Differential gene
expression and metformin
efficacy in patients with
type 2 diabetes
Diego Bailetti
Diabete Mellito
Disturbo Metabolico complesso, caratterizzato da
Iperglicemia
Epidemiologia:
- 8% popolazione mondiale.
Clinica:
riconosciute diverse forme
- Tra le maggiori cause di morbilita’
(gravi complicanze croniche, soprattutto cardiovascolari) e mortalità.
Proporzioni di un’epidemia molto gravosa per i S.S.N.
DMT1 – 5-10%
DMT2 – 90%
MODY
insorgenza precoce
(infanto-giovanile),
grave deficit di
secrezione insulinica
per distruzione betacellulare su base
automimmunitaria.
insorgenza tardiva (>3040aa), caratterizato da
insulino-resistenza causata
sia da fattori ambientali
(eta’/obesita’/ipoattivita’
fisica) che genetici.
forma rara, mendeliana ad
esordio giovanile.
Identificati difetti
intracellulari della via
d’azione dell’Insulina;
attualmente riconosciuti 11
geni
Metformina
Ipoglicemizzante Orale piu’ usato
Insulino-sensibilizzante:
-
potenziando l'attività biologica dell’insulina (sulla gluconeogenesi e
lipogenesi)
riducendo la infiammazione cronica che caratterizza i soggeti
dismetabolici ed insulino-resistenti
principalmente attraverso:
Inibizione del Complesso 1 della catena respiratoria mitocondriale
( produzione di ATP)
Attivazione AMP-K via LBK1 (stimola il CATABOLISMO:
Attiva: ossidazione acidi grassi e internalizzazione glucosio;
Inibisce: neosintesi glucosio, lipidi e proteine)
Scopo
Investigare se il trattamento con Metformina in pazienti DMT2 associa
con variazioni nei profili d’espressione di geni che identificano in
maniera univoca specifiche vie metaboliche
Approccio combinato mediante analisi
Biostatistica e Bioinformatica su dati di
espressione dell’intero trascrittoma
cellule del sangue periferico -PWBCsvalutati pre e post monotrattamento
(3 mesi) con Metformina.
A
Analisi espressione
genica su PWBCs
pre/post trattamento
B
C
Correlazione fra le
modifiche
dell’espressione genica
ed efficacia della
metformina (∆ glicemia)
Correlazione tra
espressione genica basale
ed efficacia della
metformina (∆ glicemia)
Casistica
70 pazienti DMT2
- wash-out della precedente terapia con ipoglicemizzanti orali per 5 giorni;
- trattamento con metformina (2.550 mg/die) per 3 mesi
- misurazioni antropometriche e determinazioni bioumorali pre/post
trattamento;
- prelievo di sangue periferico per estrazione di RNA da PWBCs pre/post
trattamento;
Materiali e Metodi
Estrazione RNA Totale:
PAXgene Blood RNA kit
Valutazione qualità/quantità:
Nanodrop/ BioAnalyzer 2100 (RIN>8.0)
Array di espressione:
Sintesi cDNA, marcatura con Biotina, Ibridazione
con GeneChip Human Gene 1.0 ST array per 16h,
lavaggio, acquisizione dati;
Estrazione e normalizzazione mediante Affymetrix
Expression console
Real time con saggi TaqMan
Ottenimento dati:
Conferma dati:
Risultati Clinici
L’efficacia della Metformina è stata valutata come:
variazione del livello plasmatico di glucosio a digiuno (post-pre trattamento)
espressa in termini di percentuale di riduzione (miglioramento).
Scopo
Investigare se il trattamento con Metformina in pazienti DMT2
associa con variazioni nei profili d’espressione di geni che
identificano in maniera univoca specifiche vie metaboliche
A
Analisi espressione genica su
PWBCs pre/post trattamento
Studio A
L’analisi di espressione genica pre/post trattamento (FDR<0.01)
ha evidenziato 1763 geni differenzialmente espressi
694 UP regolati:
nessuna pathway modificata significativamente dopo aggiustamento
per comparazioni multiple.
1069 DOWN regolati:
Term
Count
%
PValue
Bonferroni Benjamini
FDR
hsa03040:Spliceosome
21
1.979265 1.10E-04 0.018549 0.018549 0.018549
hsa03018:RNA degradation
12
1.131008 7.53E-04 0.126531 0.126531 0.063642
hsa05012:Parkinson's disease
hsa00190:Oxidative
phosphorylation
18
1.696513 0.002771 0.462744 0.462744 0.138116
18
1.696513 0.003269 0.542657 0.542657 0.138116
hsa03050:Proteasome
9
0.848256 0.008644
1
1
0.271036
hsa05016:Huntington's disease
21
1.979265 0.009623
1
1
0.271036
Scopo
Investigare se il trattamento con Metformina in pazienti DMT2
associa con variazioni nei profili d’espressione di geni che
identificano in maniera univoca specifiche vie metaboliche
B
Correlazione fra le modifiche
dell’espressione genica e del
∆glicemia dopo il trattamento
Studio B
Sono stati evidenziati 999 geni le cui espressioni differenziali (∆ di
espressione pre- vs. post-trattamento) dopo metfomina erano correlate
con il ∆ glicemia.
513 negativamente correlate:
nessuna pathway significativamente associata
486 positivamente correlate:
Term
hsa03040:Spliceosome
hsa04110:Cell cycle
hsa00970:Aminoacyl-tRNA biosynthesis
hsa05016:Huntington's disease
hsa05010:Alzheimer's disease
hsa00280:Valine, leucine and isoleucine degradation
hsa03420:Nucleotide excision repair
hsa04120:Ubiquitin mediated proteolysis
Count
16
11
5
9
8
4
4
7
%
3.305785
2.272727
1.033058
1.859504
1.652893
0.826446
0.826446
1.446281
PValue Bonferroni Benjamini
FDR
9.26E-08 1.06E-05 1.06E-05 1.06E-05
4.40E-04 0.050133 0.050133 0.025287
0.012815
1
1
0.491249
0.048024
1
1
1
0.072301
1
1
1
0.07491
1
1
1
0.07491
1
1
1
0.086176
1
1
1
Si osserva quindi una correlazione positiva. Cioe’ ad una maggiore
riduzione della glicemia e’ associata una maggior riduzione della
espressione dei geni dello Spliceosoma
Scopo
Investigare se il trattamento con Metformina in pazienti DMT2
associa con variazioni nei profili d’espressione di geni che
identificano in maniera univoca specifiche vie metaboliche
C
Valutazione di una eventuale correlazione
tra espressione genica basale e
responsivita’ alla Metformina
Studio C
Correlazione espressione basale con efficacia metformina
[Criterio di filtro P< 0.05 e r > 0.30]
637 geni positivamente correlati:
nessuna pathway significativamente associata
798 geni negativamente correlati:
Term
Count
%
PValue
Bonferroni Benjamini FDR
hsa03040:Spliceosome
26
3.27044 7.61E-12 1.07E-09 1.07E-09 1.07E-09
hsa04110:Cell cycle
15 1.886792 3.30E-04 0.046233 0.046233 0.023282
hsa03030:DNA replication
7
0.880503 0.002428872 0.337613 0.337613 0.114157
hsa00970:Aminoacyl-tRNA biosynthesis
7
0.880503 0.004767082 0.657857 0.657857 0.16804
hsa03018:RNA degradation
8
1.006289 0.00635228 0.870262 0.870262 0.179134
hsa00230:Purine metabolism
13
1.63522 0.016097553
1
1
0.378293
hsa04114:Oocyte meiosis
10 1.257862 0.027522675
1
1
0.554385
hsa00240:Pyrimidine metabolism
9
1.132075 0.031627729
1
1
0.557439
I livelli di espressione baseline dei 26 geni appartenenti alla pathway dello
Splicesoma sono negativamente correlati con la diminuzione della glicemia
(efficacia): più basso è il valore baseline di espressione, maggiore e’ la
riduzione della glicemia.
Entrez ID
Gene
probeset_id
r_Pearson
pvalue
fdr_adj_p
R2
57461
6637
144983
22938
51729
10946
3178
9716
220988
56259
3192
10569
10713
55660
10772
6431
6432
55696
6629
ISY1
SNRPG
HNRNPA1L2
SNW1
WBP11
SF3A3
HNRNPA1
AQR
HNRNPA3
CTNNBL1
HNRNPU
SLU7
USP39
PRPF40A
SRSF10
SRSF6
SRSF7
RBM22
SNRPB2
8090533
8026339
7969263
7980463
7961489
7915130
7955890
7987325
8080991
8062409
7925565
8115606
8043218
8055913
8039947
8062695
8051622
8115168
8061075
-0.32
-0.38
-0.35
-0.31
-0.32
-0.39
-0.32
-0.33
-0.31
-0.32
-0.41
-0.31
-0.33
-0.33
-0.34
-0.39
-0.38
-0.38
-0.33
0.01
0.00
0.01
0.02
0.01
0.00
0.01
0.01
0.02
0.01
0.00
0.01
0.01
0.01
0.01
0.00
0.00
0.00
0.01
0.31
0.29
0.30
0.32
0.31
0.29
0.31
0.31
0.32
0.31
0.27
0.31
0.31
0.31
0.31
0.29
0.29
0.29
0.31
0.11
0.15
0.13
0.10
0.10
0.15
0.10
0.11
0.09
0.10
0.16
0.10
0.11
0.11
0.12
0.15
0.14
0.15
0.11
R2 dell’analisi multivariata = 0.57
Complessivamente, i 26 geni “spiegano” il 57% della variabilita’
dell’efficacia terapeutica del farmaco
Sommario
A.
B.
C.
Il trattamento con metformina DOWNregola la pathway
dello Spliceosoma;
La DOWNregolazione media dei geni dello
Spliceosoma correla positivamente con l’efficacia
terapeutica della Metformina;
I livelli pre-trattamento dei geni dello Spliceosoma
correlano negativamente con l’efficacia terapeutica
della Metfomina e ne spiegano il 57% della variabilità.
Ipotesi
SPLICEOSOMA
Metformina
Flogosi cronica
Secrezione Insulina
Resistenza Insulina
DMT2
Ipotesi
SPLICEOSOMA
Metformina
Flogosi cronica
Secrezione Insulina
Resistenza Insulina
DMT2
ESPERIMENTI IN CORSO:
Valutazione dell’ espressione genica in vitro
mediante array di espressione dopo trattamento
con METFORMINA su linee cellulari umane
monociti (U937) ed epatociti (HEPG2).
Questi esperimenti permetteranno di chiarire almeno in parte
i meccanismi mediante i quali la metformina è in grado
di espletare la sua azione biologica/molecolare
(diretta o mediata) sullo spliceosoma.
Istituto CSS-Mendel- Roma:
Dr. Diego Bailetti
Dr.ssa Vittoria Proto
Prof. Vincenzo Trischitta
Dr.ssa Sabrina Prudente
IRCCS Ospedale Pediatrico
Bambino Gesù -Roma
Laboratorio espressione genica
e microarray
Università di Catania
Dipartimento di bio-medicina
clinica e molecolare
Dr.ssa Maria Grazia Farina
Prof.ssa Lucia Frittitta
IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza
-San Giovanni Rotondo
Unità di Biostatistica
Dr. Massimiliano Copetti
Dr. Fabio Pellegrini
Dr. Andrea Masotti
Dr.ssa Letizia Da Sacco
Unità di Endocrinologia
Dr.ssa Ornella Ludovico
Dr.Antonio Palena
Dr. Salvatore De Cosmo