Scuola Superiore Medico Tecnica
Formazione Tecnici in Analisi Biomediche
Lavoro di diploma
CELL-DYN 3200:
È POSSIBILE USARE IL SANGUE DI PAZIENTI
COME CONTROLLO DI QUALITÀ INTERNO
PER L’EMOGRAMMA SEMPLICE?
Lorenza Sciolli
Docente responsabile
FAMH Ematologia
Dr. Med. G. Scali
Ospedale Beata Vergine Mendrisio
Capo laboratorio: A. Gianotti
Giugno 2006
INDICE
1. RIASSUNTO/ABSTRACT .............................................................................................................2
2. INTRODUZIONE............................................................................................................................3
2.1 I controlli di qualità in ematologia ............................................................................................3
2.2 Determinazione dell’emogramma semplice con CELL-DYN 3200 e i parametri da esso
formato ............................................................................................................................................4
3. OBIETTIVO ....................................................................................................................................6
4. MATERIALI E METODI................................................................................................................7
4.1 Materiali ....................................................................................................................................7
4.1.1 L’apparecchio automatico CELL-DYN 3200 ...................................................................7
4.1.2 I campioni di sangue..........................................................................................................7
4.2 Metodi .......................................................................................................................................8
5. RISULTATI OTTENUTI ................................................................................................................9
5.1 Valutazione dell’imprecisione tra le analisi in doppio e tra i giorni .........................................9
5.2 La stabilità in funzione del tempo ...........................................................................................10
5.3 Valore di confidenza della media............................................................................................17
6. DISCUSSIONE..............................................................................................................................20
7. CONCLUSIONE ...........................................................................................................................21
8. BIBLIOGRAFIA ...........................................................................................................................22
9. GLOSSARIO .................................................................................................................................23
10. RINGRAZIAMENTI ...................................................................................................................24
11. ALLEGATI..................................................................................................................................25
Immagine in copertina:
CELL-DYN 3200, http://www.spectroncorp.com/Clinical/Hematology/products_abbott.htm
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
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1. RIASSUNTO/ABSTRACT
Lo scopo del mio lavoro di diploma è quello
di stabilire se è possibile utilizzare il sangue
di pazienti come controllo di qualità interno
dell’emogramma
semplice
adoperando
l’apparecchio CELL-DYN 3200 della ditta
Abbott.
Ho ritenuto valido e preso come punto di
partenza il lavoro di diploma “I reticolociti, la
loro stabilità e confronto tra due apparecchi
automatici” svolto da Ines Salina (edizione
giugno 2005), in cui dimostrava che leucociti,
eritrociti, emoglobina, ematocrito, MCV e
trombociti sono stabili per quattro giorni ad
una temperatura di 4°C. Per raggiungere il
mio scopo ho esaminato la stabilità del sangue
per i parametri sopra elencati dal quinto al
nono giorno. Il giorno del prelievo ho
eseguito l’emogramma in doppio per ogni
campione, in seguito l’emogramma in doppio
dal quinto al nono giorno. I campioni di
sangue sono stati tenuti, per tutta la durata
della raccolta dei dati, rigorosamente a 4°C.
Ho utilizzato 20 campioni di sangue di
pazienti del pronto soccorso e pazienti
ambulanti del laboratorio raccogliendo 240
dati per ogni parametro.
I risultati ottenuti nello studio dimostrano che
eritrociti, emoglobina, ematocrito e MCV
sono stabili per nove giorni mentre i leucociti
e i trombociti lo sono solo quattro giorni.
Inoltre i risultati mostrano che i leucociti
diminuiscono con una tendenza che cambia da
campione a campione, ciò lascia pensare che
nemmeno nei primi quattro giorni essi siano
stabili.
In conclusione il sangue di pazienti non può
essere utilizzato come controllo di qualità
interno per l’emogramma semplice. Può
essere utilizzato per il controllo di eritrociti,
emoglobina, ematocrito e MCV.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
The purpose of this diploma work was to
establish if it is possible use the blood of
patients as internal quality control for the
simple hemogram using the apparatus CELLDYN 3200 of the firm Abbott.
I believed valid and used as my starting point
the diploma work “I reticolociti, la loro
stabilità e confronto tra due apparecchi
automatici”, by Ines Salina submitted July
2005). In this diploma work Ms Salina
showed that leucocytes, erythrocytes,
hemoglobin,
heamotacrit,
MCV
and
trombocytes are stable for four days at a
temperature of 4°C.
The stability of the blood was tested for the
above-mentioned parameters, from the fifth to
the ninth day. On the day of the blood’s
collection a double hemogram was performed
for each sample, then another double
hemogram from the fifth to the ninth day.
The temperature of the blood samples was
rigorously maintained at 4°C throughout the
data collection period.
I used 20 blood samples from the emergency
room and out-patients of the laboratory,
collecting 240 datas for each parameter.
The results indicate that erythrocytes,
hemoglobin, heamotacrit, MCV are stable for
nine days while leucocytes trombocytes are
stable for four days. The results suggest too,
that leucocytes decrease with a tendency that
changes from sample to sample, which
suggests that even in the first four days they
are unstable.
In conclusion, the patient’s blood cannot be
used as internal quality control for the simple
hemogram. However it could be used for the
control
of
erythrocytes,
hemoglobin,
heamotacrit, MCV.
2
2. INTRODUZIONE
2.1 I controlli di qualità in ematologia
In ematologia la qualità delle misurazioni prodotte dipende anche dal buon funzionamento degli
apparecchi automatici che come quello di tutti gli apparecchi di laboratorio, deve essere verificato
ogni giorno con controlli di qualità.
I controlli di qualità si dividono in due categorie: i controlli di qualità interni che verificano la
precisione dell’apparecchio ed i controlli di qualità esterni che verificano l’accuratezza
dell’apparecchio. La precisione per uno stesso campione consiste nella capacità dello strumento di
dare valori molto vicini gli uni con gli altri, mentre l’accuratezza consiste nell’ottenere risultati
vicino ad un valore nominale. [1]
Nel mio lavoro di diploma mi occupo della possibilità di utilizzare il sangue di pazienti come
controllo interno per l’emogramma semplice. Un lavoro del tutto nuovo, basato sui risultati ottenuti
dal lavoro di diploma “I reticolociti, la loro stabilità e confronto tra due apparecchi automatici”,
svolto da Ines Salina (edizione giugno 2005), in cui è stato dimostrato che i parametri
dell’emogramma semplice sono stabili per 4 giorni a 4°C, e su cui esiste poca o nessuna
documentazione. [2]
L’ematologia è un campo interessante e allo stesso tempo delicato per quanto riguarda i controlli di
qualità interni. Un buon controllo di qualità interno dovrebbe avere una lunga stabilità che permette
di avere un controllo statistico sul funzionamento dell’apparecchio automatico (allegato 1), ed
essere certi che un risultato diverso da quello dei giorni precedenti è dovuto ad un problema
dell’apparecchio automatico e non ad un cambiamento di concentrazione all’interno della provetta.
Per stabilità si intende la costanza nel tempo delle caratteristiche fisico-chimiche in modo tale che le
cellule vengano identificate come tali dal sistema di determinazione dell’apparecchio, nel caso di
CELL-DYN 3200 elementi cellulari stabili all’indagine ottica.
In ematologia ciò non si può avere in quanto le cellule ematiche sono molto delicate: non possono
essere congelate, sono sensibili a continui cicli di riscaldamento e raffreddamento, alla miscelazione
prolungata e al surriscaldamento. [3]
Le ditte che preparano i controlli di qualità hanno stabilizzato le varie cellule. Questo processo non
ha però risolto il problema della bassa stabilità del sangue, infatti i controlli di qualità vanno
cambiati settimanalmente. Il controllo di qualità CELL-DYN 22 è un reagente diagnostico “in
vitro” costituito da componenti cellulari simili alle piastrine, stabilizzate e lisabili, eritrociti umani e
leucociti umani fissati (allegato 2). La figura 1 mostra gli strisci del controllo di qualità CELL-DYN
22 della ditta Abbott paragonati con degli strisci di sangue di pazienti: si possono notare delle
evidenti differenze sia negli eritrociti che nei leucociti. Gli eritrociti del controllo di qualità sono
ipercromici, sferici ed appaiono più piccoli degli eritrociti dello striscio di sangue di pazienti. I
leucociti del controllo di qualità sono più omogenei e senza struttura rispetto a quelli dello striscio
di sangue del paziente.
In questo contesto la possibilità di utilizzare il sangue di pazienti come controllo di qualità interno
non risolverebbe il problema della stabilità del sangue ma permetterebbe di utilizzare come
controllo di qualità materiale biologico umano e la riduzione dei costi.
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Figura 1: Confronto tra strisci del controllo di qualità CELL-DYN 22 della ditta Abbott e strisci di campioni
di sangue EDTA di pazienti, colorati secondo Giemsa. Ingrandimento: obbiettivo 10, oculare 100 con
microscopio Nikon eclipse 50i. In alto a sinistra verso destra: striscio controllo di qualità livello normale,
livello basso e livello alto. In basso a sinistra verso destra: striscio di sangue di un paziente con valori
normali, di un paziente anemico (eritrociti diminuiti) e striscio di sangue di un paziente con policitemia vera
(eritrociti aumentati).
2.2 Determinazione dell’emogramma semplice con CELL-DYN 3200 e i parametri da esso
formato
L’emogramma semplice è composto dai valori riguardanti la parte corpuscolare del sangue senza la
differenziazione dei leucociti. Esso è formato dal numero di leucociti, eritrociti e trombociti, dalla
concentrazione dell’emoglobina, l’ematocrito, MCV, MCH e MCHC.
Il metodo per la determinazione dell’emogramma varia da apparecchio ad apparecchio, qui di
seguito riporterò brevemente come CELL-DYN 3200 compie la determinazione di questi parametri
(allegato 3) con una loro breve definizione. [4] [5]
Leucociti (WBC): sono cellule addette alla difesa del nostro corpo, essi si suddividono in
granulociti, monociti e linfociti.
I leucociti vengono determinati con il metodo ottico, dopo che un’aliquota del campione aspirato
viene diluito e analizzato per mezzo della citometria di flusso. Il metodo ottico permette il
conteggio dei leucociti e la loro differenziazione.
Il risultato viene espresso in numero di leucociti per 109/L (o G/L).
Eritrociti (RBC): sono cellule senza nucleo responsabili del trasporto dell’ossigeno. Gli eritrociti,
per svolgere le loro funzioni, utilizzano molta energia ricavata dal glucosio. In particolare utilizzano
energia per mantenere il ferro dell’emoglobina in forma bivalente, mantenere elevato il potassio e
basso il sodio e il calcio intracellulari contro il gradiente esterno e mantenere la forma biconcava
della cellula.
Trombociti (PLT): sono frammenti di citoplasma della cellula madre e hanno un ruolo nella
coagulazione.
Eritrociti e trombociti vengono determinati nello stesso canale ottico. Un’aliquota di sangue viene
diluita ed in seguito analizzata per mezzo della citometria di flusso.
La differenziazione tra eritrociti e trombociti avviene in base alle loro differenti dimensioni e alla
densità.
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Il risultato degli eritrociti viene espresso in numero di eritrociti per 1012/L (o T/L), mentre i
trombociti in numero di trombociti per 109/L (o G/L).
Emoglobina: è la sostanza presente negli eritrociti che lega l’ossigeno.
Un’aliquota di sangue viene diluita e in seguito viene aggiunto il reagente di lisi che permette la
fuoriuscita dell’emoglobina dagli eritrociti.
Il campione diluito viene trasferito nella celletta di flusso HGB dove viene misurato l’assorbimento
della luce a 540 nm. La concentrazione dell’emoglobina nel campione è direttamente proporzionale
alla densità ottica.
L’emoglobina viene espressa in g/dL.
MCV: è il volume cellulare medio degli eritrociti.
Viene derivato dai dati di distribuzione delle dimensioni eritrocitarie determinate con il metodo
ottico.
Il risultato viene espresso in fL (10-15/L).
Ematocrito: è il volume di eritrociti contenuto in qualunque volume di sangue intero anticoagulato
con EDTA ed espresso in percentuale. L’ematocrito è approssimativamente tre volte il valore
dell’emoglobina.
L’ematocrito viene calcolato a partire dal conteggio assoluto degli eritrociti e dal volume globulare
medio e viene espresso in percentuale:
HCT = (RBC x MCV) / 10
MCH: è il contenuto medio di emoglobina contenuta in un eritrocita.
MCH viene calcolato in base al conteggio degli eritrociti e alla concentrazione di emoglobina ed
espresso in pg (10-12/L):
MCH = (HGB / RBC) x 10
MCHC: è la concentrazione cellulare media dell’emoglobina nell’eritrocita.
MCHC viene calcolato in base al valore di emoglobina e all’ematocrito ed espresso in g/dL:
MCHC = (HGB / HCT) x 100
Riassumendo CELL-DYN 3200 misura il numero di leucociti, eritrociti, trombociti, la
concentrazione di emoglobina e MCV, mentre calcola l’ematocrito, MCH, MCHC.
Per determinare se il sangue di pazienti può essere utilizzato come controllo di qualità interno,
valuterò, di conseguenza, i dati che CELL-DYN 3200 misura e in oltre all’ematocrito. La scelta di
valutare anche l’ematocrito, benché il suo valore sia calcolato dall’apparecchio, è basata
sull’informazione che esso ci da: se l’ematocrito non è approssimativamente tre volte il valore
dell’emoglobina ci deve essere o un problema nel numero degli eritrociti o del MCV.
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3. OBIETTIVO
Nel lavoro di diploma “I reticolociti, la loro stabilità e confronto tra due apparecchi automatici”,
svolto da Ines Salina è stato dimostrato che leucociti, trombociti, eritrociti, emoglobina, ematocrito
e MCV rimangono stabili per quattro giorni se tenuti a 4°C. Inoltre è stato dimostrato che
analizzando i campioni di sangue, anticoagulati con EDTA, con l’apparecchio automatico CELLDYN 3200 e con ADVIA 120 si ottengono risultati simili per i parametri sopra elencati [2].
CELL-DYN 3200 della ditta Abbott e ADVIA 120 della ditta Bayer sono i due tipi di apparecchi
automatici per l’ematologia attualmente in uso all’interno dei laboratori dell’Ente Ospedaliero del
Cantone Ticino.
L’obiettivo del mio lavoro di diploma, basato sui risultati ottenuti da Ines Salina, è quello di
stabilire se si può utilizzare il sangue di pazienti come controllo di qualità interno in ematologia per
i seguenti parametri: leucociti, trombociti, eritrociti, emoglobina, ematocrito e MCV. L’utilizzo di
sangue di pazienti come controllo di qualità interno di ematologia permetterebbe di ridurre i costi
sostituendo, almeno in parte, i controlli di qualità interni forniti dalle ditte, che hanno un alto costo e
una breve stabilità dopo la loro apertura.
Inizialmente, per raggiungere il mio obbiettivo, ho pensato di scegliere tre campioni di sangue di
pazienti da utilizzare per quattro giorni come controlli di qualità in concomitanza con i controlli di
qualità interni normalmente utilizzati in routine.
Il metodo di lavoro è però stato cambiato: ritenuti validi i risultati dello studio precedente si è
deciso di osservare la stabilità del sangue dal quinto fino al nono giorno risparmiando reagenti e
tempo.
La stabilità del sangue è già stata stabilita dall’OMS (allegato 4) [6], ma bisogna tenere conto che
oltre alla stabilità del sangue è importante la sensitività e la specificità con la quale un apparecchio
lavora. L’apparecchio che uso per il mio lavoro di diploma viene utilizzato secondo il manuale
d’impiego fornito dalla ditta e il suo funzionamento è verificato da controlli di qualità interni
giornalieri e controlli di qualità esterni mensili. I risultati che otterrò con questo lavoro di diploma
saranno da considerare per l’apparecchio CELL-DYN 3200 e non come un risultato universale.
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4. MATERIALI E METODI
4.1 Materiali
4.1.1 L’apparecchio automatico CELL-DYN 3200
Il mio lavoro di diploma è stato svolto con l’automatico di ematologia CELL-DYN 3200 della ditta
Abbott AG Diagnostics di Baar, presente presso il laboratorio dell’Ospedale Beata Vergine di
Mendrisio.
CELL-DYN 3200 esegue per ogni campione di sangue l’emogramma completo.
I parametri che riguardano il mio lavoro di diploma sono leucociti, trombociti, eritrociti,
emoglobina, ematocrito e MCV. Questi parametri vengono determinati nel seguente modo:
leucociti, eritrociti e trombociti vengono determinati con il canale ottico; l’emoglobina viene
determinata nella soluzione ottenuta dopo la lisi degli eritrociti mediante lettura fotometrica; MCV
viene misurato mentre l’ematocrito viene calcolato a partire dai valori ottenuti precedentemente,
secondo la formula riportata nell’introduzione. MCH e MCHC, che non rientrano nei parametri
considerati nello studio, sono pure calcolati a partire dai valori ottenuti precedentemente, secondo le
formule riportate nell’introduzione.
CELL-DYN 3200 possiede due modalità per l’aspirazione: la modalità a campione aperto e la
modalità a campione chiuso. Nella modalità a campione aperto il campione viene aspirato dopo che
il tappo della provetta è stato tolto e la provetta tenuta sotto l’ago. Nella modalità a campione chiuso
invece il sangue viene aspirato direttamente dalla provetta chiusa mediante perforazione del tappo. I
miei campioni sono stati aspirati nella modalità a campione aperto, poiché le provette da 6 mL da
me utilizzate non possono essere impiegate nella modalità a campione chiuso per la loro
dimensione.
4.1.2 I campioni di sangue
Ho scelto di utilizzare 20 campioni di sangue non emolizzati, raccolti in provette Vacutainer BD da
6 mL EDTA.
Il sangue è stato prelevato scegliendo a caso tra pazienti che arrivavano in pronto soccorso e da
pazienti ambulanti del laboratorio, in cui rientrano anche pazienti di oncologia.
Come nello studio precedente [2] dopo riflessione collegiale si è ritenuto eticamente sufficiente
informare il primario Dr. Balestra, ed averne il consenso, senza avvisare i singoli pazienti.
Inizialmente i campioni di sangue dovevano essere scelti casualmente ma in modo da rispettare due
criteri: avere uno stesso rapporto di pazienti con valori normali, bassi e medi scelti consultando gli
emogrammi precedenti dei pazienti degenti, e non avere campioni di sangue di pazienti oncologici.
I pazienti oncologici si volevano escludere dallo studio per le forti e particolari cure medicamentose
a cui sono sottoposti, che potrebbero influire sulla stabilità delle cellule ematiche. Mantenere questi
criteri non è stato possibile per problemi di etica professionale sollevati dal personale di reparto, il
quale sosteneva che i pazienti andavano avvertiti in prima persona che si prelevava loro una
provetta di sangue in più svolgere lo studio, nonostante il primario fosse stato avvertito.
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4.2 Metodi
Il lavoro di diploma è stato svolto presso l’Ospedale Beata Vergine di Mendrisio in tre periodi di
tempo diversi: nei primi due periodi sono stati raccolti e analizzati 5 campioni di sangue alla volta
mentre nel terzo periodo 10 campioni alla volta. Il lavoro è stato suddiviso in questo modo per
motivi organizzativi e di tempo: la pianificazione del lavoro di diploma ha richiesto più tempo di
quanto inizialmente presupposto.
I prelievi di sangue dovevano essere portati in laboratorio entro due ore dal prelievo: dopo questo
tempo non sono più garantiti risultati costanti. Non si è potuto controllare questa variabile per i
prelievi del pronto soccorso. [7]
Il giorno del prelievo dei campioni, definito “giorno uno”, è stato eseguito per ogni campione un
doppio emogramma (analisi in doppio) nella modalità a campione aperto.
I campioni di sangue sono stati tenuti in frigorifero a 4°C per 4 giorni.
Dal quinto giorno al nono giorno è stato eseguito ogni giorno l’emogramma in doppio per ogni
campione, sempre nella modalità campione aperto.
I campioni di sangue, durante la raccolta dei dati sono stati tenuti rigorosamente a 4°C fino al
momento dell’analisi. Al momento dell’analisi i campioni di sangue venivano prelevati dal
frigorifero e lasciati portare a temperatura ambiente per 15 minuti. Solo prima di eseguire
l’emogramma i campioni venivano messi sul miscelatore automatico, poiché una lunga
miscelazione può portare alla lisi delle cellule.
I campioni dal numero 6 al numero 10 compresi non sono stati analizzati il settimo giorno dal
prelievo per dimenticanza. Allo scopo di avere lo stesso numero di dati per ogni campione sono
stati analizzati a distanza di 12 ore: l’ottavo giorno alla mattina.
Svolgendo il lavoro di diploma con questo metodo ho raccolto 240 dati per ogni tipo di parametro.
Facendo la media dell’analisi in doppio ho 120 dati per ogni parametro.
I dati raccolti sono stati inseriti in un foglio Microsoft Excel in due sistemi differenti: come analisi
in doppio e con i valori medi dei doppi.
I dati sono stati consegnati a Dr. Marco Balerna che si è occupato della parte statistica. I dati sono
stati elaborati con i programmi per la statistica Analyse it , sowfter statistico per Microsoft Excel, e
Systat 11, programma della Systat. Alcuni dati sono stati da me rielaborati con Microsoft Excel.
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5. RISULTATI OTTENUTI
I dati ottenuti sono stati valutati con diversi sistemi per ottenere maggiori informazioni.
Nella valutazione dei dati i limiti sono stabiliti dal clinico implicato nel sistema (allegato 4). [8]
5.1 Valutazione dell’imprecisione tra le analisi in doppio e tra i giorni
L’imprecisione di un’analisi viene espressa con il coefficiente di variazione percentuale.
La determinazione dell’imprecisione tra le analisi in doppio ha un duplice scopo: validare la
raccolta dei dati e conoscere l’imprecisione con cui ha lavorato l’automatico. Il calcolo è stato
eseguito nel seguente modo: da prima si è calcolato la differenza tra le analisi in doppio per ogni
singolo giorno, parametro e campione; da questi valori si è calcolato il coefficiente di variazione di
ogni singolo campione e parametro e in seguito è stato calcolato il coefficiente di variazione medio
di tutti i campioni per ogni singolo parametro.
La valutazione dell’imprecisione tra giorni ci consente di capire quanto sono variati i risultati
durante i giorni della raccolta dei dati. Il calcolo è stato fatto partendo dalle tabelle con i valori medi
delle analisi in doppio: per ogni campione è stato calcolato il coefficiente di variazione per ogni
singolo parametro dal primo al nono giorno, in seguito è stata calcolata la media del coefficiente di
variazione di tutti i campioni per ogni singolo parametro.
Il confronto tra le due imprecisioni ci permette di dire se un risulto è tale per l’imprecisione della
macchina o per un cambiamento della concentrazione di un singolo parametro all’interno della
provetta (i singoli valori ottenuti sono riportati nell’allegato 6).
Tabella 1: Imprecisione delle analisi in doppio
Imprecisione delle analisi in doppio
CV% medio di tutti i campioni
CV% minimo trovato tra i campioni
CV% massimo trovato tra i campioni
WBC
2.64
1.26
4.97
RBC HGB HTC MCV
0.92 1.15 0.88 0.20
0.31 0.50 0.41 0.10
2.16 3.10 1.39 0.40
PLT
2.76
1.02
4.74
Tabella 2: Imprecisione delle analisi tra giorni
Imprecisione delle analisi tra giorni
CV% medio di tutti i campioni
CV% minimo trovato tra i campioni
CV% massimo trovato tra i campioni
WBC RBC HGB HCT MCV
55.98 1.00 1.24 1.10 0.96
8.73
0.38 0.36 0.39 0.38
97.38 2.09 3.01 1.80 1.86
PLT
10.49
1.76
24.80
La tabella 1 mostra che per tutti i parametri analizzati il coefficiente di variazione è basso: il lavoro
di diploma può essere considerato valido. La validazione è pure garantita dai controlli di qualità
eseguiti ogni giorno in laboratorio dal personale responsabile.
WBC: L’imprecisione delle analisi in doppio è molto bassa rispetto all’imprecisione dei valori tra
giorni, ciò ci consente di dire che l’apparecchio ha lavorato in modo preciso e che all’interno della
provetta con il passare dei giorni si ha una diminuzione dei leucociti.
RBC, HGB, HTC: L’imprecisione tra l’analisi in doppio e l’imprecisione tra i giorni è simile. In
questi casi non si può dire se un aumento o una diminuzione di un parametro è dovuto alla
variazione del numero di eritrociti all’interno della provetta o all’imprecisione della misurazione da
parte dell’automatico.
MCV: L’imprecisione tra l’analisi in doppio è molto bassa, mentre l’imprecisione tra i giorni è
leggermente più alta. In questo caso non si può attribuire con sicurezza un aumento o una
diminuzione di MCV a un cambiamento del volume cellulare medio degli eritrociti all’interno della
provetta o all’imprecisione della misurazione.
PLT: L’imprecisione tra i giorni è più alta rispetto all’imprecisione tra le analisi in doppio, ciò
significa che i trombociti determinati non sono stabili.
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5.2 La stabilità in funzione del tempo
Ho ritenuto interessante, come suggeritomi dal Dr. Marco Balerna, raffigurare l’andamento di ogni
singolo campione per ogni parametro in un’unica figura. Ciò ci consente di avere una visone
globale dell’andamento.
I valori sono espressi in percentuale dove il valore del primo giorno è considerato il 100%. Le
percentuali sono state calcolate dai valori medi ottenuti dalle analisi eseguite in doppio.
% WBC rispetto al
giorno 1 (=100%)
Stabilità dei WBC in funzione dei giorni
120.0%
100.0%
80.0%
60.0%
40.0%
20.0%
0.0%
1
5
6
7
8
9
Giorno
.Figura 2: Stabilità percentuale dei leucociti rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei
giorni. Ogni linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 20 campioni.
Risultati ottenuti:
- Figura 2: media di tutte le percentuali: 51.2%, valore percentuale minimo trovato: 18.0%,
valore percentuale massimo trovato: 100.0%
La figura 2 mostra che con il passare dei giorni i leucociti diminuiscono in tutti i campioni. La
diminuzione e il suo andamento dipende però dai singoli campioni senza seguire una regola
generale: infatti si può notare che alcuni campioni il quinto giorno hanno subito una diminuzione
inferiore al 20% mentre altri già del 60-80%.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
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% RBC rispetto al giorno
1 (=100%)
Stabilità RBC in funzione dei giorni
110.0%
105.0%
100.0%
95.0%
90.0%
1
5
6
7
8
9
Giorno
.
Figura 3: Stabilità percentuale degli eritrociti rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei
giorni. Ogni singola linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 20 campioni.
% RBC rispetto al
giorno 1 (=100%)
Stabilità RBC in funzione dei giorni,
campioni 6-20
104.0%
102.0%
100.0%
98.0%
96.0%
94.0%
92.0%
90.0%
1
5
6
7
8
9
Giorno
Figura 4: Stabilità percentuale degli eritrociti rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei
giorni, dei campioni 6-20. Ogni linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 16 campioni.
Risultati ottenuti:
- figura 3: media di tutte le percentuali: 99.7%, valore minimo trovato: 95,0%, valore
massimo trovato: 105.0%
- figura 4: media di tutte le percentuali dei campioni 6-20: 99,0%, valore minimo trovato tra i
campioni 6-20: 95,0%, valore massimo trovato tra i campioni 6-20: 102,0%
La figura 3 mostra che con il passare dei giorni gli eritrociti rimangono stabili, subendo una
variazione compresa tra ± 5%. I limiti nei quali è compresa l’imprecisione delle analisi è data dal
CV% medio di tutti i campioni e cioè per gli eritrociti 1,0 ±0.1.
L’andamento della stabilità nel tempo non è uguale per tutti i campioni, le fluttuazioni possono
essere spiegate, come visto al capitolo 5.1, sia dal cambiamento del numero degli eritrociti sia
dall’imprecisione dell’automatico nel determinare il numero degli eritrociti.
Dalla figura 3 si nota che alcuni campioni hanno un aumento di eritrociti maggiore degli altri. Un
analisi più attenta, grazie ad un’altra rappresentazione, mi ha rivelato che si tratta dei primi 5
campioni che sono stati analizzati nello stesso blocco di analisi. L’aumento è dovuto alla
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11
calibrazione di CELL-DYN 3200 per MCV e MCH che nel controllo esterno del mese precedente
risultavano più bassi rispetto hai valori ottenuti CQCS di Ginevra.
Ho ricalcolato la media dei valori percentuali dei campioni 6-20 ed ho ottenuto un valore medio più
basso. Il valore percentuale massimo si è pure abbassato. La rappresentazione di questi nuovi dati è
visibile nella figura 4.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
12
% HGB rispetto al
giorno 1 (= 100%)
Stabilità HGB in funzione dei giorni
115.0%
110.0%
105.0%
100.0%
95.0%
90.0%
85.0%
1
5
6
7
8
9
Giorno
.
Figura 5: Stabilità percentuale dell’emoglobina rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei
giorni. Ogni singola linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 20 campioni.
% HGB rispetto al
giorno 1 (= 100%)
Stabilità HGB in funzione dei giorni,
campioni 6-20
105.0%
100.0%
95.0%
90.0%
1
5
6
7
8
9
Giorno
Figura 6: Stabilità percentuale dell’emoglobina rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei
giorni, dei campioni 6-20. Ogni linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 16 campioni.
Risultati ottenuti:
- figura 5: media di tutte le percentuali: 100.7%, valore minimo trovato: 96.3%, valore
massimo trovato: 109.4%
- figura 6: media di tutte le percentuali dei campioni 6-20: 99.6%, valore minimo tra i
campioni 6-20: 96.3%, valore massimo tra i campioni 6-20: 104.0%
La figura 5 mostra che con il passare dei giorni l’emoglobina subisce delle variazioni percentuali
minime. I limiti nei quali è compresa l’imprecisione delle analisi è data dal CV% medio di tutti i
campioni e cioè per l’emoglobina 1,0 ± 0.1.
Dalla figura 5 si nota che l’emoglobina in alcuni campioni aumenta più che in altri.
L’approfondimento dei dati mi ha fatto capire che si tratta dei cinque campioni analizzati nel primo
blocco d’analisi (vedi pagine 11-12). Per questo motivo ho ricalcolato la media percentuale
considerando i campioni 6-20: la media percentuale si trova più vicino al 100%, e il valore minimo
si è abbassato, ciò è ben rappresentato nella figura 6.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
13
% MCV rispetto al
giorno 1 (=100%)
Stabilità MCV in funzione dei giorni
104.0%
102.0%
100.0%
98.0%
96.0%
94.0%
92.0%
90.0%
1
5
6
7
8
9
Giorno
.
Figura 7: Stabilità percentuale del MCV rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei giorni.
Ogni singola linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 20 campioni.
% MCV rispetto al
giorno 1 (=100%)
Stabilità MCV in funzione dei giorni,
campioni 6-20
104.0%
103.0%
102.0%
101.0%
100.0%
99.0%
98.0%
1
5
6
7
8
9
Giorno
Figura 8: Stabilità percentuale del MCV rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei giorni,
dei campioni 6-20. Ogni linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 16 campioni.
Risultati ottenuti:
- figura 7: media di tutte le percentuali: 100,4%, valore minimo trovato: 94.5%, valore
massimo trovato: 103,2%
- figura 8: media delle percentuali dei campioni 6-20: 101.3%, valore minimo tra i campioni
6-20: 99.9%, valore massimo tra i campioni 6-20: 103.2%
La figura 7 mostra che MCV è stabile nel tempo con una tendenza ad un leggero aumento per la
maggior parte dei campioni mentre per 5 campioni diminuisce. Si tratta dei primi 5 campioni
analizzati, gli stessi che hanno subito un aumento di eritrociti e dell’emoglobina (vedi pagine 1112). I limiti nei quali è compresa l’imprecisione delle analisi è data dal CV% medio di tutti i
campioni e cioè per MCV 1,0 ±0.1.
La figura 8, che considera i campioni 6-20, mostra la tendenza di MCV ad aumentare: la media
delle percentuali è aumentata dello 0.9% e il valore minimo si è alzato del 6.4%. L’aumento del
MCV è spiegabile con il fenomeno dell’osmosi, dovuto allo spostamento di liquidi all’interno degli
eritrociti per un cambiamento del gradiente di concentrazione.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
14
% HCT rispetto al
giorno 1 (=100%)
Stabiltà HCT in funzione dei giorni
104.0%
102.0%
100.0%
98.0%
96.0%
94.0%
92.0%
90.0%
1
5
6
7
8
9
Giorno
.
Figura 9: Stabilità percentuale dell’ematocrito rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei
giorni. Ogni singola linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 20 campioni.
% HCT rispetto al
giorno 1 (=100%)
Stabiltà HCT in funzione dei giorni,
campioni 6-20
104.0%
102.0%
100.0%
98.0%
96.0%
94.0%
92.0%
1
5
6
7
8
9
Giorno
Figura 10: Stabilità percentuale dell’ematocrito rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei
giorni, dei campioni 6-20. Ogni linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 16 campioni.
Risultati ottenuti:
- figura 9: media di tutte le percentuali: 100.0%, valore minimo trovato: 95.5%,valore
massimo trovato: 103.3%
- figura 10: media delle percentuali dei campioni 6-20: 100.2%, valore minimo trovato tra i
campioni 6-20: 96.3, valore massimo trovato tra i campioni 6-20: 103.3%
Nella figura 9 si nota che l’ematocrito è stabile nel tempo fino al nono giorno con dei cambiamenti
percentuali minimi. I limiti nei quali è compresa l’imprecisione delle analisi è data dal CV% medio
di tutti i campioni e cioè per l’ematocrito 1,0 ±0.1.
L’andamento non lineare è giustificato da quanto visto al capitolo 5.1.
Il valore dell’ematocrito viene calcolato moltiplicando MCV per il numero di eritrociti, per questo
motivo ho ricalcolato la media delle percentuali e rifatto la figura, figura 10, includendo i campioni
6-20: la media è variata di pochissimo e il valore minimo è aumentato dello 0.8%.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
15
% PLT rispetto al
giorno 1 (=100%)
Stabilità PLT in funzione dei giorni
120.0%
100.0%
80.0%
60.0%
40.0%
20.0%
1
2
3
4
5
6
Giorno
.
Figura 11: Stabilità percentuale dei trombociti rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei
giorni. Ogni singola linea rappresenta l’andamento di un campione, per un totale di 20 campioni.
Risultati ottenuti:
- figura 11: media di tutte le percentuali: 87.7%, valore minimo trovato: 50.6%, valore
massimo trovato: 106.0%
La figura mostra che la stabilità dei trombociti nel tempo varia da campione a campione con una
tendenza a diminuire. La stabilità dei trombociti è intermedia tra l’instabilità dei leucociti e la
stabilità degli eritrociti.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
16
5.3 Valore di confidenza della media
Una valutazione dei dati altrettanto interessante riguarda la rappresentazione dell’andamento della
media dei valori di tutti i campioni per ogni singolo giorno.
Nella figura è rappresentato anche l’intervallo di confidenza dalla media, ovvero l’intervallo dove,
ripetendo tutte le analisi, si piazzerebbero il 95% dei valori.
I dati sono stati elaborati con Systat 11 (i grafici originali sono riportati nell’allegato 6).
La figura mostra che con il passare del tempo i
leucociti diminuiscono.
L’intervallo di confidenza si allarga solo al nono
giorno.
Figura 12: Valore di confidenza dalla media in funzione dei giorni per i leucociti
La media del numero di eritrociti è molto stabile
nel tempo.
L’intervallo di confidenza è molto basso dal primo
al sesto giorno e l’ottavo giorno, mentre il settimo
e l’ottavo giorno è più ampio.
Figura 13: Valore di confidenza dalla media in funzione dei giorni per gli eritrociti
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
17
L’emoglobina rimane stabile nel tempo.
L’intervallo di confidenza si allarga il nono giorno.
Figura 14: Valore di confidenza dalla media in funzione dei giorni per l’emoglobina
MCV ha una leggera tendenza ad aumentare per il
fenomeno dell’osmosi che causa un leggero
aumento di volume degli eritrociti.
La media dei valori rimane costante nel tempo con
un intervallo di confidenza basso fino al sesto
giorno. Il settimo e nono giorno l’intervallo di
confidenza aumenta.
Figura 15: Valore di confidenza dalla media in funzione dei giorni per MCV
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
18
I valori medi dell’ematocrito rimangono stabili.
L’intervallo di confidenza varia di grandezza il
nono giorno.
Figura 16: Valore di confidenza dalla media in funzione dei giorni per dell’ematocrito
I valori medi dei trombociti tendono a diminuire
fino al quinto giorno per stabilizzarsi fino al ottavo
giorno e diminuire il nono. L’intervallo di
confidenza è più ampio rispetto gli altri parametri.
Il settimo e l’ottavo giorno l’intervallo di
confidenza è molto ampio.
Figura 17: Valore di confidenza dalla media in funzione dei giorni per i trombociti
L’intervallo di confidenza in tutte le figure è più ampio nel settimo e nel nono giorno. Una possibile
causa per il settimo giorno è l’esecuzione dell’emogramma dei campioni 6-10 che non è stato
eseguito il settimo giorno ma a distanza di 12 ore, l’ottavo alla mattina. È invece sconosciuta la
causa dell’aumento per il nono giorno.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
19
6. DISCUSSIONE
I dati ottenuti sono stati analizzati con tre diversi metodi statistici per ottenere più informazioni. Il
primo metodo riguarda l’imprecisione tra le analisi e l’imprecisione tra giorni. L’imprecisione tra
analisi indica con quale imprecisione ha lavorato CELL-DYN 3200 e permette di validare il lavoro
di diploma. L’imprecisione tra i giorni permette tramite il coefficiente di variazione di capire quanto
sono variati i risultati durante i giorni. Il secondo metodo consente di avere una visione globale
dell’andamento dei singoli campioni in un'unica figura per ogni parametro: le figure mostrano la
stabilità percentuale rispetto al primo giorno considerato il 100% in funzione dei giorni. Il terzo
metodo è la rappresentazione grafica dell’andamento della media dei valori di tutti i campioni per
ogni singolo giorno con la rappresentazione dell’intervallo di confidenza.
L’elaborazione dei dati riguardanti i leucociti mostra che con il passare dei giorni i leucociti
all’interno della provetta diminuiscono. Nei vari campioni i leucociti non diminuiscono tutti con lo
stesso andamento: ci sono campioni in cui il quinto giorno i leucociti sono calati del 20% e in altri
di oltre il 70%. Questi dati contrastano con quelli ottenuti nel lavoro di diploma “I reticolociti, la
loro stabilità e confronto tra due apparecchi automatici” in cui era stato dimostrato che i leucociti
sono stabili quattro giorni a 4°C. Una possibile spiegazione è che nel lavoro di diploma precedente
siano stati utilizzati, senza saperlo, campioni di sangue in cui i leucociti erano stabili nel tempo,
oppure perché effettivamente la stabilità dei leucociti subisce un abbassamento il quinto giorno.
I dati riguardanti il numero di eritrociti, la concentrazione di emoglobina, l’ematocrito e MCV
mostrano che questi parametri hanno una buona stabilità nel tempo fino al nono giorno. I parametri
MCH e MCHC possono pure essere considerati stabili perché calcolati a partire da valori stabili,
secondo le formule riportate nell’introduzione. La stabilità di questi parametri per 9 giorni potrebbe
essere spiegata con il fatto che gli eritrociti sono cellule senza nucleo che per svolgere la loro
funzione durante i 120 giorni di vita utilizzano l’energia ricavata dal glucosio. Questa energia serve
in particolare per mantenere il ferro dell’emoglobina in forma bivalente, mantenere elevato il
potassio e basso il sodio e il calcio intracellulari contro il gradiente esterno e mantenere la forma
biconcava della cellula. Non bisogna però dimenticare che esistono delle patologie che riducono la
vita degli eritrociti e di conseguenza la loro stabilità.
L’elaborazione dei dati riguardanti i trombociti mostrano che il loro numero varia nel tempo. La
loro stabilità è intermedia tra la grande stabilità degli eritrociti e l’instabilità dei leucociti.
Dai dati ottenuti si può affermare che i campioni di pazienti oncologici, le cui forti e particolari cure
medicamentose potrebbero influenzare la stabilità delle cellule ematiche, non hanno influito sulla
stabilità degli eritrociti e i parametri ad essi legati, come mostrato con i tre metodi statistici.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
20
7. CONCLUSIONE
L’obbiettivo del mio lavoro di diploma era di stabilire se si poteva utilizzare il sangue di pazienti
come controllo di qualità interno in ematologia per l’emogramma semplice utilizzando CELL-DYN
3200. L’analisi dei dati ha dimostrato che, con il metodo descritto e per i campioni utilizzati, ciò
non è possibile per l’instabilità dei leucociti e dei trombociti. Dai dati ottenuti si può utilizzare il
sangue di pazienti per il controllo di qualità interno di eritrociti, emoglobina, ematocrito, MCV,
MCH e MCHC.
Le componenti cellulari del sangue mostrano una forte inomogeneità di struttura e di sopravvivenza,
in particolare per i leucociti (neutrofili, basofili ed eosinofili) e i trombociti. Per il loro conteggio
sull’arco di più giorni (scopo del mio lavoro di diploma) è quindi indispensabile trovare una
combinazione di sostanze che garantiscano la stabilità per i leucociti ed i trombociti: si potrebbe
pianificare un nuovo studio con lo stesso scopo. Conoscendo la stabilità di eritrociti, emoglobina,
ematocrito, MCV, MCH e MCHC, si potrebbe ottenere in questo modo un controllo di qualità
interno partendo da campioni di sangue di pazienti.
I risultati ottenuti con il mio lavoro di diploma non li ritengo direttamente applicabili all’attività di
laboratorio quotidiana: essi dovrebbero essere validati da un ulteriore studio con un maggior
numero di pazienti (100-200) per coinvolgere il maggior numero di patologie.
In parallelo si potrebbe svolgere uno studio che confronti i risultati ottenuti dal sangue di donatori di
sangue, considerate persone in condizioni cliniche teoricamente sane, con quelle di popolazione di
pazienti con varie patologie. Se dovesse risultare che il sangue dei donatori di sangue è più stabile
di quello di pazienti affetti da una patologia si potrebbe usare il loro sangue come controllo di
qualità, ottenendo però un controllo solo per i valori normali e quindi di un unico livello.
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
21
8. BIBLIOGRAFIA
[1] Daniela Marcacci, “Calcolo di esattezza e precisione volumetriche”, 07.01.2004, dispense
distribuite durante il Corso di Chimica Clinica Pratica durante la formazione agli studenti di
Tecniche in Analisi Biomediche
[2] LDD, Ines Salina, FLM 3, Anno 2004-2005, “I reticolociti, la loro stabilità e
confronto tra due apparecchi automatici”, edizione giugno 2005
Sistema bibliotecario ticinese TS 0 048 453
[3] ABBOT, CELL-DYN SYSTEM PRODUCT INFORMATION SHEET,
CELL-DYN 22 Control, Abbott Laboratories 2004
[4] Manuale d’Impiego CELL-DYN 3200, 67-6498/R2, Maggio 1999
[5] Dr. Giancarlo Scali, dispense distribuite durante i 3 anni di formazione agli studenti di Tecniche
in Analisi Biomediche, pubblicato il mese di aprile 2004
[6] World Healt Organization, “Use of anticoagulants in diagnostic laboratory investigation &
stability of blood, plasma and serum samples”, Ginevra 15 gennaio 2002
[7] W. G. Guder, S. Narayanan, H. Wisser, B. Zawta, “Samples: From the Patient to the Laboratory.
The impact of preanalytical variables on the quality of the laboratory results.”, GIT VERLAG,
seconda edizione 2001
[8] Comunicazione a voce. Corso presso EOC Civico Lugano, del 14.02.2006, “Cosa valgono
veramente le mie misure? Da QUALAB a CSCQ e “6-SIGMA”
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
22
9. GLOSSARIO
METODO OTTICO
Il metodo ottico è costituito da una sorgente luminosa che colpisce le cellule che scorrono una in
fila all’altra. Le cellule colpite dal raggio di luce emetteranno della luce difratta che è proporzionale
al loro volume e della luce rifratta proporzionale alla loro densità.
CITOMETRIA DI FLUSSO
Procedimento nel quale le cellule passano attraverso un raggio di luce l’una in fila alle altra grazie
all’azione della corrente più forte di un liquido che le incanala.
EDTA
Acido etilendiamminotetracetico, è un anticoagulante
SENSITIVITÀ
Capacità di annunciare la presenza di elementi anomali, evitando falsi negativi
SPECIFICITÀ
Capacità di annunciare la minor presenza di elementi anomali che non sono tali, evitando falsi
positivi.
CSCQ
Centro Svizzero di Controllo della Qualità
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
23
10. RINGRAZIAMENTI
Ringrazio per la preziosa collaborazione le seguenti persone e i seguenti Istituti:
-
Dr. Med. Giancarlo Scali per il sostegno, la disponibilità e il prezioso aiuto
-
Dr. Marco Balerna che ha curato la parte statistica e per i suoi insegnamenti
-
la Signora Annetta Gianotti, capo laboratorio presso l’Ospedale Beata Vergine di Mendrisio
per l’aiuto e la pronta collaborazione
-
tutto il personale del laboratorio dell’Ospedale Beata Vergine di Mendrisio per la
disponibilità nella raccolta e analisi dei campioni e per il grande aiuto
-
il Direttore ad interim e docente di metodologia Andrea Boffini, e le docenti Daniela
Marcacci e Sonja Marci per avermi seguito ed aiutato durante tutto il lavoro di diploma
-
Il Direttore del Dipartimento di Medicina di Laboratorio Damiano Castelli per avermi
consentito di svolgere il lavoro di diploma presso EOLAB
-
la Scuola Superiore Medico Tecnica per avermi dato l’opportunità di svolgere un lavoro di
ricerca
-
i parenti e gli amici per il grande aiuto e sostegno
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
24
11. ALLEGATI
Allegato 1: Le Regole di Wesgard per il Sistema CELL-DYN 3200
Allegato 2: ABBOT, CELL-DYN SYSTEM PRODUCT INFORMATION SHEET,
CELL-DYN 22 Control
Allegato 3: Determinazione dei parametri con CELL-DYN 3200: manuale d’impiego e SOP del
laboratorio
Allegato 4: Stabilità delle cellule ematiche stabilita dall’OMS
Valori intralaboratorio e interlaboratorio EOLAB
Allegato 5: Raccolta di tutti i dati
Allegato 6: Elaborazione dati: grafici e tabelle
SSMT, Lorenza Sciolli, giugno 2006
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