,2 mg/ml. A questa
aliquota si aggiungono poi 16 µl
della soluzione tampone e 4 µl dello
ionoforo A23187 dallo stock a
concentrazione
10
µM.
La
sospensione di vescicole viene
quindi sottoposta a sonicazione per 1
minuto in modo da separare
eventuali aggregati formati dalle
vescicole. Infine si deposita la
sospensione sull’elettrodo d’oro
tramite una pipetta Eppendorf, e si
Figura 2.4. Rappresentazione schematica di una
attende circa un’ora a temperatura
vescicola adsorbita su SSM e relativo circuito
ambiente per l’adsorbimento delle
elettrico. Modificata P. Schulz, J. J. GarciaCelma,
K.
Fendler;
“SSM-based
vescicole alla superficie dell’SSM.
electrophysiology”; Methods 46 (2008), 97–103.
Le vescicole contenenti la SERCA si
adsorbono sull’SSM grazie ad
interazioni di tipo elettrostatico tra le teste polari dei fosfolipidi del bistrato ibrido
(SSM) e quelle dei fosfolipidi delle vescicole del reticolo sarcoplasmatico. Con la
presenza delle vescicole sull’SSM il circuito elettrico equivalente si modifica: si
aggiunge al circuito RC (fig 2.3) un’altra maglia costituita anch’essa da un analogo
circuito RC (fig. 2.4).
27
2.3 LO STRUMENTO SURFE2R
One
One
Il SURFE2R
( fig.2.5) è stato
prodotto dalla ditta IonGate
Biosciences
di
Francoforte,
Germania. Lo strumento si
compone di diverse parti:
l’alimentatore
che
fornisce
energia al sistema, l’unità
analitica, che contiene la cella
One
Figura 2.5. SURFE2R .
elettrochimica ed è direttamente
http://www.bioelectrolab.unifi.it .
collegata al PC, ed un auto
campionatore anch’esso collegato
direttamente
al
PC
e
Figura 2.5. Schema del sistema di valvole e
all’alimentatore, che ha la
One
contenitori dell’unità analitica del SURFE2R . B.
funzione di ricaricare i contenitori
Kelety, K. Diekert, J. Tobien, N. Watzke, W. Dörner, P.
(A,B,C in figura 2.5) con le
Obrdlik, K. Fendler; “ Transporter assays using solid
soluzioni di lavoro. I flussi delle
supported membranes: a novel screening platform for drug
soluzioni,
all’interno
dello
discovery”; ASSAY and Drug Development Technologies
4 (2006).
strumento, sono regolati da un
sistema di valvole elettromagnetiche (fig. 2.5). La cella elettrochimica (fig.2.6) è
costruita con plexiglass ed è in grado di ospitare un elettrodo di riferimento la cui
composizione è coperta da brevetto, e l’elettrodo d’oro su cui è formato l’SSM, che
funziona da elettrodo di lavoro e può essere
inserito e disinserito dalla cella con facilità.
Tramite l’apertura o la chiusura delle valvole è
possibile scambiare rapidamente, nella cella, le
soluzioni provenienti dai tre contenitori, e
quindi realizzare salti di concentrazione di un
determinato substrato alla superficie dell’SSM.
La cella con l’elettrodo, per le misure di
corrente capacitiva, è inserita all’interno dello
strumento che funziona da gabbia di Faraday Figura 2.6. Cella elettrochimica.
per diminuire al minimo il rumore elettrico di http://www.bioelectrolab.unifi.it .
fondo dell’ambiente circostante. In condizioni
di lavoro ottimali, il rumore elettrico è compreso tra 10 e 20 pA. Le funzioni dello
strumento possono essere tutte controllate ed eseguite direttamente dal PC grazie
all’installazione dell’apposito software, fornito sempre dalla IonGate.
2.4 METODO DEL SALTO DI CONCENTRAZIONE
Il metodo utilizzato in questi esperimenti è stato quello del salto di concentrazione, che
si realizza scambiando velocemente alla superficie dell’SSM una soluzione non
attivante con una attivante contenente il substrato, nel nostro caso ATP. La sequenza
One
utilizzata con lo strumento SURFE2R
è denominata “Jump ATP”. Nel protocollo
standard viene fatta fluire in cella la soluzione non attivante costituita dal buffer di
lavoro, per 1 secondo, quindi si immette in cella la soluzione attivante (2 secondi). La
soluzione attivante è costituita dal buffer di lavoro con l’aggiunta di ATP 100 µM. Lo
28
scambio tra soluzione non attivante e soluzione attivante determina il salto di
concentrazione del substrato ATP alla superficie dell’SSM. In seguito al salto di ATP,
le proteine adsorbite su SSM si attivano e generano una corrente elettrica (flusso di
ioni Ca2+ verso l’interno della vescicola), che viene registrata dallo strumento come
transiente di corrente capacitiva. Si rimuove infine la soluzione attivante dalla cella
con la soluzione non attivante
(2 secondi) in modo da
riportare la proteina in uno
stato di riposo prima di
effettuare un nuovo salto di
concentrazione.
Prima
di
ripetere la misura si attende,
infatti, un tempo di 200 s,
tempo necessario affinché tutti
gli ioni Ca2+ accumulati
all’interno delle vescicole,
durante l’attività della SERCA,
fuoriescano annullando il
gradiente di concentrazione
formatosi. Questo tempo di
attesa garantisce che vengano
Figura 2.7. Rappresentazione schematica di una vescicola
ripristinate
le
condizioni
contenente SERCA adsorbita su SSM e soggetta ad un
iniziali
prima
di
ogni
misura, e
salto di concentrazione di ATP. In condizioni
2+
ciò
garantisce
elevata
potenziostatiche l’accumolo di ioni Ca all’interno della
riproducibilità. La misura del
vescicola è compensata da un flusso di elettroni verso
l’elettrodo
d’oro.
F.
Tadini-Buoninsegni,
G.
transiente di corrente avviene
Bartolommei, M. R. Moncelli, K. Fendler; “Charge
in condizioni potenziostatiche,
transfer in P-type ATPases investigated on planar
cioè
mantenendo
una
membranes”; Archives of Biochemistry and Biophysics
differenza
di
potenziale
476 (2008), 75–86.
costante tra l’elettrodo d’oro e
quello di riferimento. In condizioni potenziostatiche l’accumolo di ioni di carica
positiva (ioni Ca2+), trasportati dalla proteina all’interno della vescicola, viene
compensato da un flusso di elettroni lungo il circuito esterno verso l’elettrodo d’oro
(fig. 2.7). Tale flusso di elettroni costituisce il transiente di corrente capacitiva
misurato sperimentalmente.
29
30
Capitolo 3
Risultati e Discussione
31
32
3.1 OBIETTIVO
Durante questi esperimenti sono state fatte misure di tipo elettrico sulla Ca2+-ATPasi
del reticolo sarcoplasmatico (SERCA), utilizzando lo strumento SURFE2RONE. Come
primo esperimento è stata fatta una prova di inibizione con la tapsigargina e
successivamente con cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)]. Successivamente è stato analizzato
l’effetto del cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] in presenza di glutatione ridotto in soluzione.
Infine è stato valutato l’effetto del cis-platino a varie concentrazioni per ricavarne la
costante di semi-inibizione.
3.2 MISURA DEL TRANSIENTE DI CORRENTE[26]
La misura del transiente di corrente viene effettuata in condizioni di pre-stazionarietà,
ovvero in tempi più brevi rispetto al turnover della proteina, e sottoponendo il
campione ad un salto di concentrazione del substrato attivante. Si osserva un transiente
di corrente capacitiva quando uno o più stati elettrogenici sono coinvolti nel
rilassamento che segue l’attivazione della proteina. Questo transiente di corrente
capacitiva è descritto da un’equazione di decadimento esponenziale:
y(x) =
.
(3.1)
L’andamento esponenziale della corrente capacitiva è quello classico che assume nei
circuiti RC. Ai e τi sono rispettivamente l’ampiezza del segnale e la costante di tempo
dello stadio i-esimo, n il numero totale di stadi elettrogenici.
Risolvendo il circuito equivalente per lo specifico sistema utilizzato in questi
esperimenti, l’espressione della corrente misurata è:
I(t) =
(3.2)
=
(3.3)
con
k0 =
dove Cf e Gf sono rispettivamente la capacità e la conduttanza del bistrato lipidico
(SSM), e Cp e Gp la capacità e la conduttanza della membrana che contiene la
proteina.
La relazione tra corrente misurata, che si è descritto, e la corrente generata dalla
proteina è piuttosto semplice se si considerano tempi brevi, e cioè se t
dove
=
. La relazione tra corrente prodotta dalla proteina (Ip) e quella misurata (I)
è:
(3.4)
33
In figura 3.1 è illustrato il
transiente
di
corrente
capacitiva generato dalla
proteina
SERCA.
La
soluzione non attivante ha la
seguente composizione: KCl
100mM; MOPS 25mM;
MgCl2 1 mM; CaCl2
0,25mM; EGTA 0,25 mM;
[Ca2+]libero= 10 µM, pH = 7 .
La soluzione attivante ha la
stessa composizione e in
aggiunta contiene ATP 100
µM. Il decadimento fino a
zero del segnale non significa
Figura 3.1. Transiente di corrente capacitiva della SERCA.
che la proteina cessa la sua
attività di trasporto di ioni
2+
Ca , ma soltanto che non vi è più variazione nel tempo della differenza di potenziale
attraverso la membrana che contiene la proteina. Ciò avviene quando la proteina
raggiunge il turnover e il flusso di ioni calcio verso l’interno delle vescicole che
contengono la SERCA è bilanciato dal flusso di ioni calcio che fuoriescono dalle
vescicole, il quale è reso possibile dallo ionoforo calcimicina ( A23187).
3.3 RISULTATI E DISCUSSIONE
La capacità di inibizione
della tapsigargina (TG) nei
confronti della SERCA è
molto elevata, ben nota e
descritta in letteratura[1-5,9,10].
Infatti la costante di semiinibizione è inferiore al nano
molare. Abbiamo quindi
usato la TG per un confronto
con i dati relativi al composto
cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)].
In figura 3.2 sono illustrati
i risultati ottenuti. I transienti
di corrente riportati sono
quelli prodotti dalla SERCA
a seguito di un salto di ATP
100 µM in assenza (linea
Figura 3.2. Transienti di corrente generati dalla SERCA
dovuti ad un salto di concentrazione di ATP 100 µM. La
grigia) e in presenza di
linea grigia indica il transiente ottenuto in assenza di
tapsigargina a concentrazione
tapsigargina, mentre quella rossa indica il transiente
100 nM (linea rossa). La
ottenuto con una concentrazione di tapsigargina 100 nM.
proteina SERCA è stata
[ Ca2+]libero ≈ 0, pH = 7.
inizialmente attivata con un
salto di concentrazione di ATP 100 µM ed abbiamo registrato il transiente di corrente
(linea grigia di fig. 3.2). La proteina è stata, quindi, incubata con una soluzione
34
contenente tapsigargina 100 nM in assenza di ioni Ca2+ per circa 10 minuti. Abbiamo
poi ripetuto il salto di ATP 100 µM in presenza di TG 100 nM, ed abbiamo osservato
che il transiente di corrente scompare quasi completamente, confermando così, il forte
effetto inibitorio della tapsigargina nei confronti della SERCA.
Abbiamo, quindi, fatto un’indagine preliminare dell’effetto del cis-platino sulla
SERCA.
Figura 3.3. Transienti di corrente generati dalla SERCA dovuti ad un salto di
concentrazione di ATP 100 µM. In assenza (linea grigia) e in presenza di una
concentrazione di cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] a concentrazione 10 µM (linea rossa).
[ Ca2+]libero = 10 µM, pH = 7.
In questo studio abbiamo poi verificato l’effetto del cis-platino in presenza di
glutatione ridotto (GSH) e di
ditiotreitolo (DTT).
Nell’esperimento in presenza
di GSH che, in condizioni
fisiologiche, è presente nella
cellula a concentrazione
millimolare si vede che
l’effetto del cis-platino è
molto limitato. In figura 3.4
sono mostrati i transienti di
corrente capacitiva ottenuti
con una soluzione tampone
contenente GSH 1 mM.
Come si nota bene il segnale
generato dalla SERCA in
assenza
di
cisFigura 3.4 Transienti di corrente generati dalla SERCA
[Pt(NH
)
(SO
)(H
O)]
(linea
3
2
4
2
dovuti ad un salto di concentrazione di ATP 100 µM.
grigia) o in presenza di una
Questi sono stati ottenuti con la presenza nel buffer di
sua concentrazione 10 µM
GSH 1mM. La linea grigia indica il transiente ottenuto in
assenza di cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)], mentre quella rossa
sono molto simili. Ciò vuol
indica il transiente ottenuto con una concentrazione 10 µM
dire che in presenza di GSH a
di cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)]. [ Ca2+]libero = 10 µM, pH = 7.
concentrazione 1mM il cis35
[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] non è in grado di inibire la SERCA. Il glutatione ridotto svolge
pertanto un effetto protettivo sulla SERCA nei confronti dell’inibizione ad opera di cisplatino. Un simile effetto protettivo di specie a basso peso molecolare contenenti
gruppi -SH è stato osservato in esperimenti di inibizione della Na, K-ATPasi e della
SERCA con cis-platino[14][27].
Nell’esperimento con DTT 1
mM si vede che il cis[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] ha un
effetto
trascurabile
sull’attività della proteina (fig.
3.5).
Questi esperimenti hanno
confermato i dati di letteratura
ottenuti con metodi diversi[1416]
. Inoltre, nel
nostro
laboratorio, si era notato che il
cis-diamminodicloroplatino
non aveva un effetto rilevante
sulla SERCA in presenza di
DTT 1 mM nel buffer di
lavoro[13].
Figura 3.5. Transienti di corrente generati dalla SERCA
dovuti ad un salto di concentrazione di ATP 100 µM.
Questi sono stati ottenuti con la presenza nel buffer di
DTT 1mM. La linea grigia indica il transiente ottenuto in
assenza di cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)], mentre quella rossa
indica il transiente ottenuto con una concentrazione 10 µM
di cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)]. [ Ca2+]libero = 10 µM, pH = 7.
Visto il forte effetto inibitore
sulla SERCA da parte del cisplatino a concentrazione
10µM (fig.3.3), abbiamo studiato l’effetto del composto a concentrazioni più basse.
Figura 3.6. Transienti di corrente generati dalla SERCA
dovuti ad un salto di concentrazione di ATP 100 µM. In
assenza (linea grigia) e in presenza di varie concentrazioni
di cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)]: 0,5 µM (linea verde) e 5 µM
(linea rossa). [ Ca2+]libero = 10 µM, pH = 7.
La figura 3.6 illustra l’effetto
di
inibizione
del
cis[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)]
alle
concentrazioni di 0,5 µM
(linea verde) e 5 µM (linea
rossa), in confronto al segnale
ottenuto in assenza di cisplatino ( linea grigia).
I transienti di corrente
capacitiva sono stati misurati
dopo un tempo di incubazione
di 30 minuti ad ogni nuova
concentrazione di cis-platino.
Nella figura è ben visibile
come l’intensità del segnale di
corrente
diminuisca
con
l’aumentare
della
concentrazione
di
cis[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] usata.
36
Per determinare la costante di semi-inibizione (IC50), che indica la concentrazione di
inibitore necessaria affinché l’attività della proteina diminuisca del 50%, abbiamo fatto
esperimenti a concentrazione di cis-platino da 0,05 a 20 µM.
Il valore IC50 può essere ricavato dalla curva di inibizione descritta in figura 3.5. Il
grafico mostra l’andamento della carica normalizzata in funzione della concentrazione
di cis-platino. La carica trasportata dalla proteina si ottiene dall’integrale del transiente
di corrente capacitiva (fig.3.1)
che rappresenta la media di 5
misure fornite dallo strumento
One
SURFE2R .
La normalizzazione della
carica trasportata si effettua
dividendo
il
valore
dell’integrale del segnale di
corrente, ottenuto ad una data
concentrazione di cis-platino,
per il valore dell’integrale del
segnale
di
riferimento,
ottenuto realizzando un salto
di ATP 100 µM in assenza di
cis-platino, sempre sullo
Figura 3.5. Curva di inibizione della SERCA in presenza
di varie concentrazioni di cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)]. R2 =
stesso elettrodo. Per ogni
0.99426, IC50 = 1.3445 ± 0.11342 µM.
diversa concentrazione di cis[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] sono
stati calcolati 2 o 3 valori di carica normalizzata, eccetto per le concentrazioni 0,05 µM
e 20 µM, relative ad un singolo esperimento. In tabella II sono state riportate le medie
dei valori di carica normalizzata risultanti da 2 o 3 misure alle varie concentrazioni di
cis-platino, con annessi errori standard. Per quanto riguarda la costante di semiinibizione, si è ottenuto un valore di: IC50 = 1.3 ± 0.1 µM. Per cui, alla luce di questo
risultato si può dire che il cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] ha un’affinità molto elevata con la
SERCA.
Tabella II
Errore standard
µM
Q ( % di carica
trasportata )
0,05
0,1
0,5
0,7
1
2
5
10
20
104,6
98,2
90,5
82,6
61,9
40,0
9,5
9,1
5,8
5,5
11,6
4,7
15,8
1,4
3,0
3,4
-
[cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)]]
37
38
CONCLUSIONI
In questo lavoro è stata studiata l’interazione della SERCA con la tapsigargina (TG),
che è un suo inibitore specifico e molto potente, e con il cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] (la
specie monoidrata del cis-platino), un suo potenziale inibitore. La spiccata capacità di
inibizione della SERCA da parte della tapsigargina, riconosciuta ampiamente in
letteratura, è stata subito confermata notando un’inibizione praticamente completa già
ad una concentrazione di TG sub-micromolare (100nM).
Procedendo con gli esperimenti di inibizione con il cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)],
abbiamo osservato una notevole affinità di questa molecola con la SERCA. Infatti,
come si può vedere dalla tabella II, si nota un’inibizione della carica trasportata dalla
SERCA (10%) già ad una concentrazione di cis-platino di 0,5 µM.
Il valore della costante di semi-inibizione (IC50) calcolato rende ben manifesto quello
che si può evincere dai dati in tabella II. Dalle nostre misure si ricava un valore di IC50
per il cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] pari a 1,3 µM. Possiamo pertanto concludere che il
cis-platino è un inibitore ad alta affinità per la proteina SERCA.
A questo proposito, è interessante confrontare il valore di IC50 del cis[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)], da noi determinato, con le costanti di semi-inibizione di alcuni
inibitori specifici della SERCA determinate in altri studi svolti nel nostro
laboratorio[28].
Tabella III
CisMolecola Tapsigargina
Acido
DBHQ
TITU [Pt(NH3)2(SO4)(H2O)]
(TG)
Ciclopiazonico
IC50
0,3±0,03nM
5,1±0,5nM
0,25±0,02µM 15±3µM
1,34±0,11µM
Come mostrato in tabella, la tapsigargina è l’inibitore più specifico e potente della
SERCA con una costante di semi-inibizione pari a 0,3 nM, ed in grado di inibire la
proteina in modo irreversibile.
Abbiamo poi osservato che l’effetto inibitorio del cis-platino sulla SERCA è
fortemente ridotto se nella soluzione tampone è presente la forma ridotta del
glutiatione a concentrazione mM. Il glutiatione ridotto ha quindi un’azione protettiva
nei confronti dell’inibizione della SERCA da parte del cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)].
Alla luce dei risultati ottenuti, sarebbe interessante studiare in dettaglio il meccanismo
di interazione del cis-platino con la proteina SERCA. Ad esempio, sarebbe importante
verificare se il cis-platino è in grado di inibire, non solo il trasporto di ioni Ca2+, ma
anche il legame di ioni calcio dal lato citoplasmatico della proteina. Sarebbe inoltre
utile indagare se il cis-platino può interferire con la formazione dell’intermedio
fosforilato dell’enzima.
In conclusione, lo studio dell’interazione del cis-[Pt(NH3)2(SO4)(H2O)] con la SERCA
merita, senza dubbio, ulteriori approfondimenti al fine di evidenziare eventuali
analogie o discordanze con altri inibitori della Ca-ATPasi.
39
BIBLIOGRAFIA
[1] L.Yatime, M. J. Buch-Pedersen, M. Musgaard, J. Preben Morth, A. M. Lund
Winther, B. P. Pedersen, C. Olesen, J. P. Andersen, B. Vilsen, B. Schiøtt, M. G.
Palmgren, J. V. Møller, P. Nissen, N. Fedosova; “P-type ATPase as drug targets:
Tools for medicine and science”; Biochimica et Biophysica Acta 1787 (2009) 207220.
[2] C. Toyoshima, M. Nakasako, H. Nomura, H. Ogawa; “Cristal structure of the
calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 Å resolution”; International weekly
journal of science nature 405 (2000), 647-655.
[3] G. Inesi, C. Toyoshima; “Catalytic and Transport Mechanism of the Sarco(Endo)Plasmic Reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)”; da “Handbook of ATPases” a cura
di M. Futani, Y. Wada, J. H. Kaplan, (2004) 63-87.
[4] S.R. Denmeade, J.T. Isaacs; “The SERCA pump as a therapeutic target. Macking a
“smart bomb” for prostate cancer”; Cancer Biology & Therapy 4 (2005) 14-22.
[5] S. R. Denmeade, A. M. Mhaka, D. M. Rosen, W. N. Brennen, S. Dalrymple, I.
Dach, C. Olesen, B. Gurel, A. M. DeMarzo, G.Wilding, M. A. Carducci, C. A. Dionne,
J. V. Møller, P. Nissen, S.B. Christensen, J. T. Isaacs; Engineering a prostate-specific
membrane antigen–activated tumor endothelial cell prodrug for cancer therapy; Sci
Transl Med. (2012), 4 140ra86.
[6] A. Bergner, J. Kellner, A. Tufman, R. M. Huber; “Endoplasmic reticulum Ca2+homeostasis is altered in small and non-small cell lung cancer cell lines”; Journal of
Experimental & Clinical Cancer Research (2009), 28:25.
[7] E. Hughes, R. Edwards, D. A. Middleton; “Heparin-derived oligosaccharides interact with the phospholamban cytoplasmic domain and stimulate SERCA function”;
Biochemical and Biophysical Research Communications 401 (2010), 370–375.
[8] S. Krishna, S. Pulcini, C. M. Moore, B. H.-Y. Teo, H. M. Staines; “Pumped up: reflections on PfATP6 as the target for artemisinins”; Trends in Pharmacological Sciences (2014), Vol. 35 n°1.
[9] F. Michelangeli, J. M. East; “A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors”; Biochemical Society Transactions (2011) Volume 39, part 3, 789-797.
[10] G.R. Monteith, D. McAndrew, H. M. Faddy,S. J. Roberts-Thomson; “ Calcium
and cancer: targeting Ca2+ transport”; Nature Publishing Group (2007), volume 7,
519-530.
[11] T. G. Cotter; “Apoptosi: Morte Cellulare Programmata”; enciclopedia Treccani
(2007).
40
[12] R. Rizzuto, P. Pinton, D. Ferrari, M. Chami, G. Szabadkai, P. J. Magalhães, F. Di
Virgilio,
T. Pozzan; “Calcium and apoptosis: facts and hypotheses”; Oncogene,Nature Publishing Group (2003) 22, 8619-8627.
[13] F.Z. Sadafi, L.Massai, G. Bartolommei, M. R. Moncelli, L. Messori, F. TadiniBuoninsegni; “Anticancer ruthenium(III) complex KP1019 interferes with ATPdependent Ca2+ traslocation by sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)”;
ChemMedChem, 9 (2014), 1660-1664.
[14] M. Huličiak, J. Vacek, M. Šebela, E. Orolinovà, J. Znaleziona, M. Havlìkova, M.
Kubala; “Covalent binding of cisplatin impairs the function of Na+/K+-ATPase by
binding to its cytoplasmic part”; Biochemical Pharmacology 83 (2012) 1507–1513.
[15] P. Souza dos Santos, D. F. Saraiva, D. C. Ferraz da Costa, H. M. Scofano, P. Cesar de Carvalho-Alves; “TriXuoperazine protects brain plasma membrane Ca2+ATPase from oxidative damaging”; Exp Brain Res 177 (2007), 347–357.
[16] P. Dell'Antone; “Inactivation of H+-vacuolar ATPase by the energy blocker 3bromopyruvate,a new antitumour agent”; Life Sciences 79 (2006) 2049–2055
[17] V. Schneider, M. L. Krieger, G. Bendas, U. Jaehde, G. V. Kalayda; “Contribution
of intracellular ATP to cisplatin resistance of tumor cells”; J Biol Inorg Chem 18
(2013), 165-174.
[18] H. Burger, W. J. Loos, K. Eechoute, J. Verweij, R. H.J. Mathijssen, E. A.C.
Wiemer; “Drug tranporters of platinum-based anticancer agents and their clinical
significance”; Drug Resistance Updates 14 (2011), 22–34.
[19] K. Leonhardt, R. Gebhardt, J. Mössner, S. Lutsenko, D. Huster; “Functional interactions of Cu-ATPase ATP7B with cisplatin and the role of ATP7B in the resistance
of cells to the drug”; the journal of biological chemistry vol. 284, (2009), 7793–7802.
[20] R. Safaei, S. Otani, B. J. Larson, M. L. Rasmussen, S. B. Howell; “Transport of
Cisplatin by the Copper Efflux Transporter ATP7B”; Mol. Pharmacol 73 (2008), 461–
468.
[21] R. P. Miller, R. K. Tadagavadi, G. Ramesh, W. B. Reeves; “Mechanisms of
Cisplatin Nephrotoxicity”; Toxins 2 (2010), 2490-2518.
[22] S. Eletr, G. Inesi; “Phospholipid orientation in sarcoplasmic membranes: spinlabel ESR and proton MNR studies”; Biochim Biophys Acta 202 (1972), 174-179.
[23] O. H. Lowry, N. J. Rosenbrough, A. L. Farr, R. J. Randall; “Protein measurement
with the folin phenol reagent”; J Biol Chem 193 (1951), 265-275.
[24] P. Schulz, J. J. Garcia-Celma, K. Fendler; “SSM-based electrophysiology”;
Methods 46 (2008), 97–103.
41
[25] F. Tadini-Buoninsegni, R. Herrero, M.R. Moncelli; “Alkanethiol monolayers and
alkanethiol phospholipid bilayers supported by mercury: An electrochemical characterization”; Journal of Electroanalytical Chemistry 452 (1998),33-42.
[26] P. Schulz, J. J. Garcia-Celma, K. Fendler; “SSM-based electrophysiology”;
Methods 46 (2008), 97-103.
[27] D. Jardim-Messeder, J. Camacho-Pereira, A. Galina; “3-Bromopyruvate inhibits
calcium uptake by sarcoplasmic reticulum vesicles but not SERCA ATP hydrolysis
activity”; The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 44 (2012), 801–
807.
[28] F. Tadini-Buoninsegni, G. Bartolommei, M.R. Moncelli, D. M. Tal, D. Lewis, G.
Inesi; “Effects of high-affinity inhibitors on partial reactions, charge movements, and
conformational states of the Ca2+ transport ATPase (Sarco-Endoplasmic reticiculum
Ca2+ ATPase)”; Molecular Pharmacology 73 (2008), 1134-1140.
42