OR e CD
•OR Rotazione ottica (potere ottico rotatorio)
-Misura la quantità di rotazione ad una lunghezza d’onda fissa
•CD circular dichroism
-Misura la differenza di assorbimento della luce polarizzata
circolarmente a destra da quella polarizzata a sinistra a
differenti lunghezze d’onda
L’attività ottica
Filtro polarizzatore
Luce polarizzata:
Luce che vibra in un
solo piano (il vettore
campo elettrico)
Sorgente
luminosa
luce non polarizzata
Piano della
luce polarizzata
Polarimetro
Filtro polarizzatore
Tubo contenente
il campione
Filtro ruotante
Sorgente
luminosa
Piano della
luce polarizzata
Consente di stabilire la rotazione
del piano della luce polarizzata
Un enantiomero è un composto otticamente attivo
Il Polarimetro e il potere ottico rotatorio
Le Proteine e gli acidi Nucleici sono molecole chirali
•Perché tutti gli amminoacidi (escluso glicina) sono chirali
•Perchè la forma della proteina costituisce una macrostruttura
non sovrapponibile alla sua immagine speculare, quindi
chirale
Perciò tutte le proteine hanno una chiralità intrinseca e
interagiranno con la luce polarizzata
Lo strumento CD (Dicrografo)
Elettro-ottici polarizzatore e rivelatore
Campione
Monocromatore
Il segnale rilevato va ad
un elaboratore PC
Spettrometro CD, una immagine reale di uno strumento
Dicroismo circolare: il segnale rilevato
• Il Dicroismo circolare è la differenza tra la luce destra e
sinistra circolarmente polarizzata ed è misurata in
funzione della lunghezza d’onda
• La differenza tra l’assorbimento a destra e quello a
sinistra dà il dicroismo circolare
Significato del CD e struttura molecolare
•Spettri CD di proteine o acidi nucleici con strutture
secondarie differenti sono differenti
•Pertanto l’analisi di spettri CD dà importanti informazioni
sulla struttura secondaria di queste molecole
CD: unità di misura e sensibilità
• La differenza di assorbanza AL-AR è molto piccola
(generalmente do circa 0.0001 unità di assorbanza)
• Necessita di apparato di rivelazione molto sensibile ecco
perché uno strumento CD è più costoso di uno UV/VIS
• Questa differenza si misura in ellitticità molare r
La luce polarizzata
La luce è un'onda elettromagnetica che consiste in un campo elettrico E ed un
campo magnetico H oscillanti, che possono essere rappresentati da vettori
perpendicolari tra loro, e perpendicolari alla direzione di propagazione.
Il piano di polarizzazione è il piano su cui oscilla il campo elettrico E, ma poiché
una sorgente di luce è di solito composta da un insieme di emettitori disposti in
maniera casuale, la luce emessa è un insieme di onde con tutte le possibili
orientazioni del vettore E. La luce polarizzata linearmente, invece, è una
radiazione elettromagnetica in cui il vettore E oscilla in un solo ben preciso
piano di polarizzazione.
Può sembrare strano che la luce polarizzata possa essere considerata una
radiazione asimmetrica, in grado di interagire con due enantiomeri in maniera
differente. In realtà la direzione di propagazione della radiazione, quella del
vettore elettrico E e quella del vettore magnetico H costituiscono una terna di
vettori ortogonali non sovrapponibile alla sua immagine speculare.
La seguente animazione mostra come in una luce linearmente
polarizzata il vettore campo elettrico oscilla lunga una e una
sola direzione (quella z, nella figura) e perpendicolare all’asse di
propagazione (quello x).
Un osservatore situato sull’asse x vedrà il
vettore campo elettrico raggiungere un
massimo e poi diminuire fino a passare per
lo zero, cambiare verso, raggiungere un
minimo e poi ricrescere di nuovo. L’onda
sinusoidale rimane sempre confinata nel
piano xz e l’osservatore vedrebbe un vettore
oscillare lungo z.
Quando due onde piano polarizzate sono presenti simultameamente in
due piani perpendicalari, le proprietà dell’onda che ne risulta dipendono
dall’intensità e dalle fasi delle due onde componenti. La seguente
animazione mostra l’onda risultante dalla somma di due onde di stessa
intensità, frequenza, lunghezza d’onda e in fase ma polarizzate secondo
due piani perpendicalari (orizzontale per quella rossa e verticale per la
verde)
Il risultato della somma tra le due onde, è
un’altra onda piano polarizzata (quella azzurra)
con il piano di polarizzazione spostato di 45°
rispetto ai piani di polarizzazione delle due onde
originarie
Se le due onde non sono in fase (c’è una differenza di 90° tra le loro fasi)
l’onda elettromagnetica che ne risulta è circolarmente polarizzata. In
pratica il vettore campo elettrico E ruota con frequenza pari alla frequenza
della radiazione: il risultato è che la punta del vettore percorre una
traiettoria a spirale. L’onda si propaga quindi come una funzione che
descrive una traiettoria a spirale e non più sinusoidale
Se l’osservatore si pone lungo l’asse di
propagazione.
Cosa succede
sommate?
quando
due
onde
circolarmente
polarizzate
sono
Se le due onde hanno la stessa intensità, frequenza e lunghezza d’onda ma
sono rispettivamente circolarmente polarizzate destra e sinistra la luce che
ne risulterà sarà linearmente polarizzata.
Una radiazione polarizzata linearmente
va vista come la somma di due onde
polarizzate
circolarmente,
una
sinistrorsa e una destrorsa.
Cosa succede quando una radiazione
elettromagnetica interagisce con la materia?
parte della radiazione può essere assorbita
Può variare la velocità della radiazione
(tutti i materiali hanno un indice di
rifrazione!!!)
Assorbimento
Luce piano-polarizzata in un
mezzo che l’assorbe ma non la
rallenta. Come si può vedere
varia
solo
l’intensità
del
vettore campo elettrico
Luce circolarmente-polarizzata
in un mezzo che l’assorbe ma non
la rallenta. Anche in questo caso
varia solo l’intensità del vettore
campo elettrico
Luce polarizzata in un mezzo rifrangente
Luce piano-polarizzata in
un mezzo in grado di
rallentarla. La luce che ne
risulterà ha la stessa
frequenza
di
quella
incidente ma varierà nella
lunghezza d’onda (ln=c)
Stesso discorso per la luce
circolarmente-polarizzata
Cosa
succede
se
la
materia
assorbe
preferenzialmente una delle due componenti
(destra o sinistra) della luce linearmente
polarizzata?
Nella figura la le due componenti circolarmente polarizzate della luce
linearmente
polarizzata
sono
assorbite
differentemente:
la
circolarmente polarizzata destra (rossa) non è assorbita mentre la
circolarmente polarizzata sinistra (verde) è assorbita.
I vettori campo elettrico escono
dal mezzo con intensità differenti
e il vettore somma descrive una
traiettoria ellittica. La luce è
detta ellitticamente polarizzata.
Cosa
succede
se
la
materia
rallenta
preferenzialmente una delle due componenti
(destra o sinistra) della luce linearmente
polarizzata?
Nella figura le due onde si propagano con velocità differenti nel
mezzo e quindi usciranno dal campione l’una in ritardo rispetto all’altra
cioè fuori fase (nell’esempio la componente circolarmente polarizzata
sinistra (verde) è più rallentata.
Sommando settorialmente le due componenti si ottiene sempre una luce
linearmente polarizzata ma la direzione di polarizzazione sarà ruotata di un
angolo f rispetto alla direzione originale.
La differenza tra i due indici di rifrazione (nL-nR) è detta birifrangenza
circolare e l’angolo di deviazione è chiamato rotazione ottica.
F= 180 l (nL-nR) /l
F= F 100/cl
Per poter paragonare
campioni a differente
concentrazione è stata
definita la rotazione
molare.
Il Dicroismo circolare
Il dicroismo circolare è una tecnica di analisi strutturale simile alla
spettrofotometria in quanto è basata sull'assorbimento da parte del
campione di una radiazione UV o visibile. La differenza è che la
radiazione usata in questo caso è polarizzata circolarmente, e quella che
viene misurata è la differenza tra le assorbanze (De) riscontrate usando
come radiazioni incidenti radiazioni polarizzate circolarmente nei due
possibili versi orario e antiorario.
Il CD permette di trarre importanti informazioni su molecole chirali. Può
essere usato per determinare la configurazione assoluta di una molecola,
ma anche configurazioni relative e conformazioni. È inoltre una tecnica
molto più sensibile della polarimetria, e, diversamente che per
quest'ultima, il segno del De può essere sufficiente a trarre conclusioni
sulla configurazione assoluta della molecola per specifiche classi di
composti.
Lo spettro CD
Un cromoforo chirale, ma anche un cromoforo non chirale che si trovi in un
intorno chirale, può assorbire le luci polarizzate circolarmente destra e
sinistra in maniera diversa, cioè con assorbanze AD ed AS (e quindi anche
assorbanze specifiche molari eD ed eS) diverse. Uno spettro CD è un grafico
del dicroismo circolare, DA:
DA= AS-AD
o del dicroismo circolare molare, De:
De =eR-eS
in funzione della lunghezza d'onda. Uno spettro CD assomiglia quindi ad un
normale spettro UV, ma DA e De possono anche assumere valori negativi.
Naturalmente la relazione tra DA e De è ancora la legge di Lambert-Beer:
DA = De.l.d
dove l è espresso in cm e c è la concentrazione molare.
In generale ogni transizione elettronica che dà origine ad un assorbimento
UV/visibile dà anche origine ad una banda nello spettro CD, chiamata effetto
Cotton, il cui massimo (o il minimo per bande con segno negativo) si trova più o
meno alla stessa lunghezza d'onda del massimo di assorbimento UV/visibile. Lo
spettro CD è dato dalla sovrapposizione di bande positive e negative di questo
genere. Un esempio di spettro CD è mostrato in Figura. Come ci si può
aspettare da considerazioni di simmetria, gli spettri CD di enantiomeri sono
uguali, ma hanno segni opposti.
A volte il dicroismo circolare è espresso sotto forma di ellitticità molare. Se la
radiazione incidente sul campione è polarizzata linearmente, all'uscita del
campione le due componenti hanno intensità diverse e la radiazione diventa
polarizzata ellitticamente.
L'ellitticità y è definita come un angolo la cui tangente è uguale al rapporto tra
l'asse minore ed asse maggiore dell'ellisse, e va da 0° per una luce polarizzata
linearmente a 45° per una luce polarizzata circolarmente.
tangy=b/a
Tuttavia poiché la differenza di assorbanza è sempre molto piccola, anche
l'angolo y assume sempre valori piccoli (si possono misurare ellitticità di 1/1000
di grado), ed è quindi approssimativamente proporzionale alla concentrazione. Si
può allora definire una ellitticità molare []:
y
 =
l c
dove l è espresso in dm e c è la concentrazione decimolare, ossia espressa in
moli per 100 ml (o dmol/l; si notino ancora una volta le insolite unità di misura).
L'ellitticità molare [] è legata al dicroismo circolare molare dalla relazione:
  3300  De
Ellitticità molare []
deg cm2 mol -1
L’ellitticità può essere
convertita da radianti in
gradi mediante:
L’ellitticità molare [] è relazionata alla differenza tra i coefficienti e
Δε [] = 3298Δε
Lo spettrofotometro CD
Si usa invece una radiazione polarizzata linearmente prodotta da una lampada a Xeno (a),
molto potente (150-450 W). La radiazione passa poi attraverso il monocromatore (b),
che seleziona la lunghezza d'onda desiderata, e attraverso il filtro polarizzatore (c), che
la polarizza linearmente. Il cuore dello spettropolarimetro CD è il cosiddetto modulatore
elettro-ottico (d), costituito da un cristallo capace di far passare alternativamente la
componente destra o sinistra della luce polarizzata linearmente a seconda del campo
elettrico a cui è sottoposto. Il modulatore elettro-ottico è sottoposto ad un campo
elettrico alternato, per cui il campione (e) è attraversato alternativamente dalle
componenti destra e sinistra. Se le due componenti sono assorbite in maniera diversa, il
rivelatore (f) origina un segnale di intensità oscillante. L'ampiezza di questa oscillazione
permette di misurare il dicroismo circolare.
Exciton chirality
Può accadere che due cromofori, non chirali e non coniugati tra loro, siano
tuttavia disposti nello spazio in maniera chirale. In questo caso i due
cromofori generano un intenso spettro CD, caratterizzato da due bande di
segno opposto, una a lunghezza d'onda maggiore ("primo effetto Cotton")
ed una a lunghezza d'onda minore ("secondo effetto Cotton"). In questo
caso si parla di "bisignate CD" o "split CD" . Inoltre, per convenzione, il
segno dello split CD è definito dal segno del primo effetto Cotton: per
esempio se il primo effetto Cotton è positivo (e quindi il secondo è
negativo) la curva nel suo complesso è definita come positiva. Il fenomeno
in sé è chiamato con l'espressione inglese
"exciton coupling" (che
tradurremo accoppiamento tra i cromofori) e l'insieme di regole che mette
in relazione la stereochimica della molecola con lo spettro CD è detto
"metodo dell'exciton chirality".
Se i due cromofori sono uguali,
il centro delle due bande (dove
il De si annulla) corrisponde
approssimativamente al massimo
di assorbimento del cromoforo
mentre se i due cromofori
assorbono a lunghezze d'onda
nettamente diverse le due
bande
(sempre
di
segno
opposto) compaiono ognuna in
corrispondenza di un cromoforo.
L'utilità del metodo dell'exciton chirality deriva dal fatto che il segno dello
split CD è collegato in maniera molto semplice alla disposizione nello spazio dei
due cromofori. In un cromoforo, per ogni transizione elettronica può essere
definito un "momento di transizione" m, un vettore che descrive lo spostamento
di carica elettrica in seguito alla transizione. Consideriamo due cromofori i cui
vettori m non siano paralleli e non siano sullo stesso piano. In questo caso la
disposizione nello spazio dei due vettori è chirale (non è sovrapponibile alla sua
immagine speculare), ed
possibile definire una elicità del sistema di due
vettori. La elicità è definita come positiva, se andando dalla punta del vettore
più vicino all'osservatore alla punta del vettore più lontano ci si sposta in senso
orario, e negativa se ci si sposta in senso antiorario.
CD di polipeptidi
Il CD è una tecnica molto usata per lo studio conformazionale di peptidi e
proteine. Una catena polipeptidica è formata da tanti amino acidi legati
attraverso il legame peptidico. L’unico cromoforo presente è quello
associato al legame peptidico, cioè quello ammidico. Le due transizioni
possibili sono la n-p* a 210-230 nm e la p-p* a 180-200 nm. La prima
non è permessa per simmetria e quindi è caratterizzata da valori di e
molto piccoli (<100) mentre la seconda è più intensa.
La struttura secondaria di una catena polipeptidica può essere
fondamentalmente di 3 tipi: a-elica, foglietto b e b-turn. Gli spettri CD
consentono di distinguere tra queste tre differenti conformazioni .
-3
-1
2
[] X 10 , deg .cm .dmol
80
a-he lix
b-sheet
Type 1 turn
Random coil
Poly-L-proline (P2)
60
40
20
0
-20
-40
-60
190
200
210
220
230
Wa ve le ngth, nm
240
250
a-elica
La conformazione ad a-elica è la più comune in molte proteine soprattutto
quelle globulari. Uno spettro CD di un polipeptide ad a-alica è tipicamente
caratterizzato da una banda negativa a 222 nm dovuta alla transizione np* e da una banda negativa a 208 nm e una positiva a 198 nm relativa
all’exciton coupling delle transizioni p-p* del peptide.
80
[]
60
40
20
0
-20
-40
-60
190
200
210
220
l
230
240
250
Foglietto b
Le misure CD di polipeptidi con struttura secondaria di tipo b sono
complicate dalla scarsa solubilità del peptide stesso nel solvente solitamente
utilizzato per la misura e dalla possibilità che esistano catene parallele o
anti parallele.
In genere lo spettro CD mostra due assorbimenti uno positivo a 195 nm e
uno negativo a 216 nm, di comparabile intensità.
[]
80
A causa però della maggiore
variabilità conformazionale
della b struttura rispetto
alla a, i CD di polipeptidi a
struttura b sono molto
meno riproducibili di quelli
relativi
a
peptidi
a
struttura secondaria a e
dipendono fortemente dalla
lunghezza della catena e
dal solvente.
60
40
20
0
-20
-40
-60
190
200
210
220
230
240
l
250
b-turn
Le strutture secondarie definite b-turn sono quelle in cui la catena
peptidica va incontro ad una inversione della sua direzione. Le strutture di
questo tipo sono tipicamente presenti in polipeptidi ciclici ricchi di residui
di prolina. Gli spettri CD di queste strutture secondarie sono molto meno
informativi dei precedenti e possono essere a secondo dei casi simili a
quelli dei peptidi a conformazione di foglietto pieghettato o ad a-elica
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
-20
-20
-40
-40
-60
-60
190
200
210
220
230
240
250
190
200
210
220
230
240
250
Il CD di una proteina dipende dalla sua
struttura secondaria
—— chemotripsin (~tutta b)
—— lisozima ( a & b)
—— triosefosfate isomerasi
(perlopiù a e poco b)
—— mioglobina (a)
• Notare il progressivo cambiamento a 222 con
l’incrementare della struttura a elica
Gli spettri CD dipendono dalle condizioni
La temperatura è il parametro più critico
•
CD signals for GCN4-p1
O'Shea et al. Science (1989) 243:538
figure 3: 34mM GCN4-p1 in 0.15M NaCl,
10mM phosphate pH 7.0
80
70
[ in 1000 deg cm2dmol-1
60
0 OC
50 OC
75 OC
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
190
200
210
220
230
wavelength in nm
240
250
260
•
•
•
•
•
•
•
• 100% di elica a 0oC
• Diventa random coil
aumentando la t
44
IInfluenza delle catene laterali
EE’ chiaro che il cromoforo peptidico non è l’unico cromoforo presente in
una proteina. Ci sono infatti le catene laterali degli amminoacidi
aromatici (Phe, Try, Tyr) che mostrano i caratteristici assorbimenti del
cromoforo benzenico tra 250 e 300 nm.
LLa Phe mostra un picco di assorbimento intorno a 250 nm.
La Tyr ha un gruppo fenolico che assorbe a 280 nm per il ben noto
effetto auxocromo del gruppo OH. Un fattore caratteristico è
ovviamente la dipendenza dal pH del valore del massimo di assorbimento.
Infatti a pH basici si osserva un notevole effetto batocromico (295
nm).
Il Trp ha il cromoforo indolico che è responsabile di spettri CD ancora
più complessi, infatti sono presenti differenti transizioni nella zona tra
250-300 nm.
Un esempio sulle catene Peptidiche…
•Spettri molto differenti per una
–a-elica
–b- a pieghe (b sheet)
–“random coil” (struttura disordinata)
•I contributi sono additivi
–Si può determinare il contributo della struttura a
elica, della b a pieghe e del “random coil” mediante
misure CD del peptide in soluzione
Spettro CD
•Concentrazione della
proteina: circa 0.5 mg/mL
Lo spettro del collagene
Collagene
destrutturato
Collagene
nativa (elica)
La struttura della subtilisina ottenuta da dati CD e calcoli
al computer è in accordo con la struttura trovata da dati di
diffrazione di raggi X
58% helix
26% sheet
16% coil
La subtilisina è un enzima
proteolitico
B-DNA o modello a nastro:





3.4 Å tra le basi
dieci coppie per ogni giro d’elica
34 Å per ogni giro
Solco maggiore largo 22 Å
Solco minore largo 12 Å
Le strutture del DNA sono investigabili per CD
CD di DNA random coil e Duplex
CD di DNA quadruplex