Denaturata per aggiunta del riducente
ditiotreitolo
Riducente dializzato
Aggiunto glutatione ossidato
Processo fermato per aggiunta di iodoacetato
Che reagisce con cisteina formando
Carbossimetilcisteina
Proteina eluita e separati i diversi intermedi
Ponti 30-51 5-55 14-38
Scambio
ionico
I tre intermedi con due disolfuri non formano mai il terzo ma
si convertono lentamente nel 5-55 30-51 , sono intermedi non-nativ1
Che definiscono il cammino di ripiegamento
In loro assenza ( 14 38) la velocità di ripiegamento è fortemente
ridotta
Il ripiegamento è cooperativo
Esistono vie preferenziali al ripiegamento
Presenza di intermedi che non sono forme parziali di proteina
ripiegata, ma necessitano di riarrangiamento
L’intermedio 30-51 è una via obbligata si forma per primo
benchè non sia il disolfuro più stabile nella proteina nativa
I tre intermedi 30-51,5-14 30-51,5-38 30-51,14-38 non nativi
Definiscono una via obbligata alla formazione del native-like
30-51,5-55 lo step lento della reazione
Dove C’è un alta barriera energetica
k1
kex
Folded < = > open < = > H ex
k-1
kex>k-1 la rate di scambio è k1
kex<k-1 kexk1/k-1
Il dicroismo circolare (CD) viene osservato quando molecole
otticamente attive assorbono diversamente la luce
circolarmente polarizzata destra e sinistra.
Il dicroismo circolare (CD) viene osservato quando molecole
otticamente attive assorbono diversamente la luce
circolarmente polarizzata destra e sinistra.
a)  NMR exchange
b)  H exchange ESMS
c)  far UV CD ( 225 nm)
d)  near UV CD ( 289 nm )
e)  intrinsic fluorescence
f)  quenching by iodide
g)  binding of ANS
h)  binding fluorescent
Inhibitor
andamento bifasico. La fase rapida ha una costante di tempo dell’ordine
di 5/10 millisecondi ed un ampiezza media del 40% e del 25% per il
dominio α e β rispettivamente.
in questa proteina, il ripiegamento del dominio β
non può avvenire in assenza di quello del
dominio α, mentre non è vero il contrario
dicroismo circolare nel lontano ultravioletto diagnostico di percentuale
struttura secondaria
CD vicino ultravioletto processo monofasico, indicativo
Riarrangiamento aromatici
Cinetica di ripiegamento monitorata attraverso la fluorescenza
Intrinseca andamento bifasico
Cinetica di ripiegamento monitorata attraverso il quenching di
fluorescenza.
Cinetica di legame dell’ANS
anilinonaphthalene sulfonate
Cinetica di legame di un inibitore fluorescente.
Collasso idrofobico iniziale
più vie di ripiegamento, in quanto
l’ordine di assemblaggio delle
diverse strutture secondarie non
È identico
Processo rapido
i
IDENTIFICAZIONE DEGLI STATI DI TRANSIZIONE E DEGLI
INTERMEDI NEL PROCESSO DEL FOLDING
A. Fersht JMB 1992
IPOTIZZARE CATENE IMPORTANTI PER LA STABILITà O
LA CINETICA DI RIPIEGAMENTO
MODIFICARE LA CATENA PER MUTAGENESI
DETERMINARE DA MISURE DI EQUILIBRIO E DI CINETICA
IL PROFILO DI ENERGIA PER LA PROTEINA NATIVA E MUTATA
VALUTARE IL PARAMETRO Φ DAI VALORI DI ENERGIA
MISURATI
Effettuare singola mutazione e
verificare la differenza di energia libera
sia da un punto di vista termodinamico
che cinetico
FEBS Lett.
1993 325 5-16
J.M.B.
1992 224 771
ΔΔGU-F = ( GU- GF ) – (GU’ - GF’ )
equilibrio
ΔΔG#-F= ( G#- GF ) – (G#’ - GF’ )
velocità
Φunf = (ΔG#- ΔGF ) / (ΔGu- ΔGF )
ΔΔG#-F / ΔΔGU-F
Φ unf= 1 ΔG# = ΔGu regione mutazione in transizione come in denaturata
Φunf = 0 ΔG# = ΔGF regione mutazionein transizione come in ripiegata
PNAS 1994 91 10422-10425
Inibitore chimotripsina
Non ci sono siti con
Φfol = 1 in cui regione mut.
Ha stato trans. Come in nativa
Ovvero siti di
nucleazione
Ripiegamento con collasso globale assenza regioni preferenziali
formazione di alcuni elementi
di struttura secondariache in
seguito si assemblano tra di loro
Ci sono siti di nucleazione
Φfol = 1
Un modello di ripiegamento
•  La topologia è l’elemento determinante il folding infatti:
•  Grandi cambi nella sequenza sia sperimentali che
evoluzionistici, che non alterano la topologia della proteina
hanno un basso effetto sulla velocità di folding
•  Proteine con struttura 3D simile e sequenze differenti hanno
stati di transizione di ripiegamento simili
•  Proteine con una grossa frazione di contatti tra residui vicini in
sequenza ( basso ordine di contatto) si ripiegano più
rapidamente che proteine con molti contatti non-locali ( alto
ordine di contatto)
• 
Baker Nature 2000 405 39-42
ORDINE DI CONTATTO è LA DISTANZA MEDIA IN SEQUENZA TRA TUTTE LE
COPPIE DI RESIDUI IN CONTATTO NORMALIZZATA ALLA LUNGHEZZA
TOTALE DELLA SEQUENZA
CO =
Σ Δ SIJ
LN
Δ S = SEPARAZIONE IN SEQUENZA
L = NUMERO TOTALE RESIDUI
N = NUMERO TOTALE CONTATTI
•  Il costo entropico nel formare contatti non
locale è alto
•  la stabilita di una proteina e il meccanismo di
ripiegamento sono determinati dalla sequenza
aminoacidica, tuttavia la stabilità è sensibile ai
dettagli delle interazioni inter-atomiche, mentre il
meccanismo di ripiegamento è più sensibile alla
topologia
•  Modelli semplici basati su rappresentazioni
binario del polipeptide predicono abbastanza
bene le vie del ripiegamento
•  La proteina precursore della betaamiloide è una grande proteina di
membrana che normalmente gioca
un ruolo importante nella crescita e
nella riparazione dei neuroni. .
La APP può essere tagliata in una
serie di frammenti funzionali da
alcune proteasi specializzate,
chiamate secretasi.
Il piccolo peptide è chiamato
peptide beta-amiloide. Nella
proteina intera il peptide si estende
attraverso la membrana ancorando
la proteina. Ma quando, in seguito
all'idrolisi, il peptide diventa libero,
lascia la membrana, cambia forma
e si aggrega in lunghe fibrille.