DIAGNOSI
(διαγνωσισ = distinguere)
individuazione della causa di una patologia
Diagnosi su base clinica e/o anatomo-patologica
⇒ sospetto o orientamento diagnostico
Diagnosi di laboratorio (diagnosi eziologica)
⇒ conferma diagnostica
ai fini dell’applicazione delle misure di terapia e profilassi
Diagnostica di laboratorio
procedure di laboratorio atte ad accertare l’eziologia delle infezioni
DIAGNOSI DIRETTA
dimostrazione del patogeno direttamente nel campione,
materiale biologico tramite il quale è eliminato o nel quale è
localizzato l’A.E.:
urina, feci, sperma, secrezioni uterine, latte, saliva ……
organi e tessuti
corretto prelievo e corretta conservazione del campione
1
DIAGNOSI DIRETTA
esame microscopico, a fresco o previa colorazione (Gram, Giemsa,
Ziehl-Neelsen ……)
microscopio ottico e microscopio elettronico
DIAGNOSI DIRETTA
isolamento in coltura ed identificazione
terreni colturali e adeguate condizioni di coltura
metodi biomolecolari, evidenziano una o più sequenze
geniche specifiche dell’A.E.
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DIAGNOSI INDIRETTA
evidenziazione delle reazioni causate dai patogeni nell’ospite
produzione di anticorpi specifici
⇒ diagnosi sierologica
siero
prove sierologiche (agglutinazione, fissazione del complemento,
ELISA, IFI, WB …..)
sieroconversione
DIAGNOSI INDIRETTA
reazioni di ipersensibilità
⇒ prove allergiche
prova della tubercolina
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TEST DIAGNOSTICO
definizione
Procedura ben definita utilizzata al fine di raccogliere una
certa informazione
QUALSIASI PROCEDIMENTO CHE VIENE ATTUATO
ALLO SCOPO DI VERIFICARE UN’IPOTESI
non solo le procedure di laboratorio, ma anche un
questionario può essere un test diagnostico
TEST DI SCREENING
definizione
applicato a tutti gli individui di
una popolazione a rischio, soggetti ad una probabilità
più o meno elevata di presentare la malattia considerata
test diagnostico
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SCREENING
Identificazione di animali malati e sani
Procedure economiche, rapide e di semplice impiego
Malattie degli animali di notevole gravità sul piano sanitario ed
economico o zoonosi
BASE dei PIANI di CONTROLLO ed ERADICAZIONE delle MI
Es. test della tubercolina, FdC e Rosa Bengala per brucellosi
Individuare la malattia nei SINGOLI ANIMALI o GRUPPI
Utile quando si utilizza un
test di screening provvisto
di bassa sensibilità
Individuazione di un solo animale
infetto è sufficiente a dichiarare
infetto l’intero gruppo
SCREENING ≠ DIAGNOSI
Screening e diagnosi possono utilizzare lo stesso test, ma
In una procedura diagnostica, il test è impiegato su animali
malati, che mostrano sintomi clinici che fanno sospettare la
presenza della malattia
Le azioni di screening prevedono l’applicazione del test su tutti
gli individui della popolazione, indipendentemente dal loro
stato di salute (animali sani e malati)
Poiché il valore predittivo di un test dipende dalla prevalenza della
malattia, la performance del test sarà meno soddisfacente in caso
di screening rispetto al caso in cui lo stesso test sia utilizzato a
scopo diagnostico
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TEST PATOGNOMONICI E
NON PATOGNOMONICI
I test diagnostici non sono infallibili → falsi positivi e falsi negativi
Sulla base dell’affidabilità dei risultati forniti si dividono in due
categorie:
TEST PATOGNOMONICI e
NON PATOGNOMONICI
Quasi tutti i test impiegati in medicina non sono patognomonici
TEST NON PATOGNOMONICO
Il risultato, positivo o negativo che sia, indica solo la probabilità di
essere veritiero
Nell’ambito dei risultati positivi → FALSI POSITIVI
Nell’ambito dei risultati negativi → FALSI NEGATIVI
TEST PATOGNOMONICO
Non genera mai falsi risultati positivi ma può fornire falsi risultati negativi
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TEST PATOGNOMONICI e
NON PATOGNOMONICI
Esempio:
Test sierologico per brucellosi bovina (Brucella abortus)
Falsi positivi:reazioni di cross-reattività (es. Yersinia)
Falsi negativi: se la bovina si è infettata recentemente e non ha
ancora prodotto Ab
Il test sierologico non è un test patognomonico
Esame colturale su latte
Risultato positivo certo
Risultato negativo dubbio: eliminazione intermittente delle
brucelle
L’isolamento colturale è un test patognomonico
QUINDI……
I test patognomonici sono migliori dei non-patognomonici?
Non c’è una risposta assoluta….
Test patognomonici:
Tempi più lunghi
Costi più elevati
Frequenza più elevata di falsi-negativi
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VALUTAZIONE PERFORMANCE
TEST DIAGNOSTICO
NON ESISTONO TEST INFALLIBILI
L’esito dà un’indicazione di probabilità, tranne nel
caso di un test patognomonico che non da falsi positivi
La performance del test dipende dalla quota di risultati falsi
positivi e falsi negativi ottenuti applicando il test ad una
popolazione che comprende sia animali sani che malati
PERFORMANCE TEST
a+b: test positivi
c+d: test negativi
ATTENZIONE!!!
Non tutti gli animali positivi sono malati → b: falsi-positivi
Non tutti gli animali negativi sono sani → c: falsi negativi
Quanti degli animali test negativi sono falsi-negativi?
Quanti degli animali test-positivi sono falsi positivi?
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PERFORMANCE TEST
PERFORMANCE TEST
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PERFORMANCE TEST
risultato del test
condizione reale del’animale
SENSIBILITA’
Capacità di identificare correttamente gli animali malati
In termini di probabilità è la probabilità di identificare come positivo
un animale malato
Proporzione degli animali malati che risultano positivi al test
10
SENSIBILITA’
SENSIBILITA’
proporzione tra i soggetti malati positivi al test
e gli animali malati (+ e – al test)
a/(a+c)
SENSIBILITA’
proporzione tra i soggetti malati positivi al test
e gli animali malati (+ e – al test)
a/(a+c)
VALORE COMPRESO TRA 0 e 1
Esprimibile come valore percentuale
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SPECIFICITA’
Capacità di identificare correttamente gli animali sani
In termini di probabilità è la probabilità di identificare come negativo
un animale sano
Proporzione degli animali sani che risultano negativi al test
SPECIFICITA’
SPECIFICITA’
proporzione tra i soggetti sani negativi al test
e gli animali sani (+ e – al test)
d/(b+d)
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SPECIFICITA’
Importante sugli screening di larga scala
Es.: nel 2002 in Italia effettuati 746.678 test per BSE → 34 positivi
test di specificità straordinariamente elevata
se test Sp = 99% → 1% bovini sani sarebbe risultato positivo
→ ben 7467 animali
SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’
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SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’
RICAPITOLANDO…..
Caratteristiche interne e proprie di un test diagnostico
Caratteristiche misurabili comprese tra 0 e 1: esprimono
valori di probabilità
Raramente entrambi uguali a 1
SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’
Esempio: diagnosi di morte
Il rigor mortis è un sintomo assolutamente specifico: nessun vivo
lo presenta.
Tuttavia non è presente nei morti da troppo poco o troppo tempo
EEG piatto è un sintomo assolutamente sensibile: tutti i morti
hanno l’EEG piatto!
Tuttavia l’EEG può presentarsi transitoriamente piatto in soggetti in
coma profondo
N.B. I TEST DIAGNOSTICI NON FORNISCONO CERTEZZE
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Perché un animale sano reagisce
come falso positivo?
Contatti con organismi antigenicamente simili
Cross-reazioni (Brucella/Yersinia; M.bovis/M.tuberculosis)
Immunità passiva e immunità vaccinale
Errori grossolani
Contaminazione del siero
Errori di identificazione
Errori di misurazione
Inadeguata standardizzazione della tecnica e/o degli antigeni
Altri errori umani
Perché un animale malato
reagisce come falso negativo?
Stato fisiologico
Diminuita produzione di Ab in conseguenza del parto, estro e
altri fattori stressanti
Stati di immunodepressione (da terapie, malattie….)
Mancata produzione di anticorpi
Fase iniziale dell’infezione
Errori di misurazione
Inadeguata standardizzazione della tecnica e/o degli antigeni
Altri errori umani
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Perché un animale malato
reagisce come falso negativo?
Mancata produzione di anticorpi → IMMUNOTOLLERANZA
Es.: BVD-MD; infezione intrauterina
l’evoluzione della malattia è in funzione del periodo di gestazione:
Fino a 125 gg di gravidanza: riassorbimento embrionale, aborto,
natimortalità e nascita di vitelli viremici, immunotolleranti e
persistentemente infetti (sieronegativi e viremici)
Da 125-150 gg di gravidanza: malformazioni facciali, atassia,
tremori, lesioni oculari e al SNC; vitelli sieropositivi e a volte
viremici
Oltre a 180 gg di gravidanza non provoca danni al feto che nasce
sieropositivo
Curva di produzione anticorpale
Inizio
produzione
titolo anticorpale
Soglia di
dosabilità
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tem po
infezione
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SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’
Test qualitativo fornisce risultati dicotomici: +/-; sì/no; sano/malato
Altri test (quantitativi) forniscono risultati classificabili in più categorie
Per questi si deve stabilire un valore soglia o cut-off
È il limite di separazione tra positività e negatività del test
A partire da quale valore di DO
giudichi infetto un animale?
Es: cut-off 1
non infetto < 1
infetto ≥ 1
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Es: cut-off 0,8
non infetto < 0,8
infetto ≥ 0,8
Il test riesce ad individuare TUTTI i soggetti
INFETTI, quindi raggiunge una sensibilità pari al
100%
Svantaggio: includi tra i positivi un numero elevato di
soggetti sani, quindi aumentano i FALSI POSITIVI
Es: cut-off 1,2
non infetto ≤ 1,2
infetto ≥ 1,2
Il test riesce ad individuare TUTTI i soggetti SANI, quindi
raggiunge una specificità pari al 100%
Svantaggio: includi tra i negativi un numero elevato di soggetti
infetti, quindi aumentano i FALSI NEGATIVI
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Quindi la sensibilità può essere aumentata ma
solo a spese della specificità e viceversa…..
La riduzione del valore di cut-off determina un aumento della Se
ma una riduzione della Sp
L’aumento del valore di cut-off determina una riduzione della Se
ma un aumento della Sp
In genere è meglio scegliere una situazione di compromesso,
con un valore di cut-off vicino a 1.0
SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’ INFERIORI A 100%
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PRIVILEGIARE
LA SENSIBILITA’ O LA SPECIFICITA’ ?
Considerazioni di ordine sanitario ed economico
Conseguenze dei falsi positivi e negativi
Un test sensibile va scelto quando le conseguenze di una mancata
diagnosi sono particolarmente gravi (es. donatori sangue)
Durante la diagnosi iniziale per escludere una o più malattie
(diagnosi differenziale)
Un test specifico è utile per confermare una diagnosi fatta con
altri mezzi
Se Pr della malattia elevata: va limitato il n° di falsi positivi per
considerazioni di tipo economico (un test specifico raramente è positivo in
assenza di malattia)
VALORE PREDITTIVO DI UN TEST
Sarà un positivo vero?
Test +
Sarà un positivo falso?
Possiamo rispondere a questa domanda in termini probabilistici,
conoscendo il VALORE PREDITTIVO POSITIVO (VPP)
20
Questo valore indica, infatti, la probabilità che un animale test-positivo
sia ammalato, e si calcola con la proporzione a/(a+b).
VALORE PREDITTIVO DI UN TEST
Sarà un negativo vero?
Test Sarà un negativo falso?
Possiamo rispondere a questa domanda in termini probabilistici,
conoscendo il VALORE PREDITTIVO NEGATIVO (VPN)
21
Questo valore indica, infatti, la probabilità che un animale test-negativo
sia sano, e si calcola con la proporzione d/(c+d).
VALORI PREDITTIVI
da cosa dipendono?
SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’ DEI TEST
PREVALENZA REALE DELL’INFEZIONE:
VPP
Diminuisce al diminuire della prevalenza
VPN
Aumenta al diminuire della prevalenza
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ZONA A → VPP = 90%
Su 100 bovini positivi al test, circa 90 sono veri positivi
e 10 falsi positivi
ZONA B → VPP = 55,6%
10% bovini verrebbero abbattuti erroneamente
44% bovini abbattuti erroneamente
ZONA C → VPP = 11%
Situazione inaccettabile!!
Aumento rapporto costi/benefici
89% bovini abbattuti erroneamente
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COME MIGLIORARE
IL VALORE PREDITTIVO
TEST MULTIPLI
2 TEST IN SUCCESSIONE
Si applica il 1° test sulla popolazione (test meno costoso)
Il 2° solo sui positivi (test più costoso )
I due test devono essere biologicamente indipendenti
Es. test sierologici che misurano differenti classi di Ab
Es. Piano Nazionale di Profilassi Brucellosi bovina
Test Rosa Bengala
FdC
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TEST MULTIPLI
2 TEST IN CONTEMPORANEA
Otteniamo le seguenti combinazioni di risultati:
Test A + e Test B +
Test A + e Test B –
Test A – e Test B +
Test A – e Test B –
Come interpretare i risultati?
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TEST MULTIPLI
INTERPRETAZIONE IN PARALLELO (OR)
un animale si considera infetto (o ammalato) quando è
positivo ad un test o all’altro o ad entrambi
Questa interpretazione aumenta la sensibilità ma diminuisce la
specificità → fornisce a ciascun animale una maggiore probabilità di
reagire positivamente
Aumento dei FALSI POSITIVI
Aumento del VPN a scapito del VPP
Diagnosi rapida (emergenze) oppure con pazienti che non potranno
essere esaminati un’altra volta
TEST MULTIPLI
INTERPRETAZIONE IN SERIE (AND)
L’animale è considerato positivo solo quando reagisce
positivamente ad entrambi i test
Si effettua quando sia richiesta una maggiore specificità
La specificità aumenta perché per ogni animale saggiato, la
probabilità di risultare positivo a entrambi i test è inferiore rispetto
a quanto avviene interpretando i risultati in parallelo
Facile che sfuggano alla diagnosi animali infetti
→ FALSI NEGATIVI
Aumento del VPP a scapito del VPN
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TEST MULTIPLI
INTERPRETAZIONE IN SERIE
Quando non è richiesta una diagnosi rapida
→ (animali ospedalizzati)
Fase finale dei piani di eradicazione
TEST MULTIPLI
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TEST MULTIPLI
Differenza tra gli approcci in contemporanea e successione:
Il numero di animali da saggiare in caso di test in successione è
senz’altro inferiore rispetto all’applicazione in contemporanea
Fattore molto importante se la popolazione da saggiare è numerosa
RIPRODUCIBILITA’
(PRECISIONE)
È quella caratteristica della misurazione per cui la stessa,
ripetuta più volte sullo stesso oggetto di misurazione,
fornisce lo stesso risultato;
Capacità di dare risultati sovrapponibili
Riproducibilità interna al laboratorio (INTRA-ASSAY)
Riproducibilità tra laboratori (INTER-ASSAY)
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ACCURATEZZA
(o VALIDITA’ o EFFICIENZA)
capacita’ del test di fornire un esito veritiero
Proporzione di individui (o di unità di studio, es. allevamenti,
gruppi
ecc)
identificati
correttamente
come
ammalati/non ammalati (o infetti/non infetti) da quel test
diagnostico
Dipende dalla sensibilità e specificità
ACCURATEZZA
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ACCURATEZZA
Poiché nella pratica il vero stato sanitario
degli animali non è noto, si misura il grado di
concordanza con un test di riferimento noto,
il golden test o gold standard test
ACCURATEZZA
Es.: 300 bovini sottoposti test tubercolina;
In seguito macellati ed eseguito esame anatomo-patologico
(gold standard)
(25+253) / 300 = 0,927
Concordanza tra i 2 test è pari al 92,7%
Quindi il test della tubercolina ha una «accuratezza» del 92,7%
rispetto all'esame anatomo-patologico.
Questo significa che il test della tubercolina identifica correttamente lo stato
di un animale (non importa se affetto da tubercolosi o no) nel 92,7% dei casi.
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ALTRE CARATTERISTICHE
Facilità di esecuzione (automatica o manuale)
Facilità del prelievo del materiale occorrente per la diagnosi
Costi (reagenti, attrezzature, personale ecc)
Possibilità di standardizzazione (dei metodi e dei risultati)
Prevalenza dell’infezione/malattia da diagnosticare
Altro (politica sanitaria, legislazione nazionale/internazionale ecc)
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