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RANSOD
Superossido Dismutasi
PRODOTTI PER RICERCA
FINALITÀ D’USO.
Per la determinazione quantitativa in vitro della Superossido dismutasi nel sangue intero.
N.Cat.
RAN-SD 125
5 x 11 t
1. Substrato Miscelato 5 x 20 ml
2. Tampone
1 x 105 ml
3. Xantina Ossidasi
3 x 10 ml
4. Standard
5 x 10 ml
PRINCIPIO del DOSAGGIO
Il ruolo della superossido dismutasi (SOD) è di accelerare la dismutazione del radicale superossido tossico
•
(02 ), prodotto nei processi ossidativi, in perossido di idrogeno e ossigeno molecolare.
Questo metodo usa la xantina e la xantina ossidasi (XOD) per generare dei radicali superossido che
reagiscono poi con il cloruro di 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-fenoiltetrazolio (I.N.T.) per formare un
pigmento formazan rosso. L’attività della superossido dismutasi è quindi misurata dal grado di inibizione di
questa reazione. Un’unità di SOD è quella che inibisce al 50% la velocità di riduzione dell’INT nelle
condizioni del dosaggio.
XOD
Xantina
Acido urico + 02•
•
02
I.N.T.
formazan colorato
OPPURE
02•. + 02•.+ 2H+
SOD
02 + H202
PREPARAZIONE dei CAMPIONI
Usare campioni di sangue intero eparinati o con EDTA . Si consiglia di lavare gli eritrociti quattro volte con
una soluzione di NaCl allo 0.9%.
Centrifugare 0.5 ml di sangue intero per 10 minuti a
3000 giri/min., quindi aspirare via il plasma.
In seguito, lavare gli eritrociti quattro volte con 3 ml di soluzione di NaCl allo 0.9%, centrifugando per 10
minuti a 3000 giri/min. dopo ogni lavaggio.
Portare gli eritrociti, lavati e centrifugati, a 2.0 ml aggiungendo acqua bidistillata fredda. Miscelare e lasciar
riposare a +4°C per 15 minuti. Il lisato è diluito con 0.01 mol/l di Tampone Fosfato a pH 7.0, in modo che la
% d’inibizione sia compresa tra 30% e 60%.
Per i campioni umani (fattore di diluizione finale = 100) si consiglia una diluizione x 25 volte del lisato, per i
campioni bovini (fattore di diluizione finale = 200) adottare una diluizione x 50 volte.
1
COMPOSIZIONE dei REAGENTI
Contenuto
Concentrazione Iniziale delle Soluzioni
1. Substrato Miscelato
Xantina
0.05 mmol/l
I.N.T.
0.025 mmol/l
2. Tampone
CAPS
40 mmol/l, pH 10.2
EDTA
0.94 mmol/l
3. Xantina Ossidasi
80 U/l
4. Standard
vedere il valore assegnato sulla fiala
AVVERTENZE E MISURE PRECAUZIONALI
Solo per uso diagnostico in vitro. Non pipettare i materiali con pipette a bocca. Rispettare le norme in vigore
per la manipolazione dei reattivi di laboratorio.
Opuscoli illustrativi del Ministero della Sanità Britannico sono disponibili su semplice richiesta.
I reagenti devono essere usati da tecnici di laboratorio qualificati in condizioni di laboratorio
appropriate e per il solo scopo indicato.
STABILITÀ E PREPARAZIONE DEI REAGENTI
1. Substrato Miscelato
Ricostituire il contenuto di una fiala di Substrato Miscelato 1 con 20 ml di Tampone 2. Conservato a +2 +8°C, la soluzione è stabile per 10 giorni.
2. Tampone
Pronto all’uso. Conservato a +2 - +8°C, il contenuto è stabile fino alla data di scadenza riportata.
3. Xantina Ossidasi
Ricostituire una fiala di Xantina Ossidasi 3 con
10 ml di acqua bidistillata. Conservato a +2 - +8°C, la soluzione è stabile per 2 settimane.
4. Standard
Ricostituire una fiala di Standard 4 con 10 ml di acqua bidistillata. Le diluizioni successive di questo
standard devono essere preparate con il diluente Ransod. Per costruire una curva standard, si consiglia
di effettuare le seguenti diluizioni dello Standard 4 (o S6) :Volume di
S6
S5
S4
S3
S2
Volume di
Soluz. Standard
Diluente
Standard non diluito
5 ml di S6
5 ml di S5
5 ml di S4
3 ml di S3
5 ml
5 ml
5 ml
6 ml
S1 = Diluente del campione
Tutti gli standard diluiti sono stabili per 2 settimane a +2 - +8°C.
MATERIALI FORNITI
Substrato Miscelato
Tampone
Xantina Ossidasi
Standard
2
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
Diluente ‘Ransod Diluent’ (N. Cat. RAN-SD 124) (0.01 mol/l Tampone Fosfato, pH 7.0)
Controllo ‘Ransod Control’ (N. Cat. RAN-SD 126)
PROCEDURA
Lunghezza d’onda:
Cuvette:
Temperatura:
Misura:
505 nm
1 cm di cammino ottico
37°C
contro aria
Pipettare nelle cuvette:
Diluente
Campione Diluito
Standard
Diluente Ransod
Substrato miscelato
Standard Campione
S2 - S6
Diluito
----0.05 ml
1.7 ml
--0.05 ml
--1.7 ml
0.05 ml
----1.7 ml
0.25 ml
0.25 ml
0.25 ml
Mescolare bene
Xantina Ossidasi
Miscelare, leggere l’assorbanza iniziale A1 dopo 30 secondi e far partire il cronometro simultaneamente.
Leggere l’assorbanza finale A2 dopo 3 minuti.
CALCOLO
A2 - A1
3
= −A/min. di standard o campione
Tasso di diluente (tasso S1) = tasso di reazione non inibita
= 100 %
Tutti i tassi di reazione degli standard e dei campioni diluiti devono essere convertiti in percentuali del tasso
del diluente, quindi sottratti a 100% per dare una percentuale d'inibizione.
100 -
(−Astd/min x 100)
= % d’inibizione
(−AS1/min)
100 -
(−Acampione/min x 100)
= % d’inibizione
(−AS1/min)
Tracciare la percentuale d’inibizione per ogni standard contro Log10 (conc. standard in unità SOD/ml)
Usare la percentuale d’inibizione del campione per ottenere le unità di SOD dalla curva standard.
unità SOD/ml di sangue intero =
unità SOD/ml dalla curva standard x fattore di diluizione
Conversione in unità SOD/g Emoglobina
unità SOD/ml
= unità SOD/g Emoglobina
g Emoglobina/ml
3
NOTE
(a) Un campione bovino è diluito 300 volte con diluente Ransod. Il campione diluito da un’inibizione del 33
%.
Dalla curva standard:
Numero di unità SOD nel campione = 0.575
(b) Conversione in unità SOD/ml di sangue intero
0.575 x 300 = 172.5 unità SOD/ml
(c) Conversione in unità SOD/g Emoglobina
Valore di emoglobina del campione = 0.118 g/ml
172.5
(unità SOD/ml)/(g Emoglobina/ml) =
= 1461.9
0.118
CONTROLLO QUALITÀ
Per il controllo qualità giornaliero, si consiglia l’uso del siero di controllo ‘Ransod Control’. Si consiglia di
analizzare il controllo almeno una volta al giorno. I valori ottenuti devono essere nei limiti specificati. Se i valori
dovessero essere al di fuori di questi limiti e se un eventuale errore nell’esecuzione fosse escluso dalla
ripetizione del test, è opportuno applicare i seguenti punti:
1. Controllare la programmazione dello strumento e la sorgente di luce.
2. Assicurarsi della pulizia di tutti gli strumenti usati.
3. Controllare l’acqua; eventuali contaminazioni (ad es. batterica) possono contribuire a dare risultati imprecisi.
4. Controllare la temperatura di reazione.
5. Controllare la data di scadenza del kit e del suo
contenuto.
RANGE NORMALI
1102 - 1601 U/g Hb
164 - 240 U/ml
È opportuno che ciascun laboratorio stabilisca il proprio range di valori previsti tenendo conto dell’età, il
sesso, la dieta e la collocazione geografica della popolazione.
LINEARITÀ
I campioni devono essere diluiti per dare un’inibizione compresa tra 30 % e 60 % del tasso del diluente (cioè
della reazione non inibita).
REFERENCES/REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUESQUELLENNACHWEIS/REFERENCIAS/
BIBLIOGRAFIA
1. Woolliams JA, Wiener G, Anderson PH, McMurray
CH Research in Veterinary Science 1983, 34: 253-256.
2. Suttle NF The Veterinary Record 1986, 119: 519-522.
3. Suttle NF, McMurray CH Research in Veterinary Science 1983; 35: 47-52
4. Arthur JR, Boyne R Life Sciences 1985 36: 1569-1575.
Revised 31/05/02
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