Università degli Studi “ROMA TRE”
Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali
Dipartimento di Scienze Biologiche
Corso di Laurea di Primo Livello in Scienze Biologiche
TESI di LAUREA
“Chemiotassi verso sostanze aromatiche tossiche in batteri utili
per processi di biorisanamento ambientale”
Relatori
Laureando
Prof.ssa Elisabetta Zennaro
Stefano Catarci
Dott.ssa Livia Leoni
ANNO ACCADEMICO
2004-2005
La chemiotassi batterica
● Si definisce chemiotassi il movimento di avvicinamento di un
organismo verso una sostanza chimica definita attraente
(chemiotassi positiva) o il movimento di allontanamento da una
sostanza chimica definita repellente (chemiotassi negativa)
● Si distinguono due tipologie di motilità batterica:
➢
Motilità flagello-dipendente
➢
Motilità flagello-indipendente
● Il movimento flagello-dipendente è caratterizzato dall’alternarsi
di due azioni distinte:
➢
➢
l’avanzamento (movimento definito “running”)
il capovolgimento (movimento definito “tumbling”).
La chemiotassi batterica
Schematizzazione del movimento batterico
(da http://www.thewiper.com/cellula/)
La chemiotassi batterica
• I flagelli batterici sono eliche rigide la cui direzione di avvitamento
sinistrorsa comporta:


La loro unione in un fascio quando ruotano in senso
antiorario,
determinando
l’avanzamento
della
cellula
(“running”)
La loro dispersione quando ruotano in senso orario,
provocando il capovolgimento della cellula (“tumbling”)
(da http://www.cfdrc.com/bizareas/biomedlife/comp_med/chemotaxis.html)
La chemiotassi batterica
TRASDUZIONE DEL SEGNALE
Il legame del repellente
stimola l'autofosforilazione
di CheA
Molecola repellente
Methyl-accepting
Chemotaxis
Protein
Rotazione
antioraria
del flagello
(running)
Istidin chinasi
La chemiotassi batterica
TRASDUZIONE DEL SEGNALE
CheA-P trasferisce il gruppo
fosfato su uno specifico residuo
di aspartato di CheY
Molecola repellente
Methyl-accepting
Chemotaxis
Protein
Rotazione
antioraria
del flagello
(running)
Istidin chinasi
Regolatore di
risposta associato
a CheA
La chemiotassi batterica
TRASDUZIONE DEL SEGNALE
CheY-P interagisce con FliM
determinando l'inversione di
rotazione flagellare
Molecola repellente
Methyl-accepting
Chemotaxis
Protein
Rotazione
oraria del
flagello
(tumbling)
Istidin chinasi
Regolatore di
risposta associato
a CheA
Proteina FliM
(interruttore del
motore flagellare)
La chemiotassi batterica
TRASDUZIONE DEL SEGNALE
CheZ è responsabile
della defosforilazione di CheY
Molecola repellente
Methyl-accepting
Chemotaxis
Protein
Rotazione
antioraria
del flagello
(running)
Istidin chinasi
Regolatore di
risposta associato
a CheA
Fosfatasi
La chemiotassi batterica
TRASDUZIONE DEL SEGNALE
Legame dell’ attraente
con il chemiorecettore
Methyl-accepting
Chemotaxis
Protein
Rotazione
antioraria
del flagello
Istidin chinasi
(running)
Proteina FliM
(interruttore del
motore flagellare)
La chemiotassi batterica
CheR metila costantemente
il dominio citoplasmatico delle
MCPs
Methyl-accepting
Chemotaxis
Protein
Istidin chinasi
ADATTAMENTO SENSORIALE
Metilesterasi
Metiltransferasi
Proteina FliM
(interruttore del
motore flagellare)
La chemiotassi batterica
La sovrametilazione di MCP
determina l’autofosforilazione
di CheA
Methyl-accepting
Chemotaxis
Protein
Istidin chinasi
ADATTAMENTO SENSORIALE
Metilesterasi
Metiltransferasi
Proteina FliM
(interruttore del
motore flagellare)
La chemiotassi batterica
CheA-P esibisce attività chinasica
anche verso la proteina CheB
Methyl-accepting
Chemotaxis
Protein
Istidin chinasi
ADATTAMENTO SENSORIALE
Metilesterasi
Metiltransferasi
Proteina FliM
(interruttore del
motore flagellare)
La chemiotassi batterica
CheB-P demetila il dominio
citoplasmatico delle MCPs
Methyl-accepting
Chemotaxis
Protein
Istidin chinasi
ADATTAMENTO SENSORIALE
Metilesterasi
Metiltransferasi
Proteina FliM
(interruttore del
motore flagellare)
La chemiotassi e la bioremediation
Ceppo batterico
Pseudomonas
putida G7
Numerose evidenze sperimentali
indicano che i batteri
biodegradatori sono
chemiotatticamente attratti
verso inquinanti ambientali.
Pseudomonas
putida PRS2000
Attrattori
riconosciuti
Recettore
proteico
Localizzazione del
gene del recettore
Salicilato
Naftalene
Bifenile
Benzoato
NahY
Plasmide NAH7
Sconosciuto
Sconosciuto
4-idrossi benzoato
PcaK
pca cluster
m-toluato
Sconosciuto
Sconosciuto
p-toluato
Sconosciuto
Sconosciuto
Salicilato
Sconosciuto
Sconosciuto
3-clorobenzoato
Sconosciuto
Sconosciuto
4-clorobenzoato
Sconosciuto
Sconosciuto
DL-mandelato
Sconosciuto
Sconosciuto
β-fenilpiruvato
Sconosciuto
Sconosciuto
Benzoilformato
Sconosciuto
Sconosciuto
Sconosciuto
Sconosciuto
Toluene
Benzene
Etilbenzene
Pseudomonas
putida F1
Isopropil benzene
cis-1,2-DCE
TCE
PCE
Naftalene
α,α,α-Trifluorotoluene
La chemiotassi verso il toluene in
Pseudomonas putida F1
In una prima fase di questo studio
sono state esaminate le risposte
chemiotattiche verso il toluene di
5 specie batteriche in grado di
degradarlo:
●
●
●
●
●
Pseudomonas putida F1 (PpF1),
Pseudomonas putida PaW15
Burkholderia cepacia G4
Ralstonia pickettii PKO1
Pseudomonas mendocina KR1
Ognuna di queste cinque specie
presenta diverse reazioni iniziali delle
vie per il catabolismo del toluene.
(da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)
La chemiotassi verso il toluene in
Pseudomonas putida F1
( da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)
La risposta chemiotattica al toluene di questi cinque ceppi è stata
studiata con il metodo dell’ ”AGAROSE PLUG ASSAY”.
(I ceppi sono stati coltivati in presenza di toluene)
- P. putida F1, R. pickettii PKO1 e B. cepacia G4 mostrano una
chiara risposta chemiotattica al toluene
- Una debole risposta è stata osservata in P. putida PaW15
- Nessuna risposta verso il toluene è stata invece osservata in
P. mendocina KR1
La chemiotassi verso il toluene in
Pseudomonas putida F1
( da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)
Conclusioni:
- Non tutti i ceppi che degradano il toluene presentano una
risposta chemiotattica verso questo composto
- Solo le cellule cresciute in presenza di toluene mostrano
una risposta chemiotattica verso questo composto
La chemiotassi verso il toluene in
Pseudomonas putida F1
“CAPILLARY ASSAY”
(da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)
Risposta chemiotattica di P. putida F1 verso il toluene in
funzione del tempo (ingrandimento 40X)
(P. putida F1 è stato coltivato in presenza di toluene.)
Nessuna risposta è stata osservata quando il capillare
conteneva solo agarosio e il tampone chemiotattico.
La chemiotassi verso il toluene in
Pseudomonas putida F1
“CAPILLARY ASSAY”
(da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)
Conclusioni:
- P. putida F1 è attratto verso un determinato intervallo di
concentrazione del toluene
La chemiotassi verso il toluene in
Pseudomonas putida F1
“PLUG ASSAY”
Risposta chemiotattica
di P. putida F1,
cresciuto in presenza di
toluene, verso:
- Benzene
- Etilbenzene
- Propilbenzene
- ααα-trifluorotoluene
(TFT)
- tricloroetilene (TCE)
- cis-1,2-dicloroetilene
(DCE)
- percloro etilene
(PCE)
(da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)
La chemiotassi verso il toluene in
Pseudomonas putida F1
“PLUG ASSAY”
Il benzene,
l'etilbenzene e il TFT
sono degradati da
PpF1
I composti alifatici
alogenati quali il TCE,
il DCE e il PCE sono
biotrasformati da PpF1
(da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)
Ruolo dei geni tod nella chemiotassi
di Pseudomonas putida F1
( da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)
È stata analizzata la risposta chemiotattica al toluene di alcuni
mutanti nei geni tod di Pseudomonas Putida F1.
PpF4
PpF106
PpF39/D

F1todT::Km
F1todR::Km
ΔtodX
F1todX::Km

(mutanti in geni catabolici)
(mutante nel sistema regolativo)
(doppio mutante nei geni todR e todX)
(mutante nel gene per il trasporto del toluene)
Ruolo dei geni tod nella chemiotassi
di Pseudomonas putida F1
( da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)
Conclusioni:
- i mutanti catabolici dimostrano come la risposta chemiotattica
verso il toluene sia dipendente dal riconoscimento diretto della
molecola stessa e non di un suo intermedio catabolico
- la proteina di membrana implicata nel trasporto del toluene TodX
non è necessaria per la risposta chemiotattica verso il toluene
- i mutanti regolativi dimostrano come i geni richiesti per la risposta
chemiotattica al toluene siano controllati coordinatamente ai geni
per la degradazione del toluene da TodS e TodT in presenza di
toluene
Conclusioni
- La chemiotassi verso il toluene è indotta dalla crescita in presenza
di toluene
- La chemiotassi verso sostanze non utilizzate come fonte di
carbonio (caso del TCE) è probabilmente la conseguenza di un
bassa specificità di substrato del chemiorecettore del toluene
- L'analisi dei mutanti regolativi suggerisce l’esistenza di una
comunicazione incrociata tra il processo che regola la
chemiotassi e quello che regola l’espressione dei geni
catabolici, entrambi basati su analoghi meccanismi di
fosfotrasferimento
- La chemiotassi verso sostanze inquinanti potrebbe ricoprire un
ruolo determinante nella scelta di ceppi batterici utili per scopi
di biorisanamento
-