CORSO INTEGRATO DI GENETICA E
BIOLOGIA MOLECOLARE
AA 2015/16
Prof Alberto Turco
Lezioni 47 e 48
2.12.15
Diagnosi e Screening
Prenatali e Preimpianto
Diagnostica Prenatale e Screening Prenatale
Il termine Diagnosi Prenatale (DPN) tradizionalmente è inteso
ad indicare procedure invasive di indagine per un feto a rischio
elevato per una malattia genetica…
Risultato: «yes or no» Scopo: scelte informate sulla gestione del rischio
(inizio 2015: >5000 malattie genetiche, >3500geni)
Il termine Screening Prenatale indica delle indagini non invasive
per certe condizioni (anomalie congenite, cromosomopatie, difetti del
tubo neurale) per gravidanze a rischio non aumentato…
Risultato: probabilistico
Scopo: identificare gravidanze ad «alto» rischio su cui effettuare DPN
Date però la rapida espansione tecnologica e la maggior sicurezza delle procedure
invasive -> amnio, CVS, CMA offerti come «screening tests» per tutte le
gravidanze… forse in futuro: FWGS (Fetal Whole Genome Sequencing)…
Diagnosi prenatale (DP): peculiarità
Tempi ristretti
Unico esame
Spesso difficile prevedere le conseguenze
relative al fenotipo clinico (correlazione genotipo/fenotipo)
Limite: diagnosi fatta in virtuale assenza del «paziente»
Il feto è visibile solo indirettamente (ecograficamente), e
non è possibile visitarlo né valutarne il grado di intelligenza
Necessario sempre un consenso informato
TEST GENETICI PRECONCEZIONALI E PRENATALI
Sperm selection. Citometria a flusso. X- o Y-bearing sperm (es.selezione spermatozoi)
PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis). Malattie monogeniche, cromosomiche. HLA-typing.
PGS (Preimplantation Genetic Screening). Screening di aberrazioni cromosomiche (es infertilità).
Villocentesi (CVS,Chorionic Villus Sampling). DP invasiva,11-13a sg. Villi coriali (trofoblasto).
«Rescue Karyotyping». Tessuti archiviati dopo IVG (ricerca anomalie cromosomiche).
NIPT (Non Invasive Prenatal Testing). cffDNA (cell-free fetal DNA) Sangue materno.
Test Combinato. Ecografia + test biochimico su sangue materno.
Amniocentesi. 15-17a sg
Amniociti (cc.sfaldamento fetali)
Funicolocentesi (Cordocentesi). Sangue fetale. >18° sg. Rischio bradicardia fetale. Non routine.
Fetoscopia. Cute fetale. Non routine.
(R.Lewis, 11th Ed., 2015)
DIAGNOSI PRENATALE
DP NON INVASIVA (NIPD)
Ecografia (circa 300 malformazioni, vitalità fetale, gemellarità,crescita,
posizione placenta, volume LA, test combinato-vd sotto)
RMN (malformazioni cerebrali)
Sangue materno:
Test Combinato (duotest + translucenza nucale [NT])
Cellule fetali (rarissime nel s.m., persistenza x anni)
DNA fetale (ccffDNA*, NIPT=NonInvasive Prenatal Testing)
* = circulating cell-free fetal DNA
DP INVASIVA (IPD) (rischio di anomalia > rischio procedura)
Villocentesi (CVS) (11-12 s.g., 1-2% rischio aborto)
Amniocentesi (16-18 s.g., 0.5-1% rischio aborto)
Cordocentesi o Funicolocentesi (PUBS=Percutaneous
Umbilical Blood Sampling) (>18s.g, 3% rischio aborto)
Fetoscopia (18-20 s.g, rischio 3%, cute, fegato, ostruzione vie
urinarie, es sequenza di Potter)
PGD/PGS – Diagnosi/Screening Genetico Preimpianto vd oltre
DP non invasiva: ecografia
US = Ultrasound (Eco)
3D US
Ecografia ostetrica: le mani
Normalità
H-OS (S.Holt-Oram)
Ecografia: canale spinale e del tubo neurale
Feto normale – 24w
DTN (NTD)
(Thompson & Thompson, 2016)
Condizioni fetali che possono essere diagnosticate
(o escluse) con ecografia
Translucenza nucale (test combinato di screening)
DP Non Invasiva: screening su sangue materno + ecografia.
Test combinato: “combina” diversi parametri: età, ecografia e analisi biochimica
su sangue materno. Il risultato è probabilistico: un valore numerico di RISCHIO
Screening biochimico prenatale su sangue materno
(AFP: Alfa feto Proteina)
Cause di aumento di AFP nel sangue materno
Cause di aumentati livelli di AFP nel LA
(oltre che i DTN)
Screening Prenatali del I e del II Trimestre
(Trisomie e Difetti del Tubo Neurale)
(Thompson & Thompson, 2016)
Screening Prenatale Non Invasivo: la novità….
NIPS (Non Invasive Prenatal Screening)
(NIPT …..Testing)
ccffDNA = Circulating Cell Free Fetal DNA
ccffDNA
NIPS/NIPT con ccffDNA
NIPS (Non Invasive Prenatal Screening) mediante NGS di cffDNA
(Thompson & Thompson, 2016)
NIPT LINEE GUIDA (2012)
…..In sintesi
Screening Prenatali per Trisomia 21:
Sensibilità e Specificità
DP Invasiva
AMNIOCENTESI
- 15/17 s.g. settimane di gestazione
- immunoprofilassi anti Rh (D) per donne Rh –
- 10/20 ml: urina + cellule fetali
- rischio di aborto: < 1% (0.5-0.8%)
- necessaria coltura cellulare (2-3 settimane)
- non rischio di “mosaicismo placentare” come CVS
VILLOCENTESI
(CVS = Chorionic Villus Sampling)
- dopo 11a s.g. (no <9-10sg)
- immunoprofilassi antiD per femmine Rh –
- 1-2% mosaicismo (CPM=Confined Placental Mosaicism)
- precocità e rapidità diagnosi: analisi su DNA e
citogenetica (mitosi spontanee)
- evitare contaminazione materna
- rischio di aborto: circa 1%
Mosaicismi in Diagnosi Prenatale (CVS)
A. M. generalizzato fetoplacentare
B. CPM Confined Placental Mosaicism
C. Completa discordanza fetoplacentare
D. Mosaicismo solo embionale
(Thompson & Thompson, 2016)
Diagnosi prenatale
invasiva
per doppio rischio
mendeliano
(amniocentesi,
fetoscopia)
Biopsia cutanea - fetoscopia
Linkage analysis
DP - Conclusioni
Di fronte ad anomalia fetale identificata con US si dovrebbe eseguire
un CMA (Chromosomal MicroArray) piuttosto che un cariotipo standard
(ACOG USA e Canada)
Tutte le donne che si sottopongono a DPI dovrebbero avere anche l’opzione di
un CMA
Problema attuale: interpretazione delle VUS (Variants of Unknown
Significance) (vd CNVs in assenza o in presenza di anomalia ecografica)
Visto il ritmo degli avanzamenti scientifici e tecnologici in ambito di analisi
genomiche, è probabile che il CMA sostituirà in cariotipo fetale
FGA (Fetal Genome Analysis) mediante WES e/o WGS diventerà il gold standard dei
test di screening prenatale? (vd dilemmi etici: dg presintomatica di m.dell’adulto,
discriminazione/stigmatizzazione, danno al rapporto genitore/figlio, CG per
dati non interpretabili [VUS])
Cleavage stage human (pre)embryos (ART)
(Carlson, 2014)
PGD
Fasi della PGD
PGD. Trasferimento dei pre-embrioni non affetti
Micromanipolatore (FIV, ICSI, PGD)
PGD
1. Biopsia morula (blastomero)
(1-2 cellule, 6-8cc, +3gg)
2. Biopsia blastocisti
(trofoectoderma, 100cc, +5gg)
3. Analisi del globulo polare
PGD: Biopsia della morula (blastomerica) o della blastocisti
PGD – Biopsia blastomerica
Morula on a pin tip
ICSI = Intra Cytoplasmic Sperm Injection
Indicazioni: infertilità maschile (oligo/astenospermia),
PGD.
NB: leggero aumento di anomalie cromosomiche
e da imprinting nei figli ICSI.
FISH – Based Single-Cell
Preimplantation Sexing
(Severe X-linked conditions, eg: Alport syndrome))
XX (green)
XY (green, red)
PGS = Preimplantation Genetic Screening (aneuploidies)
5-color FISH – Single Interphase Blastomere Nucleus
aCGH PGD
Consenso Informato e Informativa – FIV, PGD, PGS
Argomenti a favore della PGD
Prevenzione di GRAVI malattie genetiche/cromosomiche
Evitare l’aborto (IVG) in coppie a rischio
Argomenti contro la PGD
Selezione embrioni umani non è etica
Status morale dell’embrione
Aspetti «bioetici» della PGD
PGD HLA Matching – Tipizzazione HLA (per trapianto)
La undicenne Anna Fitzgerald è nata grazie alla fertilizzazione in vitro, con le caratteristiche genetiche
necessarie per poter salvare la vita alla sorella maggiore Kate, malata da tempo di leucemia.
Oltre ad assistere al calvario della sorella, Anna si è sottoposta a numerose analisi, trasfusioni e iniezioni,
il tutto per salvare Kate. Ma quando la sorella necessità di un rene, Anna si rifiuta, stanca di essere usata.
Sentendosi messa al mondo al solo scopo di salvare la sorella, Anna si rivolge ad un avvocato e fa
causa alla sua famiglia per avere l'emancipazione medica e il pieno controllo del proprio corpo.
Preimplantation HLA Testing (PHT)
PGD, bioetica, mass media, divulgazione scientifica
La legge 40/2004 e la valanga di sentenze che l’hanno
smantellata….
Riflessioni bioetiche in ambito di riproduzione umana…..