Corso di genomica
a.a.2011-2012
Corso di laurea magistrale di Biotecnologia industriale
e Bioinformatica
Lezione in aula 6a martedì ore 14.00-16.00
giovedì ore 13.00-15.00
p.s. uso bianco e nero perché si vede meglio ed
eventualmente per passare al cartaceo
Di cosa si sta parlando?
Esiste una definizione di genomica?
abbiamo molte informazioni e
dobbiamo organizzarle in maniera
sistematica
Il problema della catalogazione dell’informazione forse
già è stato posto dalle prime biblioteche, chissà i
bibliotecari di Alessandria come si erano organizzati
uso dell’informazione
col sequenziamento c’è stata l’illusione di poter sapere
veramente tutto dei genomi e dell’informazione genetica,
ma è nata la genomica perchè si capiva che il problema
era più complesso
È vero che l’informazione c’è tutta ma va decodificata.
Ci sono altri codici genetici?
definizione
Non si può dare una definizione, però si può catalogare
cosa fare rientrare in questa materia
Si può anche dire cosa non fare rientrare in questa materia
per evitare confusioni
Se parliamo di genomica non possiamo parlare di faccende
che non riguardino l’organizzazione del genoma.
Solo indirettamente possiamo vedere la ricaduta sulla
epi-genetica e sulla regolazione
Vedere le strutture che
determinano le funzioni
Come in ogni campo la cosa essenziale è porsi le
domande giuste e vedere se ci sono metodi per
rispondere.
Per studiare i neutrini dal ministero ci hanno fatto sapere
che hanno scavato un tunnel dall’accelleratore di Ginevra
al Laboratorio del Gran Sasso, (per fortuna i neutrini
viaggiano anche senza il tunnel e l’esperimento è stato
possibile senza il tunnel)
Però generalmente con tecniche nuove si possono fare
esperimenti più complessi ed avere nuove informazioni.
Utilità delle tecniche
Con la sperimentazione uno dei grandi passi è stato fatto
grazie all’uso o alla costruzione di prove indirette
accumulando evidenze che univocamente portino ad un
significato unico rispetto alla domanda fatta
A volte ci sono evidenze parziali ma che corroborano
una ipotesi e non sono contraddittorie
A volte le risposte contraddittorie indicano che un
problema è più complesso di come sia stato ipotizzato ed
in biologia capita molto spesso
I esempio
Da quando esistono i microscopi siamo abituati a
vedere il materiale biologico in maniera bidimensionale
Con i microscopi elettronici si vede molto più ingrandito
fino ad arrivare a macromolecole
“electron microscopy grids, dehydrated, and then critical
point-dried before shadow-coating with carbon/platinum
alloy at a fixed angle”
Si ottiene una figura bidimensionale in cui
l’ombreggiatura crea una differenza facendo risaltare la
terza dimensione che comunque non è quella nativa
shadowing
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
QuickTi me™ e un
decomp resso re TIFF (Non co mpres so)
son o ne ces sari per vis uali zzare que st'imma gine .
QuickTi me™ e un
decomp resso re TIFF (Non co mpres so)
son o ne ces sari per vis uali zzare que st'imma gine .
II esempio
Cercando le tre dimensioni al microscopio o con altri
strumenti si può provare con la ricostruzione delle
immagini ottenute su piani diversi (3D)
Tomografie con rx o risonanza magnetica
ed anche col microscopio confocale
La novità (avanzamento della tecnica) è stata la
possibilità di avere programmi che ricostruiscono le
immagini prese in successione sulla terza dimensione
asse “z”
Immagini al confocale
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Simultaneous co-detection of DNA replication and specific histone
H1.5/H1.2 phosphorylation sites using confocal microscopy.
Replication sites were detected by incorporating 5-ethynyl-2'deoxyuridine (EdU; 10-min pulse). Histone H1.5 phosphorylation
Il genoma come si vede?
Cromosomi politenici di drosofila
Colorazione con DAPI
cromosoma
In metafase
avvolgimenti fantasiosi
della cromatina
QuickTime™ e un
de com press ore TIFF (No n compre sso)
so no n ece ssari per vi sual izza re qu est'imm agin e.
Cromosomi alla metafase
nella maggior parte del tempo il crms come sta?
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
AFM
microscopio
a forza
atomica
AFM views of human metaphasic chromosomes from asynchronous fibroblast cultures.
Left panel (47 µm x 47 µm field) and inset (9 µm x 18 µ field): air-imaging of the cell
monolayer upon KCl hypotonic shock, methanol/acetic acid fixation and air drying.
Central right panel (6 µm x 6 µm field): hypotonic shock/fixation as for left panel; imaging
in liquid upon rehydration in PBS (lower inset shows a 3D-view of the same field). Upper
right inset (20 µm x 20 µm): imaging in liquid of an unfixed metaphasic plate.
DNA
Piccole molecole di plasmidi al microscopio elettronico
QuickTime™ e un
de com press ore TIFF (No n compre sso)
so no n ece ssari per vi sual izza re qu est'imm agin e.
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'i mmagine.
È stata visualizzata la replicazione e la trascrizione
Ma il DNA non è statico
Avevano capito che c’era associazione tra fenotipo e genoma a
partire dall’inizio del ‘900 con gli studi su Drosofila e con la teoria
cromosomica (vedi file sul sito della didattica: chromosomal theory)
I genomi si visualizzavano bene su Dorsofila perché sono politenici
nelle ghiandole salivarie
I cromosomi di altre specie richiedono miglior risoluzione però si
vedono solo nella condizione condensata in metafase ed è la
condizione “anomala” di “passività”!
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
QuickTime™ e un
decompressore TIF F (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
colorazione e bandeggi
Le uniche analisi dirette sui cromosomi erano le anomalie
come rotture, traslocazioni, inversioni, duplicazioni ecc.
associate ai possibili fenotipi
Sempre e solo su cromosomi metafasici
La materia si chiama però “Citogenetica”
Come si studiava la genetica? Come Mendel
Però Mendel non conosceva il “linkage”
http://linkage.rockefeller.edu/
Dal linkage alle mappe genetiche
Allora il genoma sta allineato e sta nei cromosomi
C’è il gap tra mappe genetiche - “markers” e cromosomi
Quindi come si è arrivati alle genomica ?
Teniamo presente che l’organizzazione dei cromosomi è
stata scoperta con tutti gli studi a partire dalla citogenetica
e meccanismi di mitosi e meiosi, istoni, metilazione (J Mol
Biol.1965 Dec;14(2):603-7. On methylation of DNA during development of the
sea urchin embryo. Scarano E, Iaccarino M, Grippo P, Winckelmans D.)
L’epigenetica è già ultra quarantenne. 2011-1965= 46
Serve una mappa completa per sapere cosa corrisponde
a cosa
sequenziamento dei genomi interi partendo
dalle mappe e dai clonaggi =corrispondenza geni-crms
Come sono i genomi ?
Rapporto n.geni / grandezza del genoma = densità
Genomi in banche dati : arrivano gli -omi
proteoma, metaboloma
Coding sequences : ~ trascrittoma (traduttoma
non esiste)
Regioni trascritte sono molte rispetto a quelle
codificanti ma corrispondono a regioni di cromatina
attivata
Forse solo il 5% del genoma corrisponde a geni
Il 95% cosa fa?
Cosa deve fare il genoma ?
Quali sono i compiti e le funzioni che il genoma deve svolgere ?
Secondo il ciclo cellulare:- obbedire alle necessità per la mitosi
e della meiosi
- obbedire alle necessità di tutto
quello che succede prima e dopo
mitosi e meiosi (interfasi)
Siccome in interfase il genoma non si vede direttamente, c’era
solo lo studio della genetica classica e molecolare (mappe e
poi con la restrizione e clonaggi) per capire qualcosa
Le immagini illusorie
cariotipo
QuickTime™ e un
de com press ore TIFF (No n compre sso)
so no n ece ssari per vi sual izza re qu est'imm agin e.
Formazione del
Complesso della
RNA poly II
Quic kTime™ e un
dec ompres sore TIFF (Non c ompres so)
s ono nec es sari per visualiz zare ques t'immagine.
Electron microscopy of the TBP-IIB-IIFRNAPII-promoter complex.
(A) Representative
images (upstream DNA segment at left in top two panels;
downstream DNA segment at left in bottom two panels;).
The bar represents 500 Å.
(B) Observed positions of upstream and downstream edges of protein mass on DNA fragment. Open bars,
positions of upstream edge (determined from protein-free contour lengths of upstream DNA segments). Solid
bars, positions of downstream edge (determined from protein-free contour lengths of downstream DNA
segments). Arrow, expected position of the TATA element. (C) Observed DNA bend angles (bend angle defined
as angle of deviation from linear DNA trajectory). (D) Observed DNA bend centers (bend center defined as
intersection of projected upstream and downstream DNA segments). Open bars, diameters of protein mass.
Solid bars, distances between bend center and upstream edge of protein mass. (E) Observed contour lengths.
Open bars, DNA alone. Hatched bars, protein-free DNA in complexes. Solid bars, protein-free DNA plus
diameter of protein mass in complexes.
Dati funzionali
Finchè si tratta di dati descrittivi poco si può capire di come
funziona il genoma e le foto anche belle del DNA non
spiegano il complesso del genoma e la sua dinamica
Nella genomica si vuole mettere insieme le informazioni
derivate da analisi globali con varie metodologie sulla
struttura e funzione del genoma
La struttura dei geni è già nota da un pezzo e come si
attivano a partire dalla trascrizione col promotore anche
Non si sa come avviene il coordinamento tra i geni per
la loro espressione, si conoscono solo alcuni induttori
dati descrittivi necessari
L’unificazione delle informazioni è avvenuta sulla base
descrittiva a partire dalle mappe geniche che però erano
state fatte su dati funzionali
I genotipi erano ricavati dai fenotipi (mutazioni o polimorfismi),
sulla base del linkage venivano associati i geni e però studiati
per la loro funzione singola
è chiaro che le interazioni sono complesse e multiple, anche
solo per la divisione cellulare è stato evidente, coinvolgono
veramente tante funzioni
La conoscenza dei genomi interi
Dati descrittivi permettono solo di individuare le
sequenze codificanti e non, parti esoniche ed
introniche,
la distribuzione dei geni: il trascrittoma
Il trascrittoma varia per i vari tipi di cellule
Compaiono molti trascritti non tradotti
È un’analisi con descrizione parziale e variabile
Come si può analizzare il genoma più in dettaglio
Visone del genoma non più statico
Il genoma plastico e dinamico
Si consideravano i singoli geni e le interazioni tra proteine a
volte con il DNA
I geni sono parte del genoma e non si possono considerare
avulsi dal loro contesto
Comprendere completamente la funzione dei geni è
possibile considerando tutte le interazioni e si arriva a
comprendere come funziona e perché il genoma ha quella
organizzazione
come invia informazioni come le riceve
fino agli anni 80 la biologia molecolare sui microrganismi
la genetica sul fenotipo e gli incroci
obbiettivo : le mappe genetiche creano il collegamento
con il genoma ed i cromosomi
la struttura dei cromosomi era eucromatina ed eterocromatina
sequenze ripetute, strutture selfish,
l’evoluzione solo sulle strutture codificanti
Troppo generica la “regolazione”
Sotto il nome della regolazione si comprendeva tutto,
è un’idea generale che deve essere circostanziata,
era nata riferita o ad un gene o ad un operone (cluster
genico)
Che percorso segue il genoma col destino della cellula ?
QuickTime™ e un
de com press ore TIFF (No n compre sso)
so no n ece ssari per vi sual izza re qu est'imm agin e.
Focalizzazione sulla parte
più passiva della funzione
del genoma: la replicazione
e divisione cellulare
(sistema già assai
complesso per genetica e
biochimica)
La funzione vera dove sta?
È chiaro che meiosi e mitosi negli eucarioti hanno
condizionato il genoma per l’organizzazione in
cromosoma eucariotico
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'i mmagine.
Però dal lievito al riccio di mare o
alla drosofila il differenziamento
pare impressionante
Nel lievito c’è già quasi tutto, cioè
tutti i meccanismi che poi servono
anche al differenziamento
dai singoli meccanismi in avanti
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Le cellule eucariotiche
differenziate e quiescenti
stanno in G0
Riempire il gap tra struttura e funzione del genoma
limitato ancora allo studio dei singoli geni
la struttura del crms per la mitosi
ma anche per le altre funzioni che non si conoscono
Riunificare : genoma-cromatina-cromosoma
La replicazione del DNA e la divisione dei cromosomi
sono eventi eccezionali anche in fase di alta
moltiplicazione cellulare
però in queste fasi si riescono a vedere i cromosomi e
sono stati studiati più facilmente
ma durante queste fasi i cromosomi sembra che siano
passivamente duplicati e trasportati
In GO cosa fa il genoma?
È la fase in cui immaginiamo si attivino le funzioni
propriamente dette non più solo passive come
ipotizzate quelle della replicazione e divisione
Che vuol dire funzionare ?
deve rispondere ai segnali che riceve dandone altri
si basa tutto sulle interazioni che può avere solo all’interno
del nucleo
i segnali devono entrare ed uscire dal nucleo
si tratta di capire quali e quanti sono questi meccanismi
metodi di analisi
Così come per l’evoluzione naturale anche per lo studio si
usano i mezzi disponibili
Adattamenti ed invenzioni
Da quando è stato inventato come sequenziare il DNA non
c’erano limiti alla applicazione però nei suoi limiti
Il metodo si può applicare a qualunque tipo di DNA ma
analizzando un pezzo alla volta la cui lunghezza è limitata
Non si può sequenziare il DNA intero di un intero crms
si lavora “a pezzi e bocconi”
era necessario avere i frammenti ed in ordine, questo è
stato il vero limite
andare sulla luna
è diverso da andare su Marte
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Sequenziare il genoma di un
virus è più semplice che
sequenziare quello del lievito
Le difficoltà per sequenziare il genoma di lievito hanno
insegnato (imparato a Roma) come sequenziare genomi
complessi e finalmente è toccato ai mammiferi
Adesso stanno uscendo nuovi metodi di seconda e
terza generazione
banche dati e gestione
Contemporaneamente sono nate nuove banche dati
I links ed i motori di ricerca
- le banche date storiche avevano i DNA totali e
divisi per specie, i cDNA e le proteine dedotte,
essenzialmente sono rimaste le stesse ma con
banche dati molto articolate
- i programmi di ricerca e di confronto si sono
articolati per gestire masse di dati enormemente più
grandi, per cercare geni ortologhi si corrono le
sequenze su banche di varia provenienza
tipo di banche dati
Derivate da metodologie nuove di sequenziamento
A partire dai sequenziamenti “shotgun” di “cDNA libraries”
ci sono sequenze assegnate e ignote
Per i genomi analogamente ci sono sequenze allineate e
non
A questi tipi di sequenze corrispondono delle banche dati
con corrispondenza ai genomi allineati e non
per il genoma umano dall’annuncio del sequenziamento
totale alla chiusura di tutte le regioni cromosomiche con i
contigs allineati e col verso giusto sono passati quasi 10
anni
Procedure di routine
Da quando si possono fare sequenze in modi diversi
esistono banche dati corrispondenti
Per lunghezza dei frammenti da 100 a 800 bp
BAC assemblati
Genomi indipendenti per cercare polimorfismi
Analisi di SNPs e VNTR (single nucleotides e copy number
variants)
I polimorfismi sono all’interno della specie quello che in
tempi più lunghi succede tra specie e a secondo del tipo di
gene o di regione sono più o meno variabili o conservati
Confronti di sequenze genomiche
metodo di display semplificante
l’occhio vuole la sua parte: si individuano le regioni
conservate e le estensioni dall’intensità del colore,
L’istogramma sotto le sequenze da il pattern di
conservazione,
A sinistra delle sequenze il n. per individuare e trovare
l’intera sequenza con le specifiche nella banca dati,
Si individuano le regioni mancanti nei cloni delle varie
specie e si ottiene una informazione sulla conservazione
di una data regione genomica
Le nuove sequenze umane e di primati vengono
allineate sulla prima sequenza totale, da cui la possibile
perdita di polimorfismi più vasti e mantenimento di errori
eredità conservazione e variabilità
geologia ed evoluzione
mondo vivente iniziale c’è stato un ancestrale comune ?
Curiosità per sapere se gli inizi sono un mondo ad RNA
evidenze molto interessanti più solide ? dell’ipotesi del
mondo primordiale di amminoacidi
Perché si parla di evoluzione?
trasformazione (evoluzione)
il contenuto di valore presente nella parola evoluzione
non è facile giudicare se il mondo vivente ancestrale fosse
migliore o peggiore
lana caprina, evoluzione non ha un contenuto finalistico
concetto evolutivo
trasformazione, cambiamento,
evoluzione è una parola che esisteva da prima delle
teorie della evoluzione biologica
Riferimenti umani ed esempi :
i modi di costruzione rispondono ad esigenze diverse
dalla capanna
al cemento armato
esigenze intrinseche ed ambientali esterne