L’immunofenotipo leucocitario:
utilità diagnostica
Roberto Caporale
Pistoia, 29 ottobre 2011
Bernard Shoor & Leonard Herzenberg
at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers
1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow
(FACS-1)
Sistema FACSCanto II
BD Biosciences
Microscopia
in fluorescenza
Citometria
Citometria a Flusso (CFM)
La CFM consente l’analisi automatica di sospensioni
cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche
fisiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare
che interseca una sorgente di eccitazione
FOCALIZZAZIONE IDRODINAMICA
LASER
sheath fluid
campione
Generazione dei segnali di “scatter”
Rifrazione & Riflessione:
proporzionale alla granularità cellulare e alla
complessità rilevate a 90° rispetto la luce
incidente.
SSC
GRANULOCITI
MONOCITI
FSC
LINFOCITI
Diffrazione:
proporzionale alle dimensioni
della cellula rilevata lungo
l’asse della luce incidente 0°
La combinazione dei due tipi di segnali
permette di ottenere un particolare diagramma
di dispersione denominato
CITOGRAMMA
nel quale si possono evidenziare fino a
5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base
alle sole caratteristiche fisiche
Sottopopolazioni leucocitarie in sangue periferico
-Citogramma -
COMPLESSITA’ 
EOSINOFILI
NEUTROFILI
MONOCITI
LINFOCITI
BASOFILI
VOLUME 
Immunofenotipizzazione cellulare
- definizione -
Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla
quantificazione ed alla localizzazione di strutture
cellulari per mezzo di reagenti immunologici
(anticorpi monoclonali).
Pubblicazioni
123328 references
(2010)
1st
Crescita delle applicazioni diagnostiche in citometria a flusso
Requisiti per una buona
analisi citometrica
• Esperienza dell’operatore
• Valutazione delle prestazioni e della stabilità della
strumentazione
• Controlli di qualità (IQC, VEQ, EQAS)
Riproducibilità dei parametri di fluorescenza
Linfoma Follicolare - diagnosi
Linfoma Follicolare - MMR
Materiali idonei per indagini in CFM
Liquidi:
Solidi:
•Sangue periferico
•Linfonodi
•Aspirati Midollari
•Biopsie
•Leucaferesi
•Agoaspirati
•Liquor
•Liquidi cavitari
Regole per una corretta analisi citometrica
in onco-ematologia
•
•
•
•
Quesito diagnostico (dialogo con i clinici)
Caratteristiche del campione da analizzare
Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali
Regolazione dello strumento e “compensazione” delle
fluorescenze
• Strategie di “gating” per il riconoscimento delle popolazioni
cellulari da analizzare
• Integrazione con i laboratori di morfologia, citogenetica e
biologia molecolare
• Formulazione di una risposta adeguata e conclusiva
Metodo di studio in citometria
• Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue
midollare
• Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti
• Dimostrazione della presenza nel campione
anormali
di cellule
• Eventuale dimostrazione della loro clonalità
• Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di
identificare una determinata entità nosografica e/o utili
per lasciare una traccia in corso di follow-up (MMR)
Espressione del CD45 nei leucociti
Sangue Periferico vs Sangue Midollare
Sangue
periferico
Sangue
midollare
Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER
MATURAZIONE MIELOIDE: granulocitopoiesi
stem cell
CD34
CD13
CD33
CD66c
CD66b
CD11c
CD11b
CD11a
CD16
CD64
CD15
Blasto
mieloide
promieloc
ita
Mielo cita
Meta
mielocita
granulo
cita
MATURAZIONE MIELOIDE
monocitopoiesi
stem cell
CD34
CD13
CD33
CD36
CD64
CD11b
CD14
Blasto
mieloide
promonoc
ita
Mono cita
MATURAZIONE MIELOIDE: variabili di espressione
100
CD13
CD11b
CD16
CD10
0
PROMIELO
MIELO
METAMIELO
CD64
GRAN
Interpretazione su CD66b/CD11b
Maturazione Mieloide
Interpretazione su CD66b/CD11b
BM normale
Sindrome mielodisplastica
+ mature
immature
blasti
blocco maturativo
CD13
CD11b
Maturazione mieloide in BM normale
CD16
CD10
CD11b
CD16
CD64
CD15
CD11b
CD13
Maturazione mieloide in BM con MDS
CD16
CD16
CD10
CD11b
R4
CD64
CD15
Maturazione mieloide in BM con MDS
Maturazione monocitaria in BM con
LMMC
Mean values of bone marrow leucocyte populations
Cell count
34.5 x 106 cell/ml (SD 28.0)
Erythroid
10.8% (SD 5.7)
Lymphocytes
12.4% (SD 5.9)
CD3 61.4% (SD 15.1)
CD4 29.3% (SD 11.3)
CD8 30.8% (SD 13.1)
NK
11.2% (SD 9.2)
CD19 18.9% (SD 14.0)
CD19+10+ 43.10% (SD28.6) CD19+20+ 45% (SD28.9)
Monocytes (CD14)
3.2% (SD 1.5)
CD34+ cells
0.9% (SD 0.7)
Whole myeloid serie
72.2% (SD 8.7)
Immature/blast
3.6% (SD 2.1)
Promyelocytes
12.3% (SD 6.3)
Myelo and metamyelo
28.4% (SD 11.4)
band and mature
48.9% (SD 15.5)
Eosinophils
1.9% (SD 1.5)
Plasmacells
0.4% (SD 0.3)
A. Santagostino
CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/
CD11b PE-Cy7/CD117 APC/CD45 APC-Cy7
Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER
NORMALE
MDS
MDS ABNORMALITIES BY FCM
• Hypogranulation of PMN
84%
• CD11b/CD16
abnormal
70%
• CD13/CD16
abnormal
78%
• CD64+
granulocytes
66%
• CD10-
granulocytes
11%
• CD45-dim
blasts
53%
• CD56+
granulocytes
21%
• CD56+
monocytes
33%
• My-cells expressing non-My Ags
38%
Stetler-Stevenson, Blood 2001
CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/
CD11b PE-Cy7/CD56 APC/CD45 APC-Cy7
PROFILO ANTIGENCO
Maturazione linfoide B
stem cell
CD34
TdT
CD79a
CD19
CD10
CD20
CD22
cµ
SmIg
Cellula
pre-pre B
Cellula
pre B
nucleare
citoplasmatico
citoplasmatico
Cellula
B
Maturazione linfoide B
CD20 FITC/CD10 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/
CD38 PE-Cy7/CD19 APC/CD45 APC-Cy7
Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative
CD22 FITC/CD200 PE/ CD19 PerCP-Cy5.5 /
CD5 PE-Cy7/ CD23 APC /CD45 APC-Cy7
MCL
CLL
Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative
Kappa FITC/Lambda PE/ CD20 PerCP-Cy5.5
/ CD38 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7
MCL
CLL
Presenza o assenza di marcatori nelle
M. Linfoproliferative
MCL
CLL
Espressione di ZAP-70 nelle CLL
VALUTAZIONE HCL
CD103 FITC/CD11c PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 /
CD25 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7
VALUTAZIONE
T-LDGL
CD57 FITC/CD5 PE/ CD3 PerCP-Cy5.5 /
HLA-DR PE-Cy7/ CD8 APC /CD45 APC-Cy7
ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI
CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK
pattern atteso in una popolazione policlonale
CD158b
CD158a
ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI
CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+
pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità
CD158b
CD158b
CD158a
CD158b
CD158a
CD158b
CD158a
CD158a
ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a
E CD158b SULLE CELLULE NK
pattern atteso in una popolazione policlonale
pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità
VALUTAZIONE PLASMACELLULE
PARAMETRI INDAGATI
CD19 CD138
CD38
CD56 FSC / SSC
debole presente Brillante
assente
assente presente
presente
Ridotta
IPOTESI DIAGNOSTICA
↑↑
↑↑↑
plasmacellule normali
plasmacellule trasformate
Immunofenotipo plasmacellule normali
Combinazione MoAb
FITC
PE
PerCP-Cy5.5
PE-Cy7
APC
APC-H7
HV-450
1
CD138
CD117
CD20
CD38
CD56
CD45
CD19
Immunofenotipo plasmacellule trasformate
Combinazione MoAb
FITC
PE
PerCP-Cy5.5
PE-Cy7
APC
APC-H7
HV-450
1
CD138
CD117
CD20
CD38
CD56
CD45
CD19
Immunofenotipo plasmacellule trasformate
• CD19-CD56• CD19-CD56+
Plasma cells: normal vs clonal
Normal & reactive
MGUS
CD38 +++
CD138 ++
k&l
(polyclonal)
Myeloma
CD38 +++/++
CD138 ++
CD38 ++
CD138 ++
k &/or l
CD56-/+
(monoclonal in a
proportion of
CD19-/+
PCs)
CD20-
CD56CD19+
CD20CD45+
CD117-
k or l
(monoclonal)
CD19CD20-
CD45+/CD117-
CD38 +++
CD138 ++
k&l
CD56-
(polyclonal)
CD19+
CD20CD45+
CD117-
CD56++
CD45CD117-/+
CD38 ++
CD138 ++
k or l
(monoclonal)
CD56++
CD19-
CD20CD45CD117-/+
Clonal
Ocqueteau et al, AJP 152,1655,1998
MM: dimostrazione di monoclonalità
Immunofenotipi plasmacellulari
IF1
IF2
% PC=15%
IF3
% PC=19%
IF4
% PC=5%
IF1
IF2
IF3
IF4
CD19
+
+
-
-
CD56
-
-
+
-
% PC
<0.4
>0.4
NS
NS
62%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
21%
12%
5%
IF1
IF2
IF3
IF4
fattori prognostici in CFM
CD45
CD20
CD117
CD56
CD38
IF1
IF2
IF3
IF4
TOT IF
CD20+
/
CD38dim
/
CD5618
3
13
2
CD45/
3
5
2
12
CD117+
/
1
31
10
9
2
11
15
10
33
42
Nuovi targets per la terapia contro il MM
Presenza di PC-MM su Sangue periferico:
SANGUE MIDOLLARE MM
SANGUE PERIFERICO MM
SANGUE PERIFERICO NORMALE
Malattia Minima Residua
A
DIAGNOSI
B
MMR
Sensibilità strumentale = 1/10000
Conclusioni (I)
Utilità della citofluorimetria nel paziente affetto da MM:
• distingue tra plasmacellule normali, reattive e patologiche
• determina eventuali fattori prognostici
• identificare nuovi targets per la terapia contro il mieloma
• un’elevata sensibilità nel valutare la MMR
• possibilità di evidenziare PC-MM anche su sangue periferico
Conclusioni (II)
• L’analisi multiparametrica multicolore consente una
maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni
cellulari.
• E’ necessario applicare buone procedure di validazione
strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei
reagenti.
• L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella
esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa
impensabili.