Esercitazioni di Genetica Agraria
Corso di Laurea in Biotecnologie
III° anno (A.A. 2004-2005)
1.
Estrazione DNA
2.
Quantificazione
3.
4.
Amplificazione PCR
Clonaggio e screening dei trasformanti
Titolare del corso:
Prof. Sergio Lanteri
011/670-8806
[email protected]
Esercitazioni condotte sotto la supervisione di:
Dott. Alberto Acquadro
011/670-8813
[email protected]
Dott. Lorenzo Barchi
011/670-8809
[email protected]
MATERIALE DI RIFERIMENTO DISPONIBILE ON LINE:
http://www.personalweb.unito.it/alberto.acquadro/EsercitazioniIIIannobiotech2004-2005(Acquadro).pdf
NOTA:
su google cercare alberto acquadro (si ritrova più in fretta)
5. 1. ESTRAZIONE DNA GENOMICO
Estrazione DNA (Peperone; modificato per estrazione ridotta)
9 Macerare 0,5 (min 0,3 grammi )di materiale vegetale in azoto liquido.
aggiungere 800 µl di Urea grinding buffer (con o senza mercaptoetanolo)
direttamente nel mortaio
9Trasferire in eppendorf da
Fenolo:cloroformio:isoamilico
2
ml
aggiungere
subito
400
µl
di
9 Mescolare ed agitare per 10 min RT
I
9 Centrifugare a 5000 rpm per 10 min RT
Trasferire in un nuova eppendorf 2 ml
9 Aggiungere 42 µl di NH4Oac
aggiungere 800 µl di isopropanolo
mescolare invertendo i tubi
9 Prelevare il DNA con una pipetta pasteur ad uncino e lavare in EtOH 70%
(eliminare l’eccesso di etanolo passando il DNA su un fazzoletto di carta)
Trasferire in un eppendorf da 1,5 ml con 800 µl di TE 0,1X
Fine 1° fase
9 Aggiungere 1 µl di RNAse (1µg/µl) per ½ 1 ora
9 Aggiungere 40 µl di NaOAc + 250 µl di fenolo:cloroformio: alcol isoamilico
9 Mescolare ed agitare 10 min rt
II
9 Centrifugare a 5000 rpm per 10 min rt
trasferire la fase acquosa in eppendorf da 2 ml.
9 Aggiungere 1 ml di EtOH 95% e invertire delicatamente i tubi per ripetute
volte. Uncinare il DNA e trasferirlo in un nuovo tubo contenente 1 ml EtOH
70% (è possibile ripetere questo trasferimento più volte).
Fine 2° fase
9 Trasferire il DNA in un tubo eppendorf da 1,5 ml e lasciare asciugare all’aria
9 Risospendere in circa 30-50 µl di TE 0,1X (variare quantità a seconda del
DNA isolato).
2. QUANTIFICAZIONE
a) Fluorimetro:
- Accendere lo strumento ed attendere 15 minuti prima di iniziare la quantificazione.
- Preparare la Capillary Assay Solution:
A (for low range DNA
B (for high range DNA
assay)
assay)
Hoechst 33258 1 mg/ml
10 µl
100µl
TNE 10X
10 ml
10 ml
H2O
90 ml
90 ml
Mantenere a T° ambiente. Prepararla in giornata.
-Azzerare lo strumento:
- Aggiungere 2 ml della “Assay solution” nella cuvette.
- Inserire la cuvette nell’apposito spazio, chiudere il coperchio e premere
“ZERO”.
- Apparirà lo “0” sul display, a questo punto, rimuovere la cuvette.
- Calibrare lo strumento:
- Aggiungere 2 µl di calf thymus DNA standard (precedentemente preparato nella
concentrazione desiderata), nella cuvette che già contiene i 2 ml di “Assay
solution”.
- Mescolare pipettando nella cuvette.
- Inserire la cuvette, chiudere il coperchio e premere “CALIB”.
- Quando apparirà la concentrazione dello standard (es: 1000 ng/ml per high
range DNA assay o 100 ng/ml per low range DNA assay), premere “ENTER”.
- Quantificare la fluorescenza di un campione:
- Rimuovere la cuvette, lavarla ed asciugarla.
- Aggiungere 2 ml di “Assay solution” e inserire la cuvette nell’apposito spazio,
chiudere il coperchio e premere “ZERO”.
- Rimuovere la cuvette.
- Aggiungere 2 µl del DNA del campione da quantificare nella cuvette che già
contiene i 2 ml di “Assay solution”.
- Mescolare pipettando nella cuvette.
-
Inserire la cuvette chiudere il coperchio e leggere la concentrazione sul
display espressa in ng/ul.
Hoechst 33258 stock dye solution (1mg/ml)
Hoechst 33258
10 mg
H20
10 ml
Usare guanti e maschera. Conservare a 4°C per 6 mesi al buio.
TNE 10X
Tris-base
EDTA
NaCl
pH
2d H2O
Concentrazione
0.1 M
10 mM
2M
7.4
X 100 ml
1.21 g
0.37 g
11.68 g
Fino a 100 ml
Sciogliere in 80 ml H20 e portare a Ph 7.4 con HCl concentrato
Conservare a 4°C per 3 mesi.
b) Elettroforesi su gel di agarosio:
- Preparare un gel allo 0.8 %
- Mescolare 1 ul di campione + 5 ul di Blu x agarosio e caricare nei pozzetti con la
micropipetta.
- Correre a 70- 100 V finché il blu ha percorso 3-4 cm e valutare agli UV la qualità
del DNA
SOLUZIONI per l’estrazione di DNA genomico
Tampone di lisi CTAB 2%:
CTAB
Tris HCl (1 M, pH 8)
EDTA (0.5 M, pH 8)
NaCl
β-mercaptoetanolo
H2O
Concentrazione
2%
0.1 M
20 mM
1.4 M
0.2 %
x 100 ml
2 gr
10 ml
4 ml
8.18 gr
0.2 ml
fino a 100 ml
3M NaOAc (per 20 ml)
4.92 gr in 20 ml H20, pH 6 (porto a pH usando acido acetico).
5M NH4OAc (per 20 ml)
7.71 gr in 20 ml H20
3. AMPLIFICAZIONE PCR
- Diluire il DNA genomico alla concentrazione di 25 ng/ul
- Preparare la mix (n° campioni + 1 ogni 10 campioni):
[ ] iniziale
[ ] finale
10 X
25 mM
10 mM
10 uM
(10 pmol/ul)
5U/ul
5 ng/ul
a volume
finale
1X
2 mM
200 uM
0.5 uM
10 pmoles
1U
25 ng
H2O
PCR Reaction buffer
Magnesium chloride
DNTP
(NH4 buffer)
Primer
Taq polymerase
DNA
TOTALE
ul x1
campione
ul per …
campioni
20
- Aliquotare la mix in eppendorf da 0.2 ml
- Aggiungere 5 ul di DNA genomico in ciascuna eppendorf
- PCR: programma amplificazione:
Cicli
1
45
1
T°
92°
92°
36°
72°
72 °
Durata
3’
1’
1’
2’
10’
- Aggiungere Blu x Agarosio (5 ul in 20 ul)
- Correre su gel di agarosio 1,5 % a 65 V per 4 h
Primer
Concentrazione stock
100 uM (100 pmol/ul)
Concentrazione finale
10 uM (10pmol/ul)
ul stock
10
+ TE 0.1X
90 ul
Preparare le soluzioni stock (100 uM ovvero 100 pmol/ul) in TE 0,1 e
conservarle a –20° C
Le successive diluizioni vanno conservate a 4° C e rifatte ogni 20-30 giorni.
PCR reaction buffer
Utilizzare sempre il buffer fornito con la Taq Polimerasi che si sta utilizzando
Conservarlo a – 20° C
MgCl2
Viene, in genere venduto insieme alla TAQ e nel caso della PROMEGA alla
concentrazione di 25 mM (stock solution)
Si utilizza alla concentrazione finale di 0,5-4 mM
Conservare a – 20° C. e vortexare prima di usare (il magnesio tende a
precipitare). I dNTPs legano il magnesio; se si varia la concentrazione di
dNTPs, la concentrazione di Mg++ va compensata.
Eccesso di Mg++: accumulo di prodotti aspecifici,
Carenza di Mg++: riduzione della resa (il Mg++ e' ilcofattore della Taq
Polimerasi).
DNTPs / Taq
Vengono, in genere venduti singolarmente (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) alla
concentrazione 100mM (stock solution)
Si diluiscono alla concentrazione di 10mM (working solution)
Conservare a – 20° C
H2O
Utilizzare acqua MilliQ autoclavata e monodose
SOLUZIONI PER GEL E LOADING BUFFER E PRIMER
Blu Agarosio
Blu bromofenolo
Saccarosio
EDTA 0.5 M pH 8
SDS
H20
Concentrazione
0.05% w/v
40% w/v
0.1 M
0.5% w/v
X 10 ml
5 mg
4g
2 ml
50 mg
Fino a 10 ml
Conservare le aliquote a 4°
TE 10X
Tris-HCl 1 M pH 8
EDTA 0.5 M pH 8
2d H2O
Concentrazione
0.1 M
10 mM
X 10 ml
1 ml
200 ul
Fino a 10 ml
Conservare le aliquote a –20°
TBE
50 X
540 g
275 g
200 ml
Fino a 1L
Tris-base
Acido Borico
EDTA 0.5 M
2d H2O
10 X
108 g
55 g
40 ml
Fino a 1L
EDTA 0.5 M pH 8
EDTA
NaOH
2d H2O
pH
Aggiungere 800 ml di H2O, controllare il pH, portare a volume
186.1 g
20 g (circa)
Fino a 1L
8
4. ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
TBE 0.5 X
Agarosio (g)
(Bromuro di
etidio)
TBE 0.5 X
nella cella
2%
1.5 %
0.8 %
0.6
0.45
0.24
(0.3 ul)
250 ml
150 ml
3
2.25
1.2
(1.5 ul)
2.5 l
200 ml
4
3
1.6
(2 ul)
2.5 l
30 ml
- Sciogliere l’ agarosio in TBE 0.5 X nel microonde per almeno 5 minuti.
- Bloccare il gel tray, controllare che sia in bolla.
- (Aggiungere il bromuro di etidio direttamente nel gel)
- Versare l’agarosio nello stampo, eliminando eventuali bolle ed inserire il pettine
- Lasciar raffreddare e solidificare per 20-40 minuti.
- Rimuovere il gel tray e posizionarlo nella cella elettroforetica e ricoprire con TBE
0,5X
- Rimuovere il pettine.
- Caricare il gel: inserendo nei pozzetti i diversi campioni
- Caricare anche 1µl di DNA Ladder + 5 ul Blu x Agarosio
- Iniziare la corsa
- Osservare agli U.V. ed acquisire l'immagine
4. CLONAGGIO
(Ligasi e trasformazione)
Enzimi di restrizione
Sono enzimi avente attività endonucleasica specifica e generalmente sono isolati da
batteri che li utilizzano per difendersi dai loro patogeni: batteriofagi.
Gli enzimi di restrizione sono strumenti essenziali per la biologia molecolare e
permettono di “tagliare” piu o meno a piacimento il DNA target. Nello schema sono
evidenziati alcuni tipi di sequenze riconosciute e quindi tagliate da le piu usate
endonucleasi di restrizione.
Reazione di Ligazione
La reazione di ligazione, ad opera della T4 DNA ligasi (estratta dal batteriofago T4)
catalizza la formazione del legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti. Questa
reazione avviene solamente se uno dei due nucleotidi terminali porta un residuo
fosfato in 5´ e l’altro un residuo OH al 3’.
La reazione di ligazione (“ligation”) puo essere utilizzata per inserire molecole
desiderate (ligation) in vettori (plasmidici, cosmidici, fagici, YAC, BAC, PAC etc), al
fine di creare molecole di “DNA ricombinante. La reazione di ligazione puo essere
utilizzata anche per aggiungere dei linker (in genere oligonucleotidici) all’estremità di
frammenti di DNA (es.: AFLP; Vos et al. 1995, Nucleic Acid Research).
Ci concentreremo sulla ligazione in plasmide. Il termine “clonaggio” verrà usato
quando ci si riferisce alla reazione di ligazione seguita dalla trasformazione batterica,
al fine di clonare un particolare frammento di DNA di interesse. Cio applicheremo la
tecnologia del DNA ricombinante e ci riferiremo ad essa semplicemente con il termine
clonaggio (…di una banda, di un gene, di un trascritto etc.)
Esistono fondamentalmente 4 tipi di clonaggio:
-il clonaggio blunt
-il clonaggio sticky
-il clonaggio TA
-il clonaggio TOPO
Clonaggio “blunt”
Clonaggio “sticky”
Filling-in e Recessing-out
Non è sempre possibile clonare con enzimi di restrizione sticky o il sito dell’enzima non
è presente sul plasmide e quindi bisogna modificare l’inserto utilizzando procedure di
“filling-in” o di “reccessing”.
Oggi è comunemente usato, per la sua semplicità e velocità il “TA cloning” con cui è
possibile clonare frammenti di PCR o frammenti blunt con una più alta efficienza.
Clonaggio TA
Il TA cloning rappresenta un veloce sistema per clonare prodotti di PCR in un vettore
plasmidico, senza effettuare una purificazione.
Questo vettore puo essere successivamente utilizzato per studi di trascrizione (in vivo
o in vitro ) grazie alla presenza dei promotori T7 e Sp6 (prodotti senso o anti-senso ).
Vantaggi dai clonaggi tradizionali:
• Non sono necessarie modificazioni enzimatiche dei prodotti di PCR
• Non sono necessary primer con siti di restrizione
• trascrizione possible da entrambi i lati dell’inserto
Funzionamento:
Il Clonaggio TA utilizza la capacità, che alcune TAQ polimerasi hanno, di aggiungere
in maniera a-specifica una singola desossi-adenosina (A) al 3´ terminale di un
prodotto di PCR. Il vettore è fornito linearizzato con con una singola desossitimidina
(T) alle estremità 3´. I prodotti di PCR possono essere ligati con alta efficienza.
Taq utilizzabili e possibilità di A-tailing:
Non tutte le TAQ aggiungono A terminali, e alcune hanno attività 3´ to 5´
esonucleasica (Vent™ and Pfu).
Ad ogni modo è possibil fare il clonaggio TA sia su frammenti ottenuti con Vent e Pfu
che da frammenti blunt aggiungendo una 3´ A-overhang al termine della PCR
incubando con TAQ (non Vent™ and Pfu). In genere viene utilizzato un protocollo
detto di “tailing” (vedi avanti).
Materiale necessario:
• microcentrifuga/• termociclatore/• bagnetto a 14°C /• bagnetto a 42°C/• bagnetto a
37°C /• contenitore con ghiaccio
Reagenti e terreni necessari
• Taq DNA Polymerase
• TE Buffer
• Luria-Bertani (LB) medium and agar
• 40 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) in DMF
• 250 mg/ml ampicillina
Le cellule competenti utilizzabili possono essere di vario tipo (in questo caso: INVαF´)
e devono essere compatibili con il ceppo batterico utilizzato. Le cellule possono essere
acquistate da ditte specializzate (es.: Invitrogen, Fermentas, Stratagene, Promega
etc) o possono essere prodotte partendo da cellule non piu competenti a seguito di
trattamento chimico (Inoue et al., 1990; Gene)
Schema semplificato del lavoro
1. Produzione del frammento di PCR da clonare
2. Ligazione nel T-vector sen purificare.
3. trasformazione
4. piastratura e crescita ON delle colonie
5. selezione blu/bianco e tramite PCR o miniprep delle colonie positive
6. sequenziamento del clone (solo inserto)
NOTA: è preferibile utilizzare prodotti di PCR “freschi” (max un giorno) perche la 3´ Aoverhang possono essere degradate e ridurre l’efficienza di ligazione.
La formula sottostante serve per stimare quanto prodotto di PCR è necessario
utilizzando 50 ng (20 fmoles) di vettore pCR®II:
X ng PCR = (Y bp PCR product)(50 ng pCR®II vector)
————————————————————————
dimensione del vettore (pCR®II vector: ~3900bp)
dove X ng è la quantità di prodotti di PCR di y bp che dovrà essere ligato in una
proporzione 1:1 (vector:insert) Si puo usare anche il rapporto 1:3.
Mix per una reazione di LIGAZIONE (comunemente chiamata “LIGASI”)
Prodotto di PCR
… µl
10X Ligation Buffer
1 µl
pCR®II vector (25 ng/µl)
2 µl
Acqua sterile fino a volume finale
…µl
T4 DNA Ligase (4.0 Weiss units)
1 µl
Totale
10 µl
Incubare la reazione di ligazione 14°C per un minimo di 4 ore( preferibilmente ON).
Al termine della ligazione, conservare a -20°C oppure procedere alla trasformazione.
NOTE tecniche:
In genere 0.5 to 1.0 µl di una reazione commune di PCR con un inserto medio di 400700 bp) da il giusto rapporto 1:1 (vector:insert).
E’ meglio non utilizzare piu di 2-3 µl di PCR perchè I sali potrebbero inibire la T4 DNA
Ligase. Temperature superiori o inferiori ai 14°C potrebbero ridurre l’efficienza di
ligazione.
Bibliografia
Clark, J. M. (1988) Nuc. Acids Res.16:9677-9686.
Gahm, S. J. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.88:10267-10271.
Mead, D. et al. (1991) Bio/Technology9:657-663.
Trasformazione
At this point you should have a ligation reaction that contains your insert ligated into pCR®II, and you
are ready to transform into One Shot® cells (INVαF´ or TOP10F´).
INVαF´ does not express the lac repressor; therefore, your product may express from pCR®II in the
absence of IPTG because of the presence of the lac promoter. IPTG will not have any affect on INVαF´.
TOP10F´ does express the lac repressor (lacIq), which will repress transcription from the lac promoter.
To perform blue-white screening for inserts, you must add IPTG to your plates to express LacZα.
Using Competent Cells • Competent cells are sensitive to temperature and mechanical lysis caused by
pipetting. Be extremely gentle when working with competent cells.
• Start transformation immediately after thawing the cells on ice. Mix any additions by stirring gently with
a pipette tip. Keep the cells as cold as possible during all steps.
• Use sterile technique when handling and plating your transformations.
Preliminary Steps
1. Equilibrate a water bath to 42°C.
2. Bring the SOC medium to room temperature.
Preparation of plates for transformation (use two plates for each ligation/transformation):
3. If you are using INVαF´ cells, take LB plates containing 50 µg/ml of either kanamycin or ampicillin and
equilibrate at 37°C for 30 minutes. Spread each plate with 40 µl of 40 mg/ml X-Gal. Let the liquid soak
into the plates. Plates may also be made ahead of time. See Recipes, page 18.
If you are using TOP10F´ cells, take LB plates containing antibiotic and equilibrate at 37°C for 30
minutes. Spread 40 µl each of 100 mM IPTG and 40 mg/ml X-Gal onto the plates. Let the liquid soak into
the plates. Plates may also be made ahead of time. See Recipes, page 18.
Protocollo di trasformazione:
Use the instructions below for the best results with TA Cloning® Dual Promoter. Note that TOP10F´ cells
have an efficiency of 1 x 109 cfu/µg DNA while INVαF´ have an efficiency of 1 x 108 cfu/µg DNA.
1. Centrifuge the vials containing the ligation reactions briefly and place them on ice.
2. Thaw on ice one 50 µl vial of frozen One Shot® competent cells (TOP10F´ or INVαF´) for each
ligation/transformation.
3. Pipette 2 µl of each ligation reaction directly into the competent cells and mix by stirring gently with
the pipette tip.
4. Incubate the vials on ice for 30 minutes. Store the remaining ligation mixtures at -20°C.
5. Heat shock for exactly 30 seconds in the 42°C water bath. Do not mix or shake. Remove the vials
from the 42°C water bath and place on ice.
6. Add 250 µl of SOC medium (at room temperature) to each tube.
7. Shake the vials horizontally at 37°C for 1 hour at 225 rpm in a shaking incubator.
8. Spread 10 µl to 200 µl from each transformation vial on separate, labeled LB agar plates containing XGal and 50 µg/ml of either kanamycin or ampicillin. Be sure to also include IPTG if you are using TOP10F´
cells. We recommend plating 10-50 µl for TOP10F´ cells and 50-200 µl for INVαF´ cells.
Note: Be sure to plate two different volumes to ensure that at least one plate has well-spaced colonies.
For plating small volumes, add 20 µl of SOC to allow even spreading.
9. Make sure the liquid is absorbed, then invert the plates and place them in a 37°C incubator for at least
18 hours. Plates should then be shifted to +4°C for 2-3 hours to allow for proper color development.
Transformed INVαF´ cells may appear very small after overnight growth when compared to other E. coli
strains. The transformants may need to grow an additional 2-3 more hours before selecting colonies for
analysis.
Screening delle colonie
Results of Transformation For an insert size of 400-700 bp, you should obtain 50-200
colonies per plate depending on the volume plated and of these, approximately 80%
should be white on X-Gal plates (INVαF´) or X-Gal/IPTG plates (TOP10F´). Note that
ligation efficiency depends on insert size. As insert size increases, the efficiency will
decrease.
Prima selezione
Blu/bianco
Seconda selezione
AMPLIFICAZIONE PCR
- Diluire il DNA genomico alla concentrazione di 40-60 ng/ul
- Preparare la mix (n° campioni + 1 ogni 12 campioni):
[ ] iniziale
[ ] finale
10 X
25 mM
10 mM
10 uM
(10 pmol/ul)
10 uM
(10 pmol/ul)
5U/ul
pick
a volume
finale
1X
2 mM
200 uM
0.5 uM
10 pmoles
0.5 uM
10 pmoles
1U
pick
H2O
PCR Reaction buffer
Magnesium cloride
DNTP
(NH4 buffer)
Primer M13 For
Primer M13 For
Taq polymerase
DNA
TOTALE
20
- Aliquotare la mix in eppendorf da 0.2 ml
- Aggiungere 5 ul di DNA genomico in ciascuna eppendorf
- PCR: programma amplificazione:
Cicli
1
25
1
T°
94°
94°
55°
72°
72 °
- Aggiungere Blu x Agarosio (5 ul in 20 ul)
- Correre su gel di agarosio 1,5 % a 65 V per 4 h
Selezioni usate “storicamente”
Ibridizzazione o miniprep
ul x1
campione
Durata
3’
30’’
30’’
1’
5’
ul per …
campioni
VARIE
A-Tailing
Addition of 3´ A-Overhangs Post-Amplification
Introduction Direct cloning of DNA amplified by Vent™ or Pfu polymerases into pCR®II is often difficult due to very low
cloning efficiencies. These low efficiencies are caused by the 3´ to 5´ exonuclease proofreading activity of Vent™ and
Pfu polymerases that remove the 3´ A-overhangs necessary for TA Cloning®. Invitrogen has developed a simple
method to clone these blunt-ended fragments.
Before Starting You will need the following items:
• Taq polymerase
• A heat block equilibrated to 72°C
• Phenol-chloroform
• 3 M sodium acetate
• 100% ethanol
• 80% ethanol
• TE buffer
Procedure 1. After amplification with Vent™ or Pfu polymerase, place vials on ice and add 0.7-1 unit of Taq polymerase
per tube. Mix well. It is not necessary to change the buffer.
2. Incubate at 72°C for 8-10 minutes (do not cycle).
3. Extract immediately with an equal volume of phenol-chloroform.
4. Add 1/10 volume of 3 M sodium acetate and 2X volume of 100% ethanol.
5. Centrifuge at maximum speed for 5 minutes at room temperature to precipitate the DNA.
6. Remove the ethanol, rinse the pellet with 80% ethanol, and allow to air dry.
7. Resuspend the pellet in TE buffer to the starting volume of the DNA amplification reaction. The DNA amplification
product is now ready for ligation into pCR®II.
Soluzioni e terreni
LB (Luria-Bertani)
1.0% Tryptone
0.5% Yeast Extract
1.0% NaCl
pH 7.0
1. For 1 liter, dissolve 10 g bacto-tryptone, 5 g bacto-yeast extract, and 10 g NaCl in 950 ml deionized water.
2. Adjust the pH of the solution to 7.0 with NaOH and bring the volume up to 1 liter.
3. Autoclave on liquid cycle for 20 minutes at 15 lb./sq. inch. Allow solution to cool to 55°C and add antibiotic if
needed.
4. Store at room temperature or at +4°C.
LB agar plates
1. Prepare LB medium as above, but add 15 g/L agar before autoclaving.
2. Autoclave on liquid cycle for 20 minutes at 15 lb./sq. in.
3. After autoclaving, cool to ~55°C, add antibiotic (50 µg/ml of either ampicillin or kanamycin), and pour into 10 cm
plates.
4. Let harden, then invert and store at +4°C.
X-Gal Stock Solution
To make a 40 mg/ml stock solution, dissolve 400 mg X-Gal in 10 ml dimethylformamide.
2. Protect from light by storing in a brown bottle at -20°C.
3. To add to previously made agar plates, pipette 40 µl of the 40 mg/ml stock solution onto the plate, spread evenly,
and let dry 15 minutes. Protect plates from light.
X-Gal/IPTG LB Plates
1. Warm an LB plate with the appropriate antibiotic at 37°C for 10 minutes.
2. Pipet 40 µl of the X-Gal stock solution and 40 µl of the IPTG stock solution onto the center of the plate and spread
evenly with a sterile spreader. Allow the solution to diffuse into the plate by incubating at 37°C for 20-30 minutes.
Plates are now ready to use.
General Reference for PCR Technology
Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., and White, T. J. (eds) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications. Academic Press, Inc., San Diego, CA.
General Reference for Molecular Biology Techniques
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., eds (1990) Current
Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York.
General Reference for TA Cloning®
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