CENNI STORICI
1898-1903 D. Trebot Day, geologo americano, separò alcuni idrocarburi utilizzando
colonne di farina fossile
fossile.
1903-1906 M. Tswett, botanico russo, separò una serie di pigmenti colorati presenti in
un estratto di foglie verdi utilizzando CaCO3 ed etere di petrolio; coniò anche
il nome cromatografia che significa "scrittura
scrittura mediante il colore
colore".
1930-1931 R. Kuhn e E. Lederer utilizzarono la cromatografia per la separazione di
carotenoidi e xantofille.
1938
N A Izmailov e M.S.Shaiber
N.A.
M S Shaiber descrissero per la prima volta la cromatografia
su strato sottile
1941
A.J.P. Martin e R.L.M. Synge presentarono il primo lavoro sulla
ccromatografia
o atog a a d
di ripartizione.
pa t o e Essi
ss introdussero
t odusse o la
a teo
teoria
a de
dei p
piatti
att basata su d
di
un'analogia con la teoria della distillazione e dell'estrazione controcorrente.
1952
A.J.P. Martin e R.L.M. Synge ebbero il premio Nobel per la chimica per lo
sviluppo
pp della cromatografia
g
di ripartizione
p
g
gas-liquido.
q
1956
J.J.van Deemter sviluppò la teoria della separazione cromatografica.
1958
E.Stahl mise a punto la tecnica della cromatografia su strato sottile.
1966
Inizia lo sviluppo della moderna tecnica della cromatografia in fase liquida ad
alta prestazione.
Definizione Cromatografia
definizione IUPAC (International Union of Pure
pp
Chemistry)
y)
and Applied
"Metodo usato primariamente per la separazione dei componenti
di una miscela; i componenti vengono distribuiti tra due fasi una
d ll qualili è fifissa mentre
delle
t l'l'altra
lt è mobile.
bil L
La ffase stazionaria
t i
i può
ò
essere un solido, o un liquido supportato su di un solido, o un gel.
La fase stazionaria può essere impaccata in una colonna
colonna, sparsa
come uno strato, o distribuita come un film. La definizione "letto
cromatografico"
g
è usata come termine g
generale per denotare una
qualsiasi delle varie forme in cui può essere usata la fase
stazionaria.”
Q i di lla cromatografia
Quindi
t
fi è una ttecnica
i di separazione
i
b
basata
t sulla
ll
migrazione differenziata delle sostanze da separare attraverso
due fasi tra loro immiscibili
CS = conc. fase stazionaria
CM = conc. fase mobile
Gas Chromatography
A
E
G
Gas
Chromatograph
D
B
C
Sample: mixture of
volatile liquids (~1L)
Gas Chromatogram
B
E
C
Abundance
A
D
0
5
10
Time (minutes)
15
20
Gas Chromatograph
Injection Port
Detector
Capillary Column
Data System
or Recorder
Carrier Gas
Supply
Oven
Basic Principles of Gas Chromatography
Instrumentation
 Injection Port - Sample introduction
Manual - Direct Injection
Instrumentation - Oven
Temperature Control
• Isothermal
• Gradient
240
Temp (deg C)
200
160
120
80
40
0
0
10
20
30
Time (min)
40
50
60
Columns
• Packed
•
Capillary
Polarity
Non-polar
Polar
+
Phases
Instrumentation - Detectors
Destructive
• Flame Ionization (FID)
• Electrolytic
El t l ti C
Conductivity
d ti it (H
(Hall/ELCD)
ll/ELCD)
• Mass Spectral (CI/EI)
• Nitrogen
Nitrogen-Phosphorus
Phosphorus (NPD)
Instrumentation - Detectors
Non Destructive
Non-Destructive
• Thermal Conductivity (TCD)
• Electron Capture
p
((ECD))
• Photo Ionization (PID)
(
)
DETECTORS
Flame Ionization Detector (Nanogram - ng)
High temperature of hydrogen flame (H2 +O2 +
N2) ionizes compounds eluted from column into
flame. The ions collected on collector or
electrode and were recorded on recorder due to
electric current.
Schematic Diagram
g
of Flame Ionization Detector
Exhaust
Chimney
Igniter
Collector Electrode
Polarizing Electrode
Hydrogen
Inlet
Column
Effluent
Schematic Diagram of Flame Ionization Detector
Collector
Detector electronics
 - 220 volts
Flame
Chassis ground
Jet
Column
Signal output
Thermal Conductivity Detector
Measures the changes of thermal conductivity
due to the sample (g). Sample can be
recovered.
d
Thermal Conductivity
y Basics
When the carrier gas is contaminated by
sample
, the cooling effect of the
gas changes.
changes The difference in cooling
is used to generate the detector signal.
Flow
F
Flow
F
The TCD is a nondestructive,
concentration sensing detector. A
heated filament is cooled by the flow of
carrier gas
.
Thermal Conductivity Detector
Thermal Conductivity Detector
Th
Thermal
lC
Conductivity
d ti it D
Detector
t t
• Responds to all compounds
• Adequate sensitivity for many compounds
• Good linear range of signal
• Simple construction
• Signal quite stable provided carrier gas glow rate,
block temperature, and filament power are controlled
• Nondestructive detection
Mass Spectrometer
Spect omete
Sample
Introduction
Data
Output
Inlet
Ion
Source
Data
System
Mass
Analyzer
Vacuum
Pumps
Ion
Detector
Electron Impact
Ionization Source
~70 Volts
Electron Collector (Trap)
Positive
Ions
+
Neutral
Molecules
Repeller
Inlet
+
+
e-
Filament
e_
_
_
+
+
+
eElectrons
Extraction
Plate
+
+ to
Analyzer
Magnetic
g
Sector Mass Analyzer
y
ion trajectory
in register
ion trajectory
not in register
(too light)
S
Detector
Ion
Source
N
Electromagnet
ion trajectory
not in register
(too heavy)
Quadrupole Ion Filter
resonant ion
non-resonant ion
_
Detector
+
+
_
Ion
Source
DC and AC
Voltages
Mass Spectrometry
O
H3C
C
N
C H3
N
C
C H
C
C
N
N
H
O
Mass
Spectrometer
Typical sample: isolated
compound (~1 nanogram)
194
Mass Spectrum
67
109
55
82
42
136
94
40
60
80
100
120
Mass (amu)
140
165
160
180
200
Tempo di ritenzione (tR): è il tempo che intercorre fra l’iniezione del campione
e la rivelazione di un analita eluente dalla colonna
Tempo morto (tM): è il tempo che un analita non ritenuto sulla fase stazionaria (che
quindi viaggia alla stessa velocità della fase mobile) impiega per giungere al rivelatore
Analisi qualitativa
Fissate le condizioni della separazione
p
cromatografica
g
(tipo
( p di colonna, flusso della fase mobile,
natura della fase stazionaria) una particolare sostanza potrà essere riconosciuta dal suo tempo di
ritenzione. (Confrontandolo con quello nelle banche dati).
Analisi quantitativa
L’area sottesa al ppicco cromatografico
g
è pproporzionale
p
alla qquantità di analita ((e quindi
q
alla sua
concentrazione). Si calcola in modo approssimativo moltiplicando l’altezza del picco per la base a
metà altezza.
Risoluzione di una separazione
cromatografica (Rs)
La risoluzione dà una misura
quantitativa dell’efficienza di una
colonna cromatografica nella
separazione di due analiti:
Una separazione cromatografica deve
tendere al massimo valore possibile di
Rs (e che sia almeno pari ad 1.5 per
qualunque coppia di picchi adiacenti)
Composizione dell’olio
dell olio di oliva
Dall punto
D
t di vista
i t chimico,
hi i
l’ li di oliva
l’olio
li
è suddivisibile
ddi i ibil in
i due
d
f i i a
frazioni,
seconda del comportamento a caldo in presenza di una base forte (NaOH
o KOH):
 Saponificabile,
S
ifi bil formata
f
t da
d sostanze
t
i grado
in
d di formare
f
saponii nelle
ll
condizioni citate
citate;; questa frazione corrisponde al 98
98--99%
99% del totale e
comprende trigliceridi, digliceridi e monogliceridi, i cui acidi sono per
ll’l’85
85%
85
% insaturi (acido oleico e linoleico) e per il 15
15%
% saturi (acido
palmitico, stearico)
 Insaponificabile, formata da microcomponenti che non formano saponi
n ll condizioni
nelle
c ndizi ni citate
cit t ; anche
citate;
nch se
s è presente
pr s nt in quantità
qu ntità modeste
m d st (1-2%
circa) questa frazione è importantissima da un punto di vista
nutrizionale e analitico, per controllare la genuinità dell'olio e per la sua
serbevolezza
Frazione insaponificabile
I componenti principali sono
sono::
 Idrocarburi (30 - 40%
40%) tra cui lo squalene
 Cere, presenti in minima quantità
à
 Steroli, presenti in notevoli quantità
 Alcoli,
Alcoli in piccolissime quantità alcoli alifatici e in quantità
maggiori alcoli triterpenici
 Pigmenti colorati, come carotenoidi e clorofilla
 Vitamine liposolubili, provitamina A, vitamina C, D, E ed F
 Polifenoli, sotto forma di glucosidi e di esteri
 Altri composti più o meno volatili
volatili:: alcoli,
alcoli aldeidi,
aldeidi esteri,
esteri chetoni
alifatici e aromatici
La qualità dell’olio
dell olio d’oliva
d oliva
•
•
Gli aspettii principali
i i li che
h caratterizzano
i
l qualità
la
li à dell’olio
d ll’ li di oliva
li
sono i caratteri organolettici, la stabilità all’ossidazione, l’assenza
di contaminanti (fitofarmaci, solventi) e, naturalmente, le
caratteristiche nutrizionali espresse in termini di acidi grassi saturi,
monoinsaturi e polinsaturi, presenza di fitosteroli, vitamine ed
antiossidanti naturali
Come per ogni prodotto di trasformazione agroalimentare, il pregio
dell’olio consiste, quindi, nel mantenimento e nell’esaltazione delle
caratteristiche proprie della materia prima di origine,
origine ossia delle
olive. È impossibile produrre un olio buono partendo da una
materia prima scadente, nemmeno utilizzando i più sofisticati
procedimenti
di
ti di estrazione
t i
Analisi sull’olio
sull olio d’oliva
d oliva
Le analisi che vengono effettuate sui campioni di olio si dividono in tre categorie:



analisi che accertano la qualità dell'olio:
dell'olio: sono i saggi di acidità, dei perossidi, l'analisi UV, la
composizione acidica, la composizione sterolica, il contenuto di solventi alogenati e l’analisi
gascromatografica;;
gascromatografica
analisi
che
accertano
la
conservabilità dell'olio
dell'olio:: numero di
perossidi, analisi UV, acidità, panel
test, tempo di induzione
induzione;;
analisi che accertano la genuinità
dell'olio::
dell'olio
composizione
acidica,
sterolica, analisi UV, analisi dei
solventi alogenati, differenza ECN
42 HPLC e ECN 42 calcolo teorico
I parametri analitici determinati
sull’olio e le tecniche utilizzate sono
descritti nel regolamento CEE n.
2568/
2568
/91 e successive modifiche
Parametri analitici importanti
I principali
i i li parametrii determinati
d
i i sull’olio
ll’ li sono i seguenti:
i







Acidità libera – la quantità di acidi grassi liberi (non esterificati)
Num r di perossidi
Numero
p r ssidi – la
l potenzialità
p t nzi lità ossidativa
ssid tiv di un olio
li
Polifenoli – la quantità totale di composti polifenolici
Tocoferoli – la quantità di composti aventi struttura analoga alla
vitamina E
Acidi grassi dei gliceridi – indice di genuinità e tipicità
Steroli
li – utile
il per accertare sofisticazioni
fi i
i i
Parametri UV – per identificare adulterazioni con altri oli
Acidità libera
Questa analisi esprime la percentuale di acidi grassi liberi presente nel prodotto.
Gli acidi liberi si riscontrano soltanto dopo l'estrazione dell'olio dal frutto, poiché all'interno del
frutto sono neutri. Essi derivano come prodotto di alcune reazioni innescate da enzimi lipolitici,
durante la maturazione del frutto o a causa di una cattiva conservazione del frutto. Proprio per
questo motivo l'analisi dell'acidità viene considerata come parametro per stabilire la qualità di
un olio di oliva
Dal punto di vista analitico si tratta di una titolazione
acido--base effettuata in soluzione organico con
acido
idrossido di potassio come titolante e fenolftaleina
come indicatore
indicatore.. Convenzionalmente,
Convenzionalmente ll’acidità
acidità è
espressa come percentuale di acido oleico anche se è
dovuta a numerosi composti
La presenza elevata di questi acidi grassi liberi
(superiori al 3-4%) rende un olio non commestibile
poiché avrebbero un'azione irritante sulla mucosa
gastroenterica oltre che una sgradevole sensazione
in bocca
I sistemi
sist mi di trasporto
t sp t e di stoccaggio
st
i delle
d ll olive
li
possono alterare il valore di acidità, se risultano
essere promotori di processi di fermentazione
fermentazione.. Per
questo motivo, devono essere minimi i tempi che
interc rr n fra la raccolta
intercorrono
racc lta dei frutti e la loro
l r
lavorazione
Acidi grassi
L'importanza
L importanza della determinazione
analitica dei grassi è dovuta al fatto
che da una sola procedura viene
ricavata una notevole quantità di
parametri,
che
sono
peraltro
specifici, cioè corrispondono a
singoli componenti chimici presenti
in un olio.
olio. La composizione acidica
può rappresentare quindi un indice
di genu
d
genuinità
n tà e tipicità
t p c tà d
di un ol
olio
o
Gli acidi grassi sono presenti nell’olio
in forma libera, meno desiderabile,
oppure in forma esterificata con la
glicerina nei gliceridi, la materia
nobile dell’olio di oliva che ne
costituisce circa il 98
98%
%
Acidi
grassi
nell’olio
nell
olio
La maggior parte degli acidi grassi è a catena lineare con un numero pari
di atomi di carbonio
carbonio.. Possono essere presenti doppi legami (acidi insaturi);
se c’è
’è più
iù di un doppio
d
i legame
l
(fi a 6) sii parla
(fino
l di polieni
li i; cii sono anche
h
tripli legami
Oltre alla catena lineare più o meno insatura, possono esserci gruppi
f
funzionali
l sostituenti come cheto
h
(
(=CO),
) idrossi
d
(-OH),
) epossi (-O-)
presenti naturalmente o indotti da processi tecnologici
Alcuni acidi grassi sono specifici di determinate piante (erucico,
petroselinico) e quindi la loro identificazione è indice di adulterazione
H3C(CH2)16COOH
H3C(CH2)6
H3C(CH2)3
H3C
(CH2)6COOH
(CH2)6COOH
(CH2)7COOH
Acido stearico (C18
(C18,, o doppi legami)
Acido oleico (C18, 1 doppio legame)
Acido linoleico (C18, 2 doppi legami)
A id linolenico
Acido
li l i (C18, 3 doppi
d
i legami)
l
i)
Determinazione degli acidi grassi
La determinazione degli
g acidi g
grassi esterificati è eseguita
g
mediante GC
GC..
Gli acidi grassi dei gliceridi vengono trasformati, mediante
transesterificazione, nei rispettivi esteri metilici, che presentano una
maggiore volatilità ed una minore polarità rispetto ai corrispondenti acidi
liberi;; i gliceridi hanno invece scarsa volatilità
liberi
à
Gli acidi grassi metilati vengono iniettati in colonna e separati come tali.
tali.
Questa determinazione fornisce quindi la composizione acidica in esteri
metilici anzichè in acidi liberi
liberi;; in pratica, la differenza tra le due
composizioni è abbastanza piccola e comunque tutti i valori tabulati di
riferimento sono basati sui metilati, quindi non si ha alcuna incertezza di
attribuzione
b
L'identificazione dei singoli acidi avviene mediante cromatogrammi
eseguiti su standard
Acidi nell’olio
nell olio di oliva
La