Laboratorio di Microbiologia Industriale
Università degli Studi della Basilicata
SAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed Ambientali
School of Agriculture, forest, Food and Environmental sciences
Protocollo SAFE
Determinazione dell’attività proteolitica con il metodo OPA
Church, F.C., et al., 1983. Spectrophotometric assay using o-­‐phtaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins. J. Dairy Sci. 66: 1219-­‐
Materials:
1227 Principio del metodo:
La o-ftaldialdeide reagisce con i gruppi aminici liberi di peptidi e aminoacidi, formando un
composto che assorbe a 340 nm.
Reagenti:
•
•
•
•
•
Sodio tetraborato 100 mM
SDS 20%
OPA
Metanolo
β-mercaptoetanolo
Il reagente contiene componenti tossici e va preparato sotto cappa chimica con i dovuti DPI:
camice, guanti e occhiali; è instabile e quindi va preparato il giorno stesso in cui si usa.
Metodo:
In un pallone tarato da 50 ml sciogliere:
•
•
•
•
•
25 ml di Sodio tetraborato 100 mM (38.14 g/L)
2.5 ml di SDS 20%
40 mg OPA sciolti in 1 ml metanolo
100 µl di β-mercaptoetanolo
portare a volume con acqua deionizzata
Sciogliere in un pallone tarato da:
25 ml
50 ml
100 ml
Sodio tetraborato 100 mM
SDS 20%
OPA sciolto in metanolo
Metanolo
β-mercaptoetanolo
12.5 ml
1.25 ml
20 mg
0.5 ml
50 µl
25 ml
2.5 ml
40 mg
1 ml
100 µl
50 ml
5 ml
80 mg
2 ml
200 µl
SAFEOPA /AG/ep
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In un tubo 12x100 aggiungere 100 µl di estratto e 2 ml di reagente OPA; agitare bene;
lasciar reagire a temperatura ambiente ambiente per non meno di 2 min e non più di 5 min;
versare il contenuto del tubo in una cuvette UV grade e leggere l’assorbanza a 340 nm.
Le letture devono essere effettuate contro un bianco costituito da 2 ml di reagente OPA e 100
µl di una soluzione quanto più vicina possibile in composizione al campione analizzato1. Se
l'assorbanza è superiore a 1 occorre diluire.
Informazioni di sicurezza.
Preparato o
miscela
R
Sodio tetraborato
Non pericoloso
SDS
R11
R21/22
R36/37/38
SDS 20%
R36
R37
R38
R25
R34
R43
R50
OPA
Metanolo
R11
R23/24/25
R39/23/24/25
H
S
H228
H302
H311
H315
H318
H335
H319
H335
H315
H301
H314
H317
H400
P
P210
P261
P280
P305 + P351
+ P338 P312
P260
P280
H225
H301+H311+
H331
H370
S36/37/39
S45
S61
P273
P280
P301 + P310
S7
S16
S36/37
S45
P210
P260
P280
P301 + P310
P311
1
per esempio se si tratta di un estratto a pH 4,6 preparato con HCl usare una soluzione di HCl
corretta a pH vicino 4.6 con NaOH.
SAFEOPA /AG/ep
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OPA
β-mercaptoetanolo
Reagente OPA
(tossicità derivante
da metanolo al 2%)
R25
R34
R43
R50
R23/24/25
R38
R41
R43
R48/22
R50/53
R40
R43
H301
H314
H317
H400
H301 + H331
H310
H315
H317
H318
H373
H410
H302
H312
H332
H317
SAFEOPA /AG/ep
S26
S36/37/39
S45
S61
S23-45
P273
P280
P301 + P310
P310
P261
P273
P280
P301 + P310
P302 + P350
P305 + P351
+ P338
P260
P280
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Etichette della miscela
Miscela: SDS 20% v/v
Preparato il:
Da:
Scade il:
Frasi di rischio:
Consigli di prudenza:
H319, H315, H335
P260, P280
Questo reagente può essere irritante per pelle, occhi e apparato respiratorio.
Non respirare. Evitare il contatto con la pelle.
Miscela: Reagente OPA
Preparato il:
Da:
Scade il:
Frasi di rischio:
Consigli di prudenza:
H302, H312, H332, H317
P260, P280
La miscela è nociva se ingerita, se a contatto con la pelle e se inalato. Può
provocare una reazione allergica cutanea. Evitare il contatto con la pelle.
Non respirare.
SAFEOPA /AG/ep
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