UNIVERSITA’ POLITECNICA DELLE MARCHE
Facoltà di Medicina e Chirurgia
DOTTORATO DI RICERCA in
Patologie Immunometaboliche, Degenerative, e Infettive
X° Ciclo
Coordinatore: Chiar.mo Prof. P.E.Varaldo
CARATTERIZZAZIONE DEI
GLICOSAMINOGLICANI URINARI:
APPLICAZIONE DI NUOVE METODICHE ALLA
DIAGNOSI E AL FOLLOW-UP DELLE
MUCOPOLISACCARIDOSI
Relatore:
Chiar.mo Prof. Orazio Gabrielli
Dottoranda:
Dr.ssa Lucia Santoro
ANNO ACCADEMICO 2011- 2012
Alle mie adorate figlie
INDICE
1. INTRODUZIONE…………………………………………………………….…..1
2. LE MUCOPOLISACCARIDOSI…………………………………………………..3
2.1.a. Mucopolisaccaridosi tipo I……………………………………………....6
2.1.b. Mucopolisaccaridosi tipo II……………………………………………..8
2.1.c. Mucopolisaccaridosi tipo III…………………………………………......9
2.1.d. Mucopolisaccaridosi tipo IV…………………………………………….9
2.1.e. Mucopolisaccaridosi tipo VI……………………………………………11
2.1.f. Mucopolisaccaridosi tipoVII……………………………………………11
2.1.g. Mucopolisaccaridosi tipo IX…………………………………………...11
2.2 Diagnosi…………………………………………………………………..12
2.3 Terapie attuali……………………………………………………………..14
2.4 Terapie future………….………………………………………………….16
3. I GLICOSAMINOGLICANI…………………………………………………….18
3.1 Catabolismo dei glicosaminoglicani………..…….……………………….25
3.2 Analisi dei glicosaminoglicani…….……..……………………………….26
4. SCOPO DELLO STUDIO………………………………………………………...30
5. MATERIALI …………….……………………………………………………….32
5.1 Pazienti……………………………………………………………………32
6. METODI……………………………………………………………………….…33
6.1 Metodo al DMB ……….……..…………………………………………...33
6.2 Elettroforesi su acetato di cellulosa………………….................................34
6.3 Dosaggio delle esosamine……..………………………………….………36
6.4 Metodo dei disaccaridi…………………………………………………….38
7. RISULTATI………………………………………….........................................…40
7.1 DMB………………………………………………………………………40
7.2 Elettroforesi su acetato di cellulosa……………………………………….41
7.3 Dosaggio delle esosamine mediante CE & HPLC ……………………….42
7.4 Metodo dei disaccaridi……………………………………………………54
8. DISCUSSIONE………………………………………......................................….69
9. CONCLUSIONI…………………………………..................................................78
10.BIBLIOGRAFIA……………………………………… ………………………...79
Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
1.INTRODUZIONE
Le Malattie Rare vengono spesso diagnosticate in ritardo quando oramai si sono
verificati danni irreversibili agli organi, rendendo le terapie, laddove disponibili, assai
meno efficaci. D’altro canto tali patologie sono caratterizzate sovente da andamento
progressivo ed ingravescente e possono quindi essere controllate o arrestate tanto
meglio quanto più precocemente diagnosticate, anche in assenza di un’evidente
sintomatologia. E’questo il caso delle Mucopolisaccaridosi: malattie rare dovute
all’accumulo lisosomiale di glicosaminoglicani e causate da uno specifico deficit
enzimatico che ne compromette la corretta degradazione.
Dal punto di vista clinico una diagnosi precoce ed accurata di mucopolisaccaridosi
(MPS) è quindi necessaria per ottimizzare l’esito del trattamento, prevenendo così
danni cellulari irreversibili, in particolare nelle forme soggette a trattamento con
nuovi ed efficaci approcci terapeutici quali la terapia enzimatica sostitutiva (ERT).
Inoltre, una valutazione accurata del follow-up di trattamento con l’impiego di
markers affidabili potrebbe aumentare l’efficacia di trattamento, attraverso una
migliore definizione di dosaggi e tempi, dando origine ad una terapia
“personalizzata”.
Ne consegue che è fondamentale creare quanto prima i presupposti per un piano di
screening neonatale esteso a tutta la popolazione dei nuovi nati. Questa necessità è
ancora più impellente se si considera che le moderne terapie di sostituzione
enzimatica sono efficaci se attuate sin dalle prime settimane di vita del neonato.
L’obiettivo di questo lavoro è quello di proporre dei nuovi metodi semplici,
affidabili, non invasivi, riproducibili ed economici per la diagnosi ed il follow-up
delle diverse forme di MPS.
Dal punto di vista sperimentale è stato ideato un protocollo di determinazione
qualitativa e quantitativa dalle esosamine contenute nelle urine mediante due
1 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
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differenti metodologie: Elettroforesi Capillare in UV e HPLC in fluorescenza. I
risultati ottenuti con entrambi i metodi confermano l’esistenza di una correlazione tra
concentrazione di esosoamine urinarie e contenuto in glicosaminoglicani. Inoltre è
stata impiegata una procedura d’analisi già nota, la misurazione dei disaccaridi con
HPLC in UV, ma mai applicata sinora allo studio dei glicosaminoglicani umani. Tale
procedura analitica viene applicata, al monitoraggio della terapia al fine di
ottimizzarne l’efficacia.
Sono stati analizzati campioni di soggetti controllo e di pazienti affetti da vari tipi e
forme di mucopolisaccaridosi, seguiti presso la Clinica Pediatrica dell’Università di
Ancona. Lo studio è stato condotto in parte presso il Laboratorio di Diagnosi e
Prevenzione delle Malattie Metaboliche di Ancona ed in parte presso il Laboratorio
di Biochimica del Dipartimento di Biologia dell’Università di Modena e Reggio
Emilia.
Trattasi di un progetto collaborativo di ricerca dal carattere di forte innovatività
scientifica e dagli utilissimi risvolti sulla pratica clinica.
2 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
1.1. LE MUCOPOLISACCARIDOSI
Le Mucopolisaccaridosi (MPS) rappresentano un gruppo di patologie rare (Ic 1:
25.000 nati vivi [1] da accumulo lisosomiale causate dal deficit di enzimi che
catalizzano la degradazione dei glicosaminoglicani (mucopolisaccaridi). A seconda
del tipo di deficit enzimatico può essere bloccata o ostacolata la degradazione del
dermatansolfato, dell'eparansolfato, del cheratansolfato, del condroitinsolfato e
dell'acido ialuronico, singolarmente o in combinazione.
Sono noti 11 enzimi carenti che danno origine a sette forme distinte di
Mucopolisaccaridosi come indicato nella tabella che segue.
Mucopolisaccaridosi
Difetto
Eponimo
MPS -osi I H
α-L-Iduronidasi
Hurler
MPS -osi I S
α-L-Iduronidasi
Scheie
MPS -osi I H/S
α-L-Iduronidasi
Hurler/Scheie
MPS -osi II
Iduronato sulfatasi
Hunter
MPS -osi III A
Eparan-N-sulfatasi
Sanfilippo A
MPS -osi III B
α-N-Acetil-glucosaminidasi
Sanfilippo B
MPS -osi III C
Acetil-CoA:α -glucosaminide Sanfilippo C
acetiltransferasi
MPS -osi III D
N-Acetilglucosamina-6-
Sanfilippo D
solfatasi
MPS -osi IV A
N-Acetilgalattosamina-6solfatasi
3 Morquio A
Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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MPS -osi IV B
β-Galattosidasi
Morquio B
MPS -osi VI
N-Acetilgalattosamina - 4 – Maroteauxsolfatasi (Arilsolfatasi B)
Lamy
MPS -osi VII
β-Glucuronidasi
Sly
MPS -osi IX
Ialuronidasi
Le mucopolisaccaridosi, come la stragrande maggioranza delle malattie lisosomiali,
sono malattie genetiche ereditarie che si trasmettono con modalità autosomica
recessiva (Fig. 1), fatta eccezione per la malattia di Hunter o MPS II che è X-linked.
Fig.1. Schema di trasmissione autosomica recessiva
Le manifestazioni cliniche che caratterizzano le diverse MPS sono essenzialmente
correlate alla quantità e al tipo di sostanza accumulata, da cui in genere prende
origine la denominazione delle malattie. La conseguenza
di tale deficit è un
accumulo intracellulare di glicosaminoglicani cui consegue una disfunzione cellulare,
tissutale, d’organo ed un’anomala escrezione urinaria degli stessi. Dal momento che i
lisosomi sono contenuti in tutte le cellule dell’organismo, fatta eccezione per i globuli
4 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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rossi, il difetto metabolico si verifica contemporaneamente a carico di vari organi e
apparati. I neonati MPS sono asintomatici, sebbene l’accumulo inizi nel periodo
fetale formando le basi patologiche [2]. Come tutte le malattie d’accumulo anche le
mucopolisaccaridosi sono progressive, ad esordio variabile nei primi anni di vita ed
accomunate da alcune caratteristiche cliniche quali tratti grossolani del volto,
macrocrania, ipostaturalità, anomalie scheletriche, epatosplenomegalia, ritardo
mentale, opacità corneale e sordità, reperti clinici non presenti in tutte le forme. Un
grave ritardo mentale è presente nella Mucopolisaccaridosi IH (Sindrome di Hurler),
nella forma grave di Mucopolisaccaridosi II (Sindrome di Hunter), e in tutti i sottotipi
di Mucopolisaccaridosi III (Sindrome di Sanfilippo), mentre negli altri tipi
l'intelligenza può rimanere normale. Le lesioni ossee della Mucopolisaccaridosi IV
(Sindrome
di
Morquio)
sono
specifiche
di
questo
disordine.
lisosoma
nucleo
Cellula normale
lisosoma
Cellula con accumulo
Fig.2. A sn schema di cellula con accumulo. A dx interessamento multiorgano nelle mucopolisaccaridosi
5 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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MUCOPOLISACCARIDOSI TIPO I (S. di HURLER, S. di SCHEIE, S. di
HURLER/SCHEIE)
La Mucopolisaccaridosi tipo I è dovuta al difetto dell’enzima α-L-iduronidasi.
Ne esistono tre varianti che si distinguono a seconda della gravità: la sindrome di
Hurler che è la forma più grave, la sindrome di Scheie la più lieve e la sindrome di
Hurler-Scheie che presenta un fenotipo intermedio. La S. di Hurler/Scheie e la S. di
Scheie sono anche dette forme “attenuate”.
Il deficit di α-L-iduronidasi può determinare tre quadri clinici differenti, ma che sono
un continuum di segni e sintomi di gravità variabile in base alle mutazioni del gene
responsabile della malattia. La S. di Hurler e la S. di Scheie rappresentano le due
estremità, rispettivamente la forma più grave e quella meno grave dello spettro
clinico, mentre la S. di Hurler/Scheie presenta un fenotipo intermedio.
La Mucopolisaccaridosi I/H (S. di Hurler), si manifesta già a partire dal primo anno
di vita con manifestazioni cliniche caratteristiche, quali una facies lievemente
grossolana, la presenza di un’ernia inguinale e/o ombelicale e di una modesta epato6 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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splenomegalia. Verso la fine del primo anno i lineamenti del volto diventano sempre
più marcati, incomincia a manifestarsi un ritardo neuromotorio, l’epatosplenomegalia
è più marcata, la cute ispessita ed iniziano a comparire le limitazioni alle grandi
articolazioni. Il quadro clinico si completa tra il 2° e il 3° anno di vita, periodo in cui
la facies assume il caratteristico aspetto a “mascherone di fontana” con macrocrania,
sopracciglia marcate, ipertricosi, radice del naso infossata, narici larghe e anteverse
con corizza mucopurulenta costante, labbra ispessite, macroglossia . Frequentemente
è possibile osservare anche turbe del circolo liquorale con conseguente idrocefalo. A
carico dell’occhio è presente un’opacità corneale evidenziabile con l’esame della
lampada a fessura nelle fasi iniziali e alla semplice ispezione nelle fasi più avanzate
della malattia; anche la funzione uditiva si riduce con il tempo. Il torace si deforma
per la comparsa di una cifosi dorso-lombare progressivamente ingravescente e
l’addome è voluminoso per la marcata epato-splenomegalia e per l’ipotonia della
parete addominale. Con il tempo compaiono generalmente soffi cardiaci per
l’accumulo di glicosaminoglicani sui lembi valvolari. La motilità articolare si riduce
progressivamente, determinando atteggiamenti in semiflessione degli arti, mentre le
mani assumono il caratteristico aspetto ad “artiglio”. La crescita staturale si riduce
notevolmente e l’insieme delle anomalie scheletriche configura il quadro denominato
“disostosi multipla”. Il ritardo mentale è molto grave. L’exitus si verifica entro la
prima decade di vita.
La Mucopolisaccaridosi I/S (S. di Scheie) è un’affezione molto rara, ad esordio
tardivo; infatti raramente viene diagnosticata in età pediatrica. I segni clinici sono
rappresentati da modeste limitazioni articolari, specie alle mani con associata la
sindrome del tunnel carpale, lieve epatomegalia ed opacità corneale; il quadro clinico
si completa generalmente in epoca adolescenziale; non è presente ritardo mentale né
deficit staturale; i lineamenti del volto possono essere solo lievemente dismorfici,
mentre frequente è l’interessamento valvolare cardiaco, specie aortico. La prognosi è
buona, la maggior parte dei pazienti raggiunge l’età adulta avanzata.
7 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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La Mucopolisaccaridosi IH/S (S. di Hurler/Scheie) si caratterizza per un fenotipo
intermedio fra le due forme sopra descritte; la malattia si manifesta nella seconda
infanzia ed evolve lentamente, consentendo una sopravvivenza che si aggira tra i 20 e
i 30 anni. L’infiltrazione dei GAGs può verificarsi a vario livello: nel sistema
liquorale intracranico, provocando idrocefalo ostruttivo e/o nella dura madre del
tratto spinale, comportando compressione del midollo che può causare paresi spastica
se non corretta tempestivamente con intervento neurochirurgico. Il coinvolgimento
neurochiurgico, o quantomeno un adeguato follow-up neuroradiologico, si rendono
necessari per il frequente riscontro nelle mucopolisaccaridosi tipo I e IV di ipoplasia
del dente dell’epistrofeo con conseguente instabilità della cerniera cervicale nei
movimenti di flesso-estensione.
Dal punto di vista laboratoristico si osserva l’escrezione urinaria di eparan-solfato e
dermatan-solfato dovuta al deficit dell’enzima α-L-iduronidasi dosato sui leucociti o
fibroblasti in coltura. L’analisi molecolare del gene localizzato sul cromosoma 4
(4p16.3) consente di confermare la diagnosi.
MUCOPOLISACCARIDOSI II (S. di HUNTER)
E’ l’unica mucopolisaccaridosi
a trasmissione diaginica; l’enzima carente è la
iduronato-2-solfatasi. Clinicamente si distingue una forma grave ed una lieve; i
sintomi della forma grave compaiono generalmente intorno al primo anno di vita e
raggiungono la piena espressività a 3-4 anni. L’affezione si caratterizza per i
lineamenti
grossolani
del
volto,
la
bassa
statura,
la
rigidità
articolare,
l’epatosplenomegalia, saltuariamente noduli sottocutanei ed un ritardo mentale grave.
La disostosi multipla è meno accentuata che nella mucopolisaccaridosi I ed è assente
l’opacità corneale. La progressione è lenta e l’exitus sopraggiunge intorno ai 15-20
anni di vita. Nella forma lieve non è presente o è molto lieve il ritardo mentale; i
problemi maggiori sono quelli a carico dell’apparato cardiocircolatorio e uditivo.
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Dal punto di vista laboratoristico si osserva l’escrezione urinaria di eparan-solfato e
dermatan-solfato dovuta al deficit dell’enzima iduronato-2-solfatasi dosato sui
leucociti o fibroblasti in coltura.
L’analisi molecolare del gene localizzato sul cromosoma X (Xq27-28) consente di
confermare la diagnosi.
MUCOPOLISACCARIDOSI III ( S. di SANFILIPPO)
E’ la forma più frequente di mucopolisaccaridosi ed è dovuta a quattro distinti difetti
enzimatici, tutti coinvolti nella degradazione dell’eparan-solfato.
Dal punto di vista clinico, si caratterizza principalmente per il ritardo mentale rapido
e progressivo associato a lievi dimorfismi facciali; per quest’ultimo motivo spesso la
diagnosi viene formulata tardivamente. La manifestazione clinica predominante è il
ritardo mentale grave associato a lieve dimorfismi facciali. Lo sviluppo psicomotorio
è per lo più normale; successivamente si assiste ad un rallentamento, un arresto ed
infine ad una regressione più o meno rapida associata ad un’iperattività notevole che
rende molto difficile la gestione di questi pazienti. Lo stadio finale è caratterizzato da
demenza profonda spesso associata a convulsioni, atetosi e quadriplegia spastica.
L’exitus si verifica intorno ai 15-20 anni. Sono stati riportati in letteratura rari casi
con sintomatologia lieve. Gli esami di laboratorio mostrano un’escrezione urinaria di
eparan-solfato ed il dosaggio dell’attività enzimatica sui leucociti o fibroblasti in
coltura mostra un deficit di uno dei seguenti enzimi: eparan-N-solfatasi, α-Nacetilglucosaminidasi, acetil-CoA-alfa-glucosaminide-acetiltransferasi, N-acetil-alfaglucosamino-6-solfatasi. I geni sono stati localizzati rispettivamente sul cromosoma
17q25.3, 17q21, 8p11.1 e 12q14.
MUCOPOLISACCARIDOSI IV (S. di MORQUIO)
La malattia, caratterizzata da una displasia scheletrica e dall’escrezione urinaria di
cheratan-solfato, può essere determinata da due differenti difetti enzimatici: la
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galattosamina-6-solfatasi
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(Mucopolisaccaridosi
IV
A)
e
la
β-galattosidasi
(Mucopolisaccaridosi IV B). Le prime manifestazioni cliniche si osservano fra i 18 e
i 24 mesi e comprendono il ritardo dell’accrescimento ed i segni iniziali della
displasia ossea (valgismo delle ginocchia, protrusione dello sterno con conseguente
deformazione della gabbia toracica, cifosi o scoliosi dorso-lombare). Il quadro clinico
è completo intorno ai 4-6 anni. La testa, di dimensioni generalmente normali,
incassata fra le spalle per la presenza del collo corto, contrasta con la restante parte
del corpo; la facies è tipica con profilo piatto, naso corto, radice insellata, bocca
ampia e mento prominente . Sono presenti anche opacità corneali, modesta riduzione
uditiva e soffio cardiaco per coinvolgimento valvolare. Le grandi articolazioni sono
voluminose e con mobilità limitata, mentre quelle metacarpo-falangee ed
interfalangee sono iperestensibili (segno della “doppia nocca”). Lo sviluppo staturale
è gravemente compromesso con un’altezza definitiva che si attesta tra i 115 e120 cm.
Le due forme (A e B) sono pressoché analoghe, fatta eccezione per una espressività
in genere meno severa della forma B.
Fig. 3. Pazienti affetti da MPS tipo IV o Sindrome di Morquio
La diagnosi di laboratorio si basa sulla valutazione dell’escrezione del
cheratansolfato nelle urine e sulla dimostrazione del deficit dell’attività enzimatica
sui leucociti o fibroblasti; è possibile l’indagine molecolare di entrambi i geni
10 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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codificanti i due diversi enzimi, localizzati nella regione 16q24.3 e 3p21.33
rispettivamente.
MUCOPOLISACCARIDOSI VI (S. di MAROTEAUX-LAMY)
L’affezione, causata dal deficit dell’arilsolfatasi B, ricorda per caratteristiche cliniche
e radiologiche la s. di Hurler, fatta eccezione per l’assenza nei pazienti affetti da
mucopolisaccaridosi VI del ritardo mentale. Di frequente riscontro è la
compromissione cardiaca per interessamento valvolare. Il dosaggio urinario dei
mucopolisaccaridi evidenzia una aumentata escrezione di dermatan-solfato e la
diagnosi si basa sulla determinazione dell’attività enzimatica e sull’indagine
molecolare del gene codificante l’arilsolfatasi B, mappato a livello del cromosoma 5
(5q11-5q13).
MUCOPOLISACCARIDOSI VII (S. di Sly)
Questa affezione è dovuta al deficit dell’enzima -glucuronidasi.
I pochissimi casi descritti (circa 40) mostrano una variabilità della storia naturale
rapportata alla gravità del quadro clinico; esistono, infatti, le forme ad esordio in
epoca prenatale che si manifestano con idrope fetale e che causano spesso la morte in
utero, le forme ad esordio in epoca neonatale associate a dismorfismi, ernie,
epatosplenomegalia, disostosi, ipotonia e deficit neurologici che residuano in grave
deficit cognitivo e bassa statura nei rari casi che sopravvivono ed infine le forme ad
esordio in età adolescenziale o adulta che vengono scoperte a seguito di
presentazione con cifosi toracica. La diagnosi differenziale è con le altre forme di
mucopolisaccaridosi e con le oligosaccaridosi.
MUCOPOLISACCARIDOSI IX (S. di Natowicz)
Questa affezione è dovuta al deficit dell’enzima ialuronidasi ed un solo paziente è
stato riportato in letteratura con manifestazioni cliniche caratterizzate essenzialmente
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da bassa statura e tumefazioni dolorose periarticolari e segni clinici quali ugola bifida
e palatoschisi submucosale.
La diagnosi di laboratorio è basata sulla dimostrazione del deficit enzimatico,
rispettivamente -mannosidasi e -mannosidasi, effettuato su fibroblasti o leucociti.
2.2. DIAGNOSI
Certamente non è facile orientarsi in questo complesso gruppo di affezioni, dal
momento che le mucopolisaccaridosi presentano forme cliniche differenti per epoca
d’insorgenza, entità, progressione dei sintomi, e diversa compromissione dei vari
organi ed apparati [3].
Tali segni sono spesso sfumati nei primi due anni di vita, rallentando la diagnosi e
compromettendo l’efficacia di una eventuale terapia.
Di fondamentale importanza per la diagnosi sono un’accurata anamnesi familiare e
l’attento esame clinico: il quadro clinico può però non essere evidente in fase
precoce, specie in varianti lievi [3]. Il sospetto clinico è sempre e comunque il punto
di partenza per l’avvio alle corrette indagini strumentali, biochimiche e molecolari
del paziente. I progressi della biochimica, l’identificazione dei geni coinvolti, lo
studio delle neuroimmagini, in particolare della risonanza magnetica, hanno portato
all’identificazione di sempre più pazienti.
Nel sospetto di una malattia lisosomiale, esiste la possibilità di eseguire alcune
indagini semplici e rapide di prima istanza:
12 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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- lo striscio di sangue periferico, che può dimostrare la presenza di linfociti
vacuolati o cellule midollari con accumulo all’interno;
- una radiografia dello scheletro, che può evidenziare un quadro di disostosi
multipla (sella a omega, coste a remo, vertebre a martello, metacarpi tozzi,
grave gibbo dorso-lombare);
- un esame oftalmologico, per verificare la presenza di eventuale opacità
corneale, atrofia ottica o macchia rosso ciliegia;
- consulenze specialistiche (odontoiatrica, otorinolaringoiatrica ecc).
13 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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La diagnosi definitiva infine si ottiene con l’individuazione del substrato accumulato
e la dimostrazione di uno specifico difetto enzimatico. La caratterizzazione del
materiale accumulato si attua mediante campioni di urine, con il dosaggio ed indagine
elettroforetica dei glicosaminoglicani.
Il dosaggio degli enzimi lisosomiali si esegue essenzialmente sui
leucociti e
fibroblasti in coltura.
La diagnosi biochimica deve, infine, essere confermata dall’indagine molecolare.
Tale tipo di analisi molecolare può essere eseguita anche su villi coriali e amniociti,
consentendo un efficace counseling genetico ed una precisa diagnosi prenatale.
Le nuove prospettive terapeutiche per alcuni difetti rendono indispensabile una
diagnosi precoce.
2.3. TERAPIE ATTUALI
La prognosi nella maggior parte delle mucopolisaccaridosi è assai severa sia in
termini di mortalità sia in termini di morbilità, per cui vi è sempre stato un notevole
impegno nell’individuare una terapia in grado di modificare la storia naturale di tali
affezioni [3]. Le attuali possibilità terapeutiche sono il trapianto di cellule staminali
emopoietiche e la somministrazione dell’enzima carente ricombinante.
Il razionale del trapianto di midollo (Fig. 4) è rappresentato dalla possibilità di fornire
ai malati una fonte costante e consistente dell’enzima mancante. I monociti circolanti
derivanti dalle cellule del donatore fuoriescono dai vasi, colonizzano i diversi organi
ed apparati dell’ospite, trasformandosi in macrofagi e quindi producendo l’enzima
14 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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carente.
Fig. 4. Il razionale del trapianto di midollo osseo nelle mucopolisacaridosi
Attualmente l’indicazione al trapianto esiste per la s. di Hurler: nel 1991
l’International Society for the Correction of Genetic Disease by Transplantation ha
proposto precisi criteri d’eleggibilità al trapianto per i pazienti, ovvero età inferiore
ai 3 anni, quoziente intellettivo superiore a 70, disponibilità di donatore HLA
compatibile.
La terapia enzimatica sostitutiva (ERT) è stata introdotta per la prima volta agli inizi
degli anni ’90 per la malattia di Gaucher tipo I; le altre malattie lisosomiali per le
quali oggi è impiegata con successo sono la mucopolisaccaridosi I, II, VI, per le quali
si assiste ad una modificazione del fenotipo della malattia con correzione o drastica
riduzione dei GAGs urinari, una normalizzazione dell’epatosplenomegalia e un
miglioramento della mobilità articolare, in assenza di effetti collaterali. Recentemente
il Nostro Centro ha pubblicato i risultati dei primi 5 anni di follow-up del più giovane
paziente al mondo affetto da MPS I H/S che ha iniziato terapia in fase pre-clinica
poiché fratello di affetta con diagnosi posta e che ad oggi non ha alcun segno di
malattia
[4].
Purtroppo
gli
enzimi
ricombinanti,
essendo
macromolecole
glicoproteiche, non passano la barriera ematoencefalica e ciò li rende inefficaci per
le mucopolisaccaridosi con interessamento del sistema nervoso centrale.
15 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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E
F
Fig. 5. A) Paziente M a 5 mesi di vita B) Paziente F a 5 mesi di vita, 4 anni prima della diagnosi C) Paziente
M a 5.5 anni, 5 anni dopo l’inizio della terapia D) Paziente F a 5 anni, appena prima di iniziare terapia E)
Paziente M oggi F) Paziente F oggi
2.4. TERAPIE FUTURE
Per quel che concerne le prospettive terapeutiche nelle malattie lisosomiali incluse le
mucopolisaccaridosi di recente è stata valutata l’efficacia di farmaci in grado di
inibire la sintesi delle macromolecole su cui agiscono gli enzimi lisosomiali o
deprivazione di substrato, attualmente in uso in pazienti con sfingolipidosi ( malattia
di Gaucher e Niemann Pick tipo C ) e proposto per la MPS II [5]. Ancor più
recentemente è stato osservato un ruolo di stimolazione dell’attività enzimatica
residua da parte di piccole molecole che avrebbero un effetto stabilizzante o
favorente il folding (cioè il ripiegamento) corretto sulle proteine mutate. Questo
effetto è stato definito chaperone-mediated enzyme enhancement. Questa nuova
strategia terapeutica è stata già usata in pazienti con altre malattie lisosomiali, quali
Fabry e Pompe [6]. Il coinvolgimento del sistema nervoso rappresenta l’ostacolo
principale ad ogni trattamento per la presenza della barriera ematoencefalica. Studi
16 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
animali sono in corso per verificare l’efficacia della somministrazione degli enzimi
sostitutivi ad alte dosi per via intratecale [7].
Infine negli ultimi anni numerosi studi sono stai condotti sia in vitro sia su modelli
animali per valutare l’efficacia della terapia genica nelle malattie lisosomiali che ben
si prestano trattandosi di disordini ben caratterizzati e dovuti a mutazioni di singoli
geni [8];
in particolare sono state condotte ricerche
in vivo su animali nelle
mucopolisaccaridosi I, II, III, VI, VII. Il razionale di tale approccio si basa sul
principio di trasferire il gene sano nelle cellule dei pazienti al fine di produrre
l’enzima mancante e conseguentemente ridurre le sostanze intralisosomiali
accumulate. I risultati sperimentali al momento attuale sono incoraggianti, ma resta
ancora molto da fare prima che si possano fare sperimentazioni sull’uomo.
17 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
3. I GLICOSAMINOGLICANI
I Mucopolisaccaridi (MPS) o Glicosaminoglicani (GAG), sono delle macromolecole
eteropolisaccaridiche, che formano la sostanza fondamentale dei connettivi. Essi sono
costituiti da uno scheletro proteico, con cui danno origine ai Proteoglicani e a cui
sono unite, ad intervalli più o meno regolari, dalle catene polisaccaridiche non
ramificate [9].
Proteoglicano
GAGs
“Core” proteico
Ac. ialuronico
Ogni singola catena polisaccaridica lineare è formata, a sua volta, da unità
disaccaridiche fondamentali, rappresentate da un’ esosamina (glucosamina o
galattosamina) e da un acido uronico (glucuronico o iduronico), ad eccezione del
cheratansolfato in cui l’acido uronico è sostituito da un esoso (galattosio).
Tali GAGs, in base alla natura dei residui di esosamine, sono classificati in due
gruppi.
- Glucosaminoglicani (HA, KS, HS, eparina)
- Galattosaminoglicani (CS, DS).
18 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
GLICOSAMINOGLICANI (GAG)
Macromolecole polisaccaridiche lineari…
derivanti dalla ripetizione di numerose e specifiche
unità disaccaridiche costituite ciascuna da:
Acido uronico + Esosammina
Ac.
uronico
Esosam.
Ac uronico
- Ac. Glicuronico
- Ac. Iduronico
Esosammina
-Glucosammina
-Galattosammina
ACIDO JALURONICO
Ac. glucuronico
N-acetilglucosammina
CONDROITIN-SOLFATI
Ac. Glucuronico o
Ac. iduronico
N-acetilgalattosammina-4-s
EPARAN - SOLFATO
Ac. glucuronico
Glucosammina
2-solfato
2,4-disolfata
Le unità monosaccaridiche si uniscono tra loro per mezzo di un legame glicosidico
che si forma tra il gruppo ossidrilico del carbonio anomerico (C-1) di un acido
esuronico e il gruppo ossidrile di una esosamina. Questo legame viene chiamato
uronosile. Le unità disaccaridiche così formate sono associate tra loro da un altro
19 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
legame glicosidico, chiamato esosaminile. Si ottengono così le lunghe catene che
contraddistinguono i GAG. L’elevata variabilità di queste macromolecole è anche
determinata dalla presenza di gruppi solfato sugli atomi di carbonio 4 e 6 e dall’
acetilazione del gruppo amminico dell’esosamina. In aggiunta, è possibile trovare
unità disaccaridiche fondamentali di altre molecole affini. Ciò determina la loro
struttura eteropolisaccaridica. Per tale motivo il peso molecolare dei GAG presenta
un ampio range che varia da 50.000 a 4.000.000. In virtù dell’alto contenuto di gruppi
carbossilici (-COO-), gruppi solfato esterificati (-O-SO) i GAG sono polianioni; il
numero di cariche negative per unità di disaccaride è 1 (nell’acido ialuronico) fino ad
un massimo di 4 (nell’eparina). I GAG più ampiamente studiati sono:
l’ acido ialuronico (HA);
il condroitin solfato (CS);
il cheratan solfato (KS);
il dermatan solfato (DS);
l’ eparina (Hep);
l’ eparan solfato.
ACIDO IALURONICO (HA)
L’ acido Ialuronico, macromolecola lineare con un alto peso molecolare, ha una
marcata capacità di legare l’acqua. Questo conferisce a tale acido un ruolo importante
20 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
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nel mantenere il turgore dell’umor vitreo dell’occhio e nel resistere alle tensioni da
parte della cute e dell’aorta. La catena di questo GAG è costituita dal ripetersi
dell’unità disaccaridica: acido D-glucuronico e N-acetil-D glucosamina unite da un
legame (1-4). L’acido Ialuronico differisce dagli altri GAG per l’assenza di gruppi
solfato e per non essere coniugato ad alcuna proteina. Interagisce con gli altri
proteoglicani a formare aggregati che sono depositati nella rete di fibre collagene,
così da restringere la mobilità dei proteoglicani stessi e da ridurre la loro esposizione
agli enzimi idrolitici.
CONDROITIN SOLFATI (CS-A e C)
Il Condroitin Solfato si trova ampiamente distribuito in diversi tessuti connettivali, in
particolare cartilagine, ossa e valvole cardiache. Come gli altri proteoglicani solfati, il
CS, legandosi a molecole d’acqua, riesce a distribuire uniformemente le forze
esercitate dall’esterno; importante quindi il suo ruolo nei tessuti connettivali
sottoposti ad elevate pressioni, quali il nucleo polposo dei dischi intervertebrali e la
cartilagine delle giunture. Un’altra funzione dei proteoglicani solfati è quella di filtro.
Grazie all’elevato grado di idratazione, i sali e gli altri composti a basso peso
molecolare possono diffondere attraverso il gel di proteoglicani, mentre non possono
farlo le proteine. Inoltre questi GAG sono elementi costitutivi
delle membrane
basali. Partecipano anche al processo di calcificazione della cartilagine, in quanto
inibiscono la cristallizzazione del solfato di calcio. Dal punto di vista chimico il CS è
un eteropolimero non ramificato, costituito dal ripetersi del disaccaride acido β-D21 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
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glucuronico e N-acetil-β-D-galattosamina uniti tra loro da un legame BETA (1-3). Le
unità disaccaridiche sono a loro volta unite da un legame BETA (1-4).Questi GAG
possono presentare sul residuo galattosaminico un gruppo solfato in posizione C-4
(condroitin-4-solfato o condroitin solfato A) o in posizione C-6 (condroitin -6-solfato
o condroitin solfato C), che ne complicano notevolmente la struttura. Il primo è
particolarmente presente a livello della cartilagine, nei tendini, nelle valvole
cardiache e a livello del nucleo polposo dei dischi intervertebrali.
CHERATAN SOLFATO (KS)
Il Cheratan Solfato si trova nella cartilagine, dove è aggregato con il Condroitin
Solfato, nei dischi intervertebrali, ossa e cornea. Sulla base dei tessuti d’origine
possiamo distinguerlo in due tipi: il Cheratan Solfato I o corneale (KS I) ed il
Cheratan Solfato II o scheletrico (KSII). Entrambi presentano la stessa struttura
disaccaridica, ma differiscono per il tipo di legame con l’amminoacido treonina nel
formare il proteoglicano corrispondente. Il disaccaride ripetitivo del Cheratan Solfato
è costituito dal galattosio legato BETA (1-4) ad una molecola di N-acetilglucosamina. Il residuo di glucosamina lega un gruppo solfato in posizione 6. Le
unità disaccaridiche sono unite da un legame Beta (1-3).
22 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
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Dott.ssa Lucia Santoro
DERMATAN SOLFATO(DS o CSB)
IL Dermatan Solfato, (definito anche Condroitin Solfato B), è un epimero del
Cheratan Solfato dal momento che nell’ unità disaccaridica, al posto dell’acido
Uronico, si trova l’acido –L-iduronico. Perciò il disaccaride risulta formato dall’
acido-L-iduronico legato ALFA (1-3), o BETA (1-3) in presenza di acido-Diduronico, all’ N-acetilglucosamina. Il residuo galattosaminico è solfato in posizione
C-4. I disaccaridi sono legati tra loro da un legame BETA (1-4). Il peso molecolare
del Dermatan Solfato è simile a quella del Condroitin Solfato, ma generalmente la
catena del primo è più lunga. Il DS è stato trovato nella cute, nella parete dei vasi e
nelle valvole cardiache. I GAG contenenti acido L-iduronico, oltre al Dermatan
Solfato, l’Eparan Solfato e l’Eparina, formano complessi insolubili con le
lipoproteine a bassa densità (LDL) del siero; ciò potrebbe favorire la formazione di
polacche aterosclerotiche.
EPARINA (Hep)
L’ Eparina ha una struttura molto più complessa di quella degli altri GAG
precedentemente descritti. Questo GAG contiene sia acido Iduronico che acido
23 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
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Glucuronico ed, in aggiunta, il residuo glucosaminico può essere legato ad un gruppo
solfato o acetilato. Al confronto con altri GAG, l’Eparina è molto più solfatata,
contenendo fino a tre gruppi solfato per disaccaride, che le conferiscono una notevole
variabilità strutturale. Le unità ripetitive di Eparina sono costituite da acido-Dglucuronico ( o L-iduronico) legato BETA (1-4), o ALFA (1-4) in presenza di acido –
L-iduronico, legato alla D-glucosamina. I disaccaridi sono tra loro uniti tramite un
legame BETA (1-4). L’aminogruppo nella glucosamina può essere sia solforato che
acetilato. L’Eparina si trova come principale componente dei granuli intracellulari
delle mastcellule presenti nelle arterie del polmone, del fegato e della cute.
EPARAN SOLFATO (HS)
L’Eparan Solfato è strettamente correlato all’ eparina, per il fatto che contiene gli
stessi costituenti monosaccaridici, legati l’uno all’altro nella medesima modalità
dell’Eparina. Tuttavia ne differisce strutturalmente perché, rispetto a quest’ultima,
contiene meno gruppi solfati e meno molecole di acido L-iduronico. L’Eparan
Solfato si trova a livello delle membrane basali, tra i componenti di superficie delle
cellule.
24 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
GAG
LOCALIZZAZIONE
Acido Ialuronico
Liquido sinoviale, umor vitreo, matrice extracellulare e
tessuto connettivale
Condroitin Solfato
Cartilagine, ossa, valvole cardiache
Eparan solfato
Membrane basali, componenti di superficie della cellule
Eparina
Componente dei granuli intracellulari di mastcellule nelle
arterie di polmoni, fegato e cute
Dermatan solfato
Cute, vasi sanguigni, valvole cardiache
Cheratan solfato
Cornea, ossa, cartilagine aggregata con condroitin solfato
3.1.
CATABOLISMO DEI GLICOSAMINOGLICANI
La degradazione dei GAG avviene prevalentemente a livello lisosomiale, dove la
maggior parte dei frammenti e dei monosaccaridi generati rientra nella via
biosintetica. In vivo il processo degradativo è altamente organizzato e dipendente da
idrolasi. Tali enzimi sono substrato-specifici in accordo con la stereoisomeria dello
zucchero, con il tipo di legame glicosidico, con il pattern di sostituzione idrossilica
della catena e con il pH del compartimento lisosomiale. La prima classe di questi
enzimi è costituita da esoglicosidasi che catalizzano la liberazione dello specifico
monosaccaride all’estremità non riducente della catena oligosaccaridica. Le
endoglicosidasi idrolizzano invece specifiche sequenze glucidiche all’interno del
biopolimero generando frammenti di circa 10 kDa. Al processo idrolitico cooperano
anche delle solfatasi, delle esosaminidasi e delle glucuronidasi. Nella tabella
sottostante sono riportati solo alcuni enzimi responsabili del catabolismo dei GAG.
25 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Enzima
Dott.ssa Lucia Santoro
Reazione
Iduronato-2-solfatasi
Idrolisi del gruppo 2-solfato in L-iduronato di DS e HS
α-iduronidasi
Idrolisi di legami iduronosidici non solfatati in DS
GalNAc-4-solfatasi
Idrolisi del gruppo 4-solfato di GalNAc4S e di GalAGs
GalNAc-6-solfatasi
Idrolisi del gruppo 6-solfato di GalNAc6S (CS) e di D-gal
(KS)
β-N-acetilesosaminidasi
Rimozione di GalNAc4S alla porzione terminale non
riducente
β-glucuronidasi
Rimozione dei residui di β-GlcA
Ad ogni modo è necessario considerare che l’attività di questi enzimi è strettamente
interconnessa e variabile in funzione dell’ampia varietà di GAGs presenti.
3.2.
ANALISI DEI GLICOSAMINOGLICANI
A seconda del tipo di MPS ed in relazione alla severità della clinica, diversi
glicosaminoglicani ad alto peso molecolare [10,11] così come diversi frammenti
[12,13] si accumulano nei tessuti e vengono escreti nei fluidi biologici, in particolare
sangue e urine. Tuttavia, pur dando indicazioni sulla severità della malattia, ad oggi,
26 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
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i livelli di GAGs urinari valutabili attraverso le metodiche disponibili, non possono
essere utilizzate come attendibili indicatori di severità [14]. Inoltre, la correlazione
genotipo-fenotipo è stata limitata dalla rarità dei disordini e dal grande numero di
mutazioni [15]. Ancora, la severità clinica associata alle mutazioni missenso e ad altri
tipi di mutazioni ha reso difficile la predizioni per altri tipi di MPS [10, 11]. Come
conseguenza, sarebbe auspicabile avere un singolo approccio analitico per misurare la
quantità anomala di GAG nelle urine e le differenze qualitative tra le varie classi di
queste molecole come modificazioni relative ai diversi tipi di MPS. Inoltre, un simile
approccio di laboratorio sarebbe utile per mettere a punto uno screening da inserire
nei programmi di salute pubblica per l’individuazione preventiva della patologia,
diagnosi e trattamento di queste malattie metaboliche congenite che possano condurre
a una significativa riduzione in termini di morte, malattia e disabilità associate. In
ultimo, un più accurato follow-up dei trattamenti e nuovi possibili interventi
terapeutici potrebbero essere monitorati da queste nuove applicazioni analitiche. Il
dosaggio dell’attività enzimatica basato sulla coltura di fibrobalsti, leucociti, plasma e
siero sono considerati definitivi per uno specifico disordine di MPS ed è prassi
standardizzata per la diagnosi. Tuttavia, nessuno dei molti approcci sviluppati a
questo scopo, come il dosaggio multiplo diretto degli enzimi lisosomiali in spot di
sangue essiccato attraverso la spettrometria (MS) tandem mass (MS/MS) [16] o il
dosaggio multiplex immuno-quantitativo di proteine lisosomiali da spot di sangue
secco su carta da filtro, sono utili per la diagnosi precoce di MPS nello screening
neonatale a causa delle complesse procedure e della complessità dell’attrezzatura
richiesta. D’altra parte, ci sono molte procedure per la diagnosi di MPS basate sulla
valutazione di GAG accumulati, come la misura dei GAG totali urinari attraverso un
dosaggio colorimetrico [17, 18] o l’elettroforesi in acetato di cellulosa [19]. Tuttavia,
i dosaggi colorimetrici sono generalmente usati per ottenere una valutazione
quantitativa, ma sono incapaci di individuare i singoli GAG e tipo di MPS e
l’elettroforesi non è in grado di valutare la relativa struttura polisaccaridica e le
27 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
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caratteristiche utili per la caratterizzazione di specifiche modificazioni. Il metodo
ELISA è stato sviluppato per la valutazione quantitativa e qualitativa di HS e KS nel
sangue e nelle urine [20]. In ogni caso, la misura del DS non è possibile per
l’incapacità di valutare la sua composizione (come per HS e KS). Le tecniche basate
sulla ionizzazione elettrospray e la tandem mass (ESI)-MS sono state usate per
analizzare oligosaccaridi, monosaccaridi e disaccaridi di GAG in campioni biologici
[21]. Tuttavia, questo approccio generalmente richiede tempo e preparativi complessi
e procedure di marcatura effettuate prima dell’analisi, oltre a un equipaggiamento
costoso. E’ stato pubblicato un metodo HPLC-ESI-MS/MS capace di evidenziare la
quantità nell’ordine di nanomoli di HS, DS e derivati disaccaridici di KS nel siero e
plasma di pazienti MPS [22, 23]. Questo approccio richiede la digestione di campioni
di GAG per ottenere disaccaridi tramite l’uso di varie liasi prima dell’analisi, che è
potenzialmente costosa e richiede tempo. Inoltre, un nuovo dosaggio RPHPLC-ESIMS/MS per la determinazione di derivati intatti di DS e HS da disaccaridi a
pentasaccaridi è stato recentemente descritto per la diagnosi di MPS [24]. Un
importante inconveniente di questa analisi è l’incapacità di determinare GAG urinari
ad alto peso molecolare, presenti in alta concentrazione nelle urine MPS [13], come il
tempo richiesto e la complessa preparazione di campioni e la derivatizzazione con 1phenyl-3-methyl-5-pyrazolone. In definitiva, tutte queste metodiche non sono
appropriate per lo screening di massa dal momento che sono eccessivamente costose
per l’alto costo della strumentazione e in ogni caso non sono mai state capaci di
trovare una correlazione analitica tra la diagnosi clinica e la severità dell’MPS. Per
quel che concerne la terapia, i soli parametri biochimici usati per monitorare
l’efficacia di terapia nei soggetti affetti da MPS sono stati valutati nelle urine con il
metodo quantitativo generico del DMB e l’elettroforesi su acetato di cellulosa [4] o
attraverso la valutazione dei disaccaridi dei GAGs plasmatici e urinari mediante
HPLC-ESI [25]. Detto ciò, il il complesso sierico trombina-cofattore II dell’eparina è
stato proposto come biomarker per monitorare l’efficacia di trattamento delle MPS
28 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
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[26] insieme con la determinazione dei diasaccaridi dei GAGs plasmatici e urinari
[27]. Comunque sia, questi approcci analitici sono incapaci di rilevare in modo
diretto modificazioni strutturali di GAG.
29 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
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4. SCOPO DELLO STUDIO
Emerge l’importanza della diagnosi precoce delle mucopolisaccaridosi in quanto,
oltre a costituire la base per la formulazione del consiglio genetico alla famiglia, è il
presupposto fondamentale per consentire un precoce approccio terapeutico prima che
si siano verificati danni irreversibili in quelle malattie per le quali è attualmente
disponibile una terapia efficace. A tal proposito, nuove frontiere si stanno varcando
nell’ambito della ricerca, per quel che concerne le terapie attuali e quelle future,
pertanto emerge la necessità di un’attenta valutazione del trattamento allo scopo di
ottimizzarne l’impiego, valutarne i rischi e monitorarne l’efficacia.
Il presente lavoro, attraverso la modifica di metodi di laboratorio già noti (dosaggio e
caratterizzazione dei GAG) e la messa a punto di nuovi approcci metodologici
(valutazione e rapporto delle esosamine derivate dai GAG, determinazione dei
disaccaridi urinari), consente la caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari per
l’applicazione alla diagnosi e al follow-up delle mucopolisaccaridosi. Infine, tale
lavoro potrebbe in futuro consentire la determinazione dei valori normali di GAG in
epoca neonatale permettendo l’identificazione in fase precoce ossia preclinica delle
mucopolisaccaridosi (screening neonatale). Nei nostri dati preliminari, presentiamo
delle procedure nuove ad alta risoluzione per la determinazione delle esosamine
contenute nelle urine mediante due differenti metodologie: Elettroforesi Capillare in
UV e HPLC in fluorescenza. I risultati ottenuti con entrambi i metodi confermano
l’esistenza di una correlazione tra concentrazione di esosoamine urinarie e contenuto
in glicosaminoglicani. Inoltre è stata impiegata una procedura d’analisi già nota, la
misurazione dei disaccaridi con HPLC in UV, ma mai applicata sinora allo studio dei
glicosaminoglicani umani. Tale procedura analitica viene applicata al monitoraggio
della terapia al fine di ottimizzarne l’efficacia.
Correlazioni importanti tra la risposta dell’ analisi, la diagnosi clinica, la gravità di
malattia e l’efficacia della terapia enzimatica sostitutiva sono state anche osservate.
30 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Infine, i risultati di questo studio possono essere utili in previsione di uno screening
neonatale impiegato nei programmi di salute pubblica preventiva, oltre che
nell’ambito di un possibile impiego per un più accurato follow-up del trattamento
terapeutico attuale e per una più attenta valutazione degli eventuali interventi
terapeutici futuri.
31 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
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5. MATERIALI
5.1. PAZIENTI
Sono stati raccolti i campioni di urina di :
- 83 volontari sani, di età compresa fra un mese e 13 anni, senza deficienze
enzimatiche comparabili a MPS (gruppo di controllo);
- 45 soggetti affetti da varie forme di MPS con sottotipi lievi e gravi ( 6 MPS
I Sheie, 1 MPS I Hurler/Sheie, 7 MPS I Hurler, 4 MPS II lieve, 7 MPS II
severa, 12 MPS III, 7 MPS IV, 1 MPS VI) seguiti presso la Clinica
Pediatrica di Ancona.
Sono inoltre stati raccolti i campioni di urine di:
- 2 pazienti affetti da MPS I Hurler/Sheie in trattamento con α-L-iduronidasi
da oltre 6 anni, prima dell’infusione e dopo l’infusione, per un periodo
complessivo di valutazione di 2 settimane;
- 1 paziente affetto da MPS II forma severa in trattamento con iduronato-2solfatasi, prima dell’inizio della terapia e durante la terapia, per un periodo
complessivo di valutazione di 10 mesi.
32 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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6. METODI
Sui campioni di urina raccolti dei soggetti controllo e di quelli affetti da vari tipi di
MPS è stata effettuata una valutazione quantitativa preliminare dei GAG totali con un
dosaggio standard colorimetrico accettato dalle linee guida per la gestione di MPS
[28] presso il Laboratorio di Diagnosi e Prevenzione delle Malattie Metaboliche della
Clinica Pediatrica di Ancona, insieme al dosaggio dei livelli di creatinina, e la
caratterizzazione dei mucopolisaccaridi urinari tramite elettroforesi su acetato di
cellulosa in Bario-acetato per l’identificazione del pattern di escrezione [29].
Per i pazienti MPS, sono stati anche eseguiti un’accurata caratterizzazione enzimatica
dell’enzima mancante, insieme alla definizione del tipo di MPS e alla valutazione
clinica ad opera dei medici della Clinica Pediatrica di Ancona. I campioni di urina
sono successivamente stati spediti al Dipartimento di Biologia di Modena, per uno
screening delle esosamine.
Sui campioni di urina raccolti dei 2 pazienti MPS I H/S e del paziente MPS II in
terapia è stata effettuata una valutazione qualitativa e semi-quantitativa preliminare
dei GAG totali con il metodo dell’analisi elettroforetica in gel d’agarosio [30] e
successivamente una valutazione dei disaccaridi con metodo in HPLS/UV dopo
digestione enzimatica, per un più accurato follow-up dei trattamenti. Tutte le analisi
sono state condotte presso il Dipartimento di Biologia di Modena.
6.1.DOSAGGIO QUANTITATIVO DEI GAG URINARI COL METODO AL
DMB
Il metodo spettrofotometrico sfrutta la proprietà del colorante basico DMB di legarsi
ai gruppi solfato delle molecole dei GAGs, formando un complesso colorato
dall’azzurro al lilla, di intensità proporzionale alla concentrazione dei GAGs nella
soluzione. Il dosaggio viene eseguito in triplicato, si preparano per ciascun campione
3 cuvette contenenti quantità crescenti di urina (50, 100, 150 µl), e acqua distillata
33 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
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Dott.ssa Lucia Santoro
fino a un volume di 500 µl. Vengono poi allestite due cuvette contenenti acqua
distillata (bianco campione) e 3 cuvette contenenti una soluzione standard di
Condroitin Solfato A (CS-A) alla concentrazione di 2,5 µg/10 µl. Vengono poi
aggiunti 2,5 ml di colorante al DMB la cui composizione viene di seguito indicata:
- 16 mg di 1,9 Dimetil-Metilene Blu,
- 2 g di formiato di sodio,
- 5 ml di etanolo assoluto,
- 2 ml di acido formico,
- acqua distillata fino a un volume finale di 1500 ml.
Di ciascuna cuvetta viene letta l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 535 nm tramite
uno spettrofotometro a doppio raggio (Shimadzu), che permette di svolgere
contemporaneamente la misura dell’assorbanza del campione contro quello del
bianco e permette di compensare qualunque fluttuazione dell’intensità della sorgente
luminosa durante una serie di misure. Le misure di densità ottica così ottenute, in
relazione allo standard di riferimento, permettono di ottenere la concentrazione dei
GAGs nel campione analizzato. L’escrezione urinaria dei GAG viene poi espressa
come rapporto µg GAG/mg Creatinina.
6.2.CARATTERIZZAZIONE
DEI
GAG
URINARI
TRAMITE
ELETTROFORESI SU ACETATO DI CELLULOSA
Il volume di urina da utilizzare per la caratterizzazione elettroforetica viene calcolato
sulla base del valore del DMB/Creat. come segue
μg di GAG in rapporto ai mg di Urina utilizzata
creatinina
<30 μg/mg
10 ml di urina
34 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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30-60 μg/mg
7,5 ml di urina +2,5 ml di H2O
60-90μg/mg
5 ml di urina
>90μg/mg
2,5 ml di urina +5ml di H20
+5ml di H2O
Purificazione dei GAGs urinari
Si procede a questo punto con l’isolamento dei mucopolisaccaridi mediante
precipitazione con Cloruro di Cetilpiridinio(CPC), seguita da un lavaggio con acetato
di potassio, un lavaggio con etanolo assoluto e uno con dietiletere. Il sedimento viene
posto in stufa a 37°C e successivamente risospeso in 100 µl di H2O distillata. Di
seguito lo schema del processo di estrazione:
…• campione + 200µl di CPC al 10%
• Lasciare a 4°C overnight
• Centrifugare 4000 rpm per 10’ a 4°C
• Scartare il sovranatante
• Aggiungere al pellet 10 ml di K-Ac al 10% in EtOH 95°
• Centrifugare 4000 rpm per 10’ a 4°c
• Scartare il sovranatante
• Aggiungere al pellet 10 ml di EtOH assoluto
• Centrifugare 4000 rpm per 10’ a 4°C
• Scartare il sovranatante
• Aggiungere al pellet 1 ml di dietiletere
35 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
…Centrifugare 4000 rpm per 10’ a 4°C
• Scartare il sovranatante
• Lasciare asciugare il sedimento in stufa a 37°C
• Risospendere il pellet in 100 µl di H2O dist.
Per la corsa elettroforetica, i campioni sono stati seminati al catodo direttamente su
strisce di Acetato di cellulosa in tampone Bario Acetato 0.05 M.
Tra i due elettrodi viene applicata una differenza di potenziale di 150 V per 60 min.
Le strisce di acetato di cellulosa vengono poi poste in una soluzione colorante
contenente DMB allo 0,02% e CH3COOH all’ 1% per circa 10 minuti e
successivamente decolorate in CH3COOH al 10% semina elettroforetica
+
KS
CS
DS
-
HS
_
_
_
_
6-3. DOSAGGIO DELLE ESOSAMINE
Preparazione del campione
Si parte da soluzioni standard di Glucosamine e Galattosamine alla concentrazone di
10 mg/ml in acqua bidistillata. Un campione di 500 µL di campione di urine viene
centrifugato a 10.000 giri per 10 minuti, viene prelevato il surnatante e poi 1 ml di
36 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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etanolo viene aggiunto a 200 µL di surnatante. Dopo 2 ore a -20°C, il campione viene
centrifugato a 10.000 giri per 10 minuti e il pellet viene dissolto in 500 µL di 4
Molare di HCL preparato fresco. Dopo 120 minuti a 110°C, il campione viene
liofilizzato.
Derivazione delle esosamine con acido antranilico o 2-aminobenzoico (AA)
Le soluzioni di glucosamine e galattosamine standard liofilizzate o i campioni trattati,
in presenza di standard interno ribosio, vengono dissolti in 50µL di sodio acetato
all’1% e 50 µL di AA (30 mg) e sodio cianoboroidruro (20 mg) dissolti in1 ml
soluzione di metanolo-acetato-borato (120 mg di sodio acetato e 100 mg di acido
borico in 5 ml di metanolo) [15]. Le provette contenenti i campioni vengono scaldate
a 80°C per 60 minuti. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, i campioni
vengono analizzati da CE e HPLC.
Elettroforesi Capillare
Lo strumento per l’EC è Beckman HPCE (P/ACE System 5000) equipaggiato con un
rilevatore UV settato a 214 nm. La separazione e l’analisi sono realizzate con una
colonna capillare in silice (50 µm i.d., lunghezza totale 85 cm, e 65 cm dal punto di
iniezione al rilevatore) a 25°C. Il tampone di corsa è composto da 150 mM di acido
borico e 50 mM di NaH2PO4 tamponato a pH 7 con una soluzione di NaOH . Prima
di ogni corsa, il capillare viene lavato con 0.1 M NaOH per un minuto e acqua
bidistillata (o pura) per 2 minuti, e poi condizionato con il tampone di corsa per 2
min. Dopo ogni corsa, il capillare viene ritrattato con 0.1 Molare NaOH per 1 minuto
e poi condizionato con tampone di corsa per 2 minuti. I campioni vengono iniettati
automaticamente, usando un modo di iniezione a pressione, in cui il campione è
pressurizzato per 5 sec. L’elettroforesi viene condotta a 15kV (circa 60µAmper)
usando una polarità normale. Le aree di picco sono calcolate usando il sistema
software Beckman Gold V810.
37 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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Reverse Phase-HPLC analisi
Tutte le separazioni sono realizzate su HPLC Jasco serie 1500 equipaggiata con un
modulo di degasaggio integrato, una pompa quaternaria, un iniettore Rheodyne con
un loop di 20 µL, un rivelatore in fluorescenza Modello FP-1520 e un software JascoBorwin. Per la determinazione della fluorescenza la lunghezza d’onda di eccitazione
è settata a 360 nm e quella di emissione a 425 nm. La colonna HPLC è una Gemini
C18 3 micrometri 110 Amstrong (dimensioni) della Phenomenex dotata di
precolonna. In accordo con R et al., l’eluente A contiene tampone sodio acetato 50
mM a pH 4.1, e l’eluente B contiene il 20% di eluente A in metanolo. Il gradiente è:
0-10 min al 3% eluente B isocratico, 10-35min gradiente lineare 3-10% B, 35-45 min
gradiente lineare 10-100% B, 45-50 min 100% B isocratico. Per garantire la
riproducibilità da corsa a corsa, la colonna viene riequilibrata con 3% B per 5.min. La
velocità del flusso di 1.0 mL/min (fissa).
I microgrammi di esosamine vengono calcolati dalle medie delle curve di
calibrazione specifiche e riportati come microgrammi per mg di creatinina. I dati
vengono espressi come medie +/- DS. L’analisi statistica è un’analisi di varianza
(ANOVA), il test Student-Newman-Keuls e il test Mann-Whitney U vengono
applicati utilizzando il software SPSS Statistics Versione 17.0 per Window. La
significatività statistica è pari a p<0.05
6.4.
METODO DEI DISACCARIDI
Per l’analisi quantitativa dei GAGs urinari totali , 100 µL di urine sono trattate col
DMB secondo il metodo di Coppa et al, 1987-2010. I dati finali vengono normalizzati
per mg di creatinina ed espressi in µg di GAGs / mg di creatinina. Inoltre, 5 ml di
urine sono trattate con 5% di CETAB come riportato nel dettaglio in lavori precedenti
[31] e, dopo estrazione, i GAGs sono diluiti in 200 µL di acqua distillata per ulteriori
analisi. 40 µL di estratto di urine, non trattate o degradate con condroitinasi ABC o B,
vengono separate e quantificate con elettroforesi in gel di agarosio (20 µL stratificate
38 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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sul gel)e scannerizzate densitometricamente secondo specifiche curve di calibrazione
come riportato altrove [32] eseguite stratificando per ogni gel un ammontare
crescente da 0.5 a 4 µg di standards . I dati finali vengono normalizzati per mg di
creatinina ed espressi in µg di GAGs / mg di creatinina.
Altri 20 µL contenenti disaccaridi insaturi sono separati e quantificati con HPLC e
rilevatore UV a 232 nm. La determinazione in % di ogni disaccaride è ottenuta con
l’impiego di specifiche curve di calibrazione eseguite con standards della Seikagaku
Corporation.
Le metodiche sopra descritte sono innovative, ad alta risoluzione, semplici, veloci ed
economiche e sono
in grado di mettere in evidenza
mucopolisaccaridosi.
39 tutte le forme di
Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
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7. RISULTATI
7.1. DOSAGGIO QUANTITATIVO DEI GAG URINARI CON METODO AL
DMB
Dati per Età' Controlli (CTRL) & Affetti (MPS)
DMB/Creat. (ug GAG/mg Creat)
ETA' aa
0-1aa
1-2aa
2-3aa
3-5aa
5-8aa
8-13aa
CTRL M +/-D.S.
148 +/-38,8
88,5 +/-23,2
80,3 +/-33,1
80,1 +/-52,6
70,5 +/-20,6
46,5 +/-28,7
V.N.
30-200
32-94
14-90
22-86
16-80
10-63
MPS M +/-D.S.
873,9 +/-495
554,7 +/-331,7
537,1 +/-311,2
445,2 +/-200,4
423,9 +/-256,3
90,3 +/-47,2
Tutti i campioni di urina raccolti dei soggetti controllo e dei pazienti affetti da vari
tipi di MPS sono stati suddivisi per fasce di età con i rispettivi valori normali di
riferimento. La valutazione quantitativa preliminare dei GAG totali col metodo al
DMB, insieme al dosaggio dei livelli di creatinina, ha messo in evidenza in tutti i 45
soggetti affetti una quantità di GAG urinari totali molto superiore rispetto ai controlli
di pari età. Si rammenta a conferma di ciò che per i pazienti MPS, sono stati anche
eseguiti un’accurata caratterizzazione enzimatica dell’enzima mancante, insieme alla
definizione del tipo di MPS e alla valutazione clinica.
40 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
7.2.
CARATTERIZZAZIONE
Dott.ssa Lucia Santoro
DEI
GAG
URINARI
TRAMITE
ELETTROFORESI SU ACETATO DI CELLULOSA
CS KS
CS CS
DS HS
N MPS III N N MPS I N MPS IV N N
La valutazione qualitativa preliminare dei GAG totali con il metodo dell’analisi
elettroforetica su acetato di cellulosa ha messo in evidenza in tutti i 45 soggetti affetti
da MPS un pattern elettroforetico anomalo rispetto ai controlli.
41 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
7.3.
DOSAGGIO
DELLE
Dott.ssa Lucia Santoro
ESOSAMINE
URINARIE
MEDIANTE
ELETTROFORESI CAPILLARE E REVERSE PHASE-HPLC ANALISI
Validazione delle “nuove procedure analitiche” applicate ai campioni di urine.
Dopo un rapido (2 ore) pretrattamento delle urine consistente nella precipitazione dei
complessi eteropolisaccaridici insieme con i relativi oligomeri e frammenti [15], le
esosamine sono state generate dall’ idrolisi acida. Il processo di idrolisi consta di due
steps, l’idrolisi del legame glicosidico e del gruppo N-acetile (e N-sulfureo in una
minore % di casi per HS), risultante nella deacetilazione o desulfonazione, con la
formazione delle esosamine. La procedura di idrolisi dei GAGs standard, HS, CS e
DS, è stata realizzata usando HCl. Le condizioni ottimali sono state trovate a 110°C
usando HCl 4 Molare per 120 min, garantendo la massima percentuale di idrolisi. In
accordo con precedenti pubblicazioni [15], è stato trovato che entrambe le esosamine
sono stabili fino a 30 giorni a 4°C.
Sotto queste condizioni, è stato osservato che il recupero di GlcN e le GalN dalle
urine è circa del 100% per i polisaccaridi e vicino al 95% per i disaccaridi. Di
conseguenza, è stato osservato che il recupero totale per i polimeri ad alto peso
molecolare e per i disaccaridi (e ovviamente i frammenti aventi valori di massa
intermedi che si è dimostrato sono presenti nelle urine dei soggetti MPS [10, 13]) è di
circa 95-100%, garantendo una completa analisi quantitativa delle specie saccaridiche
delle urine.
In accordo con lavori precedenti [15], GlcN e GalN (e altri monosaccaridi) sono stati
derivatizzati in condizioni ottimali con acido 2-aminobenzoico in medium di reazione
contenente metanolo-acetato-borato per produrre derivati capaci di forte assorbanza a
lunghezza d’onda 214 nm e fluorescenza. Dopo un breve periodo di tempo, 1 ora,
richiesto per il processo di derivatizzazione, i campioni sono stati separati mediante
CE/UV in ~9-10 min e RP-HPLC-Fd in ~20-22 min (Figura 6A). Come standard
42 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
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interno è stato utilizzato il ribosio per il controllo dell’intera procedura quantitativa
[15].
Figura 6 (A) Esempi di elettroforegramma HPCE/UV e cromotogramma RP-HPLC-Fd di GlcN e GalN
derivatizzate con AA e ottenute dopo la procedura di idrolisi dei GAGs urinari dai (A) Controlli, (B) soggetti
MPS III e (C) MPS VI. Il ribosio usato come standard interno è fuori dai due pannelli avendo un maggior
tempo di migrazione [14-17].
43 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
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Tabella 1. Caratteristiche dei soggetti in buona salute (gruppo controllo) e dei pazienti affetti da varie forme
e tipi di MPS-osi.
Subjects (number)
Female/Male
Mean age (years)
Healthy group
83
27/56
3.96 ± 0.38 (0.01-13)
MPS I Scheie
6
3/3
9.17 ± 2.41 (1-15)
MPS I Hurler-Scheie
1
0/1
8.33
MPS I Hurler
7
4/3
1.70 ± 0.27 (1-3)
MPS II Mild
4
0/4
4.25 ± 0.48 (3-5)
MPS II Severe
7
0/7
2.86 ± 0.72 (0.3-6)
MPS III
12
6/6
5.68 ± 1.17 (3-15)
MPS IV
7
1/6
4.98 ± 1.29 (1-12)
MPS VI
1
1/0
2.5
I dati sono riportati come medie ± Deviazioni Standard. Valori minimi e massimi sono illustrati
tra parentesi.
44 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
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Tabella 2. Valori di esosamine singoli e totali insieme con i loro rapporti determinati con HPCE e HPLC nei
controlli e nei soggetti MPS I.
Healthy group
MPS I
HurlerScheie
MPS I Hurler
110.6±22.5 (92.4-152.7)
(20.3%)
197.9
320.0±91.3 (229.5-476.7) (28.5%)
+450.2%
+884.6%
+1492.0%
MPS I Scheie
HPCE/UV
GalN (µg/mg CR)
20.1±12.6 (0.1-55.0) (62.7%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
GlcN (µg/mg CR)
p<0.05/p<0.001
30.9±18.1 (4.8-79.0) (58.7%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
Total Hexs (µg/mg
CR)
51.1±30.1 (4.9-120.8)
(58.9%)
ANOVA/Student
110.2
175.7±62.9 (117.9-285.8) (35.8%)
+208.4%
+256.6%
+468.6%
p<0.02/p<0.001
206.0±45.7 (166.1-291.5)
(22.2%)
308.1
495.7±151.7 (364.8-762.5) (30.6%)
+303.1%
+502.9%
+870.0%
p<0.05/p<0.001
0.65±0.2 (0.6-1.2) (17.5%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
GalN/GlcN (AUC)
95.3±26.3 (73.3-138.8) (27.6%)
p<0.05/p<0.002
Difference vs Control
GalN/GlcN (µg/mg
CR)
p<0.02/p<0.000
p<0.005/p<0.001
1.16±0.2 (0.9-1.4) (16.8%)
1.80
1.82±0.3 (1.6-2.4) (16.5%)
+78.5%
+176.9%
+180.0%
P<0.05/p<0.05
0.93±0.2 (0.7-1.3) (17.7%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
p<0.02/p<0.000
1.40±0.2 (1.0-1.7) (16.8%)
2.09
2.15±0.4 (1.9-2.7) (16.9%)
+50.5%
+124.7%
+131.2%
P<0.05/p<0.05
p<0.02/p<0.000
HPLC/Fp
GalN (µg/mg CR)
28.3±14.7 (4.2-58.9) (51.9%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
GlcN (µg/mg CR)
35.6±18.0 (5.7-73.9) (50.4%)
ANOVA/Student
Difference vs Control
198.9
290.9±93.6 (167.1-436.7) (32.2%)
+247.0%
+602.8%
+927.9%
p<0.05/p<0.001
Difference vs Control
Total Hexs (µg/mg
CR)
98.2±13.0 (81.9-114.5) (13.2%)
100.5±35.5 (62.9-162.9)
(35.3%)
138.7
219.1±83.2 (111.9-338.0) (37.9%)
+182.3%
+289.6%
+515.4%
P<0.05/p<0.01
63.9±32.3 (10.3-124.4)
(50.5%)
p<0.02/p<0.001
198.7±46.6 (144.8-277.4)
(23.5%)
337.6
510.0±172.9 (279.0-774.7) (33.9%)
+211.0%
+429.3%
+698.0%
45 p<0.02/p<0.000
Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
ANOVA/Student
GalN/GlcN (µg/mg
CR)
Dott.ssa Lucia Santoro
p<0.05/p<0.05
0.79±0.1 (0.5-1.0) (14.4%)
0.98±0.2 (0.7-1.3) (16.8%)
1.40
1.33±0.2 (1.0-1.6) (15.5%)
+24.0%
+77.2%
+68.3%
Difference vs Control
ANOVA/Student
GalN/GlcN (AUC)
p<0.02/p<0.000
p=NS/p=NS
0.96±0.1 (0.6-1.3) (14.5%)
p<0.02/p<0.005
1.27±0.3 (0.8-1.6) (21.7%)
1.69
1.62±0.3 (1.2-1.9) (16.4%)
+32.3%
+76.0%
+68.8%
Difference vs Control
ANOVA/Student
p=NS/p=NS
p<0.02/p<0.005
Tabella 3. Valori di esosamine singoli e totali insieme con i loro rapporti determinati con HPCE e HPLC nei
controlli e nei soggetti MPS II.
Healthy group
MPS II Mild
MPS II Severe
HPCE/UV
GalN (µg/mg CR)
20.1±12.6 (0.1-55.0) (62.7%)
32.5±14.5 (18.6-45.4) (44.6%)
124.9±30.7 (93.2-175.0) (24.6%)
+61.7%
+521.4%
p=NS/p=NS
p<0.05/p<0.01
29.3±10.6 (18.1-42.3) (36.3%)
82.0±19.1 (40.5-95.5) (23.3%)
-5.2%
+165.4%
p=NS/p=NS
p<0.05/p<0.01
61.8±24.7 (77.7-87.7) (40.0%)
206.9±36.2 (157.0-265.2) (17.5%)
+20.9%
+304.9%
p=NS/p=NS
p<0.05/p<0.01
1.11±0.2 (0.9-1.4) (17.6%)
1.52±0.7 (1.0-2.9) (41.2%)
+70.8%
+133.8%
p<0.05/p<0.02
p<0.05/p<0.01
1.62±0.3 (1.4-1.9) (15.9%)
1.76±0.5 (1.2-2.7) (29.8%)
+93.3%
+89.2%
p<0.05/p<0.02
p<0.05/p<0.01
Difference vs Control
ANOVA/Student
GlcN (µg/mg CR)
30.9±18.1 (4.8-79.0) (58.7%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
Total Hexs (µg/mg CR)
51.1±30.1 (4.9-120.8) (58.9%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
GalN/GlcN (µg/mg CR)
0.65±0.2 (0.6-1.2) (17.5%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
GalN/GlcN (AUC)
0.93±0.2 (0.7-1.3) (17.7%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
HPLC/Fp
GalN (µg/mg CR)
28.3±14.7 (4.2-58.9) (51.9%)
43.5±31.6 (13.6-72.0) (72.6%)
101.7±15.9 (82.0-126.2) (15.6%)
+53.7%
+259.4%
p=NS/p=NS
p<0.01/p<0.005
Difference vs Control
ANOVA/Student
46 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
GlcN (µg/mg CR)
Dott.ssa Lucia Santoro
35.6±18.0 (5.7-73.9) (50.4%)
40.7±23.3 (19.4-64.3) (57.4%)
82.5±10.7 (70.6-100.0) (13.0%)
+14.3%
+131.7%
p=NS/p=NS
p<0.01/p<0.005
84.1±54.8 (33.0-136.3) (65.1%)
184.2±19.0 (157.1-218.6) (10.3%)
+31.6%
+188.3%
p=NS/p=NS
p<0.01/p<0.000
1.07±0.2 (0.7-1.2) (24.2%)
1.23±0.1 (0.9-1.5) (19.2%)
+35.4%
+55.7%
p<0.05/p<0.02
p<0.05/p<0.01
1.52±0.1 (1.4-1.7) (8.6%)
1.55±0.3 (1.0-2.0) (22.6%)
+58.3%
+61.5%
p<0.05/p<0.02
p<0.05/p<0.01
Difference vs Control
ANOVA/Student
Total Hexs (µg/mg CR)
63.9±32.3 (10.3-124.4) (50.5%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
GalN/GlcN (µg/mg CR)
0.79±0.1 (0.5-1.0) (14.4%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
GalN/GlcN (AUC)
0.96±0.1 (0.6-1.3) (14.5%)
Difference vs Control
ANOVA/Student
Tabella 4. Valori di esosamine singoli e totali insieme con i loro rapporti determinati con HPCE e HPLC nei
controlli e nei soggetti MPS III, IV e IV.
Healthy group
MPS III
MPS IV
MPS VI
65.9±37.5 (11.5-132.2) (56.9%)
71.7±66.9 (12.8-185.5) (93.3%)
451.2
Difference vs Control
+227.9%
+256.7%
+2144.8%
ANOVA/Student
p<0.01/p<0.005
p=NS/p=NS
204.0±75.2 (65.8-337.5) (36.9%)
91.0±52.8 (28.1-163.1) (58.0%)
122.4
Difference vs Control
+560.2%
+194.5%
+296.1%
ANOVA/Student
p<0.005/p<0.000
p=NS/p=NS
278.1±89.4 (177.2-416.1) (32.1%)
162.7±118.6 (41.0-347.4) (72.9%)
573.6
Difference vs Control group
+444.2%
+218.4%
+1022.5%
ANOVA/Student
p<0.005/p<0.000
p=NS/p=NS
0.32±0.1 (0.1-0.5) (36.7%)
0.79±0.3 (0.4-1.1) (41.1%)
3.69
Difference vs Control
-50.8%
+21.5%
+467.7%
ANOVA/Student
p<0.005/p<0.000
p=NS/p=NS
HPCE/UV
GalN (µg/mg CR)
GlcN (µg/mg CR)
Total Hexs (µg/mg CR)
GalN/GlcN ratio (µg/mg CR)
20.1±12.6 (0.1-55.0) (62.7%)
30.9±18.1 (4.8-79.0) (58.7%)
51.1±30.1 (4.9-120.8) (58.9%)
0.65±0.2 (0.6-1.2) (17.5%)
47 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
0.27±0.1 (0.2-0.5) (35.4%)
0.83±0.3 (0.5-1.3) (33.5%)
5.02
Difference vs Control
-74.2%
-10.7%
+439.8%
ANOVA/Student
p<0.005/p<0.000
p=NS/p=NS
53.1±18.9 (27.3-78.1) (35.5%)
59.6±64.9 (13.9-173.9) (109.0%)
377.7
Difference vs Control
+87.6%
+110.6%
+1234.6%
ANOVA/Student
p<0.01/p<0.005
p=NS/p=NS
201.6±88.4 (96.9-399.2) (43.9%)
77.6±64.6 (32.7-201.6) (83.2%)
212.9
Difference vs Control
+466.3%
+118.0%
+498.0%
ANOVA/Student
p<0.005/p<0.000
p=NS/p=NS
254.7±102.2 (126.4-476.4) (40.1%)
137.2±129.3 (46.6-375.5) (94.2%)
590.6
Difference vs Control
+298.6%
+114.7%
+824.3%
ANOVA/Student
p<0.005/p<0.000
p=NS/p=NS
0.26±0.1 (0.2-0.5) (34.4%)
0.77±0.2 (0.4-1.1) (33.7%)
1.77
Difference vs Control
-67.1%
+2.5%
+124.0%
ANOVA/Student
p<0.005/p<0.000
p=NS/p=NS
0.33±0.1 (0.2-0.6) (30.1%)
0.82±0.2 (0.5-1.1) (26.9%)
2.93
Difference vs Control
-65.6%
-14.6%
+205.2%
ANOVA/Student
p<0.005/p<0.000
p=NS/p=NS
GalN/GlcN ratio (AUC)
0.93±0.2 (0.7-1.3) (17.7%)
Dott.ssa Lucia Santoro
HPLC/Fp
GalN (µg/mg CR)
GlcN (µg/mg CR)
Total Hexs (µg/mg CR)
GalN/GlcN ratio (µg/mg CR)
GalN/GlcN ratio (AUC)
28.3±14.7 (4.2-58.9) (51.9%)
35.6±18.0 (5.7-73.9) (50.4%)
63.9±32.3 (10.3-124.4) (50.5%)
0.79±0.1 (0.5-1.0) (14.4%)
0.96±0.1 (0.6-1.3) (14.5%)
I risultati sono la media di tre differenti analisi. I dati sono riportati come µg/mg creatinina (CR) ±
Deviazione Standard. I valori minimi e massimi sono illustrati in parentesi insieme con il coefficiente di
variazione %. Le differenze vs i Controlli e la significatività sono determinati mediante l’ analisi di varianza
(ANOVA) e il test Student-Newman-Keuls. NS = non significativo.
48 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Figura 7. Valori singoli e totali di esosamine urinarie e relativi rapporti ottenuti mediante HPCE/UV e
HPLC/Fd per ogni soggetto in buona salute e per i vari pazienti MPS. L’andamento di regressione in
dipendenza dell’età nel gruppo controllo è pure illustrato. Le frecce indicano le esosamine totali per i 2
soggetti MPS IV aventi valori più alti a confronto degli altri pazienti MPS IV. I rapporti dell’unico paziente
MPS VI non sono riportati in Figura a causa dei loro valori molto alti (vedi Tab. 4).
49 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Figura 8. I valori di esosamine totali (espressi come µg/mg creatinina ± Errore Standard) e i relativi
rapporti ottenuti mediante HPCE/UV e HPLC/Fd per i soggetti controllo e i vari pazienti MPS insieme con i
diversi gradi di severità dei disordini.* indicata differenze significative.
Profilo delle esosamine nelle urine dei soggetti controllo.
Le esosamine sono state determinate nelle urine di 83 soggetti in buona salute, 27
femmine e 56 maschi, di età compresa in un range che va da meno di 1 mese a 13
anni (Tab. 1). Il rapporto tra le due esosamine è stato calcolato come rapporto tra
µg/mg creatinina determinati usando specifiche curve di calibrazione o con un
semplice rapporto tra le aree sotto le curve (AUC) determinate dalle due procedure
analitiche. Anche se un valore leggermente inferiore è stato calcolato con il rapporto
50 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
determinato dalle curve di calibrazione (Tab.2-3), differenze statisticamente
significative non sono state trovate tra i dati derivati dai due metodi. In ragione di ciò,
dopo derivatizzazione con AA, GlcN e GalN mostravano curve di calibrazione del
tutto simili sia in UV che in Fluorescenza [15], rendendo questo metodo efficace per
la quantificazione semplice e diretta delle due esosamine usando i dati AUC
direttamente usciti dai detectors (cromatogramma).
Infine, non sono state trovate differenze significative tra i valori osservati con le due
procedure analitiche come emerge chiaramente anche dalle Figure 7 e 8.
Non sono state ottenute differenze significative per quello che riguarda il contenuto
totale di esosamine nei soggetti sopra i 13 anni, al contrario un trend verso una
diminuzione del rapporto GalN/GlcN è stato osservato in dipendenza dell’età (Figura
7).
Profilo delle esosamine nelle urine dei pazienti MPS I.
Il contenuto totale delle esosamine urinarie nei 6 pazienti con la forma lieve MPS I,
tipo Scheie, (Tab.1), è aumentato significativamente nelle valutazioni mediante
entrambe le procedure analitiche di circa il 303% (CE/UV) e del 211% (HPLC)
(Tab.2 e Fig. 7 e 8). L’alto valore di esosamine totali urinarie è imputabile al
significativo incremento delle galattosamine rispetto alle glucosamine.
I rapporti GalN/GlcN determinati con le curve di calibrazione o direttamente dai dati
AUC sono aumentati di circa il 78% e 50% (CE/UV) e di circa il 24% e 32%
(HPLC) (Tab.2). Le differenze tra i valori trovati non sono comunque risultate essere
statisticamente significative.
Anche le urine dei 7 pazienti affetti dalla forma severa di MPS I, tipo Hurler, (Tab.1),
sono state analizzate con entrambe le procedure. I risultati illustrati in Tab.2 e Fig. 7
e 8 mostrano un significativo incremento della quantità totale delle esosamine (circa
870%) e del rapporto GalN/GlcN, dovuto ad un considerevole incremento del
51 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
contenuto di GalN (più del 1000%) insieme con GlcN (468%). Infine, differenze
significative sono state anche osservate nel contenuto totale di esosamine tra la forma
lieve e severa di MPS I (Fig. 7 e 8). L’unico soggetto affetto dalla forma intermedia
MPS, tipo Huler/Scheie, ha mostrato valori intermedi di esosamine totali con il
rapporto GalN/GlcN pressocchè similare a quello dei pazienti affetti dalla forma
severa, tipo Hurler (Tab. 2 e Fig. 7 e 8).
Profilo delle esosamine nelle urine dei pazienti MPS II.
I 4 soggetti affetti dalla forma lieve di MPS II (Tab.1) hanno mostrato valori
aumentati di esosamine totali ( 20% in HPCE e 30% in HPLC), non statisticamente
significativi (Tab.3). Al contrario, è stato calcolato un significativo aumento del
rapporto GalN/GlcN (Tab.3 e Fig.7 e 8), determinato principalmente dall’incremento
delle GalN (Tab.3). I campioni di urine dei 7 pazienti affetti dalla forma severa di
MPS II hanno presentato livelli molto alti di esosamine totali rispetto ai controlli
normali , oltre il 300% in CE e oltre il 180% in HPLC, determinati principalmente da
un incremento significativo di GalN (Tab.3 e Fig.7 e 8). In effetti, un aumento
significativo del rapporto delle esosamine è stato osservato rispetto ai controlli sia in
HPCE/UV ( 90-130%) sia in HPLC/Fd (circa il 60%).
Profilo delle esosamine nelle urine dei pazienti MPS III.
Le urine di 6 pazienti affetti da MPS III tipo A, 5 da tipo B e 1 da tipo C (Tab.1),
sono stati sottoposti all’analisi delle esosamine. Come appare evidente dal confronto
con i controlli, un notevole e significativo aumento del contenuto totale delle
esosamine è stato determinato con entrambe le metodiche applicate ed in particolare
di circa il 440% con CE e di circa il 300% con HPLC (Tab. 4 e Fig. 7 e 8).
E’interessante notare che l’ammontare delle esosamine urinarie
è stato
principalmente determinato da un notevole incremento delle GlcN (circa 450-550%)
rispetto ai soggetti di controllo (Fig.6 B) con un significativo decremento del valore
del rapporto GalN/GlcN, circa 0.3 µg/mg creatinina ripetto a 0.9 dei soggetti in buona
52 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
salute (Tab.4). Infine, non sono state osservate differenze significative tra i pazienti
affetti dai tre tipi di MPS III, A, B e C.
Profilo delle esosamine nelle urine dei pazienti MPS IV.
Abbiamo analizzato le urine di 6 soggetti affetti da MPS IV A e di un paziente affetto
da MPS IV B (Tab.1). Non sono state riscontrate differenze tra i due sottotipi. Inoltre,
come si evince chiaramente dalla Tabella 4 e dalla Figura 8, un incremento della
quantità totale di esosamine è stato osservato, anche se queste differenze non sono
risultate statisticamente significative a confronto coi controlli. In solo 2 pazienti
affetti da MPS IV tipo A i livelli di esosamine urinarie sono risultati molto elevati
(indicate dalle frecce in Fig.7), a causa del notevole incremento della GalN. Infatti,
questi 2 soggetti hanno mostrato un rapporto GalN/GlcN di circa 1.0-1.3 (determinato
sia in CE sia in HPLC) superiore agli altri pazienti MPS IV (Fig.7). Come si può
vedere, confrontati agli altri pazienti Morquio, questi 2 soggetti hanno mostrato valori
anomali non correlati alla diagnosi clinica.
Profilo delle esosamine nelle urine dei pazienti MPS VI.
L’unico paziente affetto da MPS VI ha mostrato valori molto alti di esosamine
urinarie totali (+870% in CE e + circa 700% in HPLC) a causa del notevole
incremento della percentuale di GalN (+ circa 1500% in CE e + circa 930% in HPLC)
(Fig. 6C), producendo un valore molto alto di GalN/GlcN rispetto ai controlli (+ circa
130% in CE e + circa 70% in HPLC) (Tab.4 e Fig. 7 e 8).
53 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
7.4. METODO DEI DISACCARIDI URINARI
Caratterizzazione dei GAGs urinari in paziente MPS II prima e durante ERT
Fig.9. Elettroforesi GAGs urinari in paziente affetto da MPS II
54 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Fig. 10A. Dosaggio totale dei GAGs urinari (μg/mg creatinina) prima e durante ERT mediante
elettroforesi su gel di agarosio.
Fig. 10B. Dosaggio frammenti dei GAGs urinari (<1500 Dalton) (μg/mg creatinina)
I GAGs urinari misurati in un paziente affetto da MPS II prima e durante terapia in
diversi giorni e tempi per un periodo complessivo di oltre 10 mesi sono stati estratti
con il metodo convenzionale [31] e analizzati mediante elettroforesi in gel di agarosio
(Fig.9) e valutazione densitometrica per l’acquisizione quantitativa (poi i dati sono
55 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
stati normalizzati per la creatinina, Fig.10a). Inoltre, i GAG totali sono stati
determinati direttamente nei campioni di urine con il metodo colorimetrico standard
accettato dalle Linee Guida per il monitoraggio degli MPS usando il DMB (fig.10a)
(valori normali per età del DMB sono tra 22 e 86 µg/mg creatinina).
Come si evidenzia dall’elettroforesi, una banda riferibile a DS è stata osservata prima
e dopo terapia insieme a bande minori riferibili a CS (vedi -3,0,1 e 8 per esempio) e
allo standard HS (vedi 0,13,15, e 26 per esempio). La valutazione del contenuto totale
di GAG urinari realizzata con il metodo al DMB e con l’elettroforesi in gel di
agarosio normalizzati per mg di creatinina è illustrata in Fig.10a. Un notevole
incremento dei GAG totali urinari è stato misurato immediatamente dopo la prima
infusione di enzima col DMB (dopo 1-3 ore, circa +70%) e con l’elettroforesi in gel
di agarosio (circa +80% dopo 1 ora e +40% dopo 3 ore) seguito da più bassi valori
per gli 8 giorni successivi al trattamento. Un comportamento più o meno simile è
stato osservato dopo la seconda infusione con un notevole incremento dei GAG
urinari durante le prime ore immediatamente successive all’infusione seguite da un
costante decremento (fig.10a). Ulteriori infusioni dopo 16,26, 120 e 300 giorni hanno
prodotto modificazioni meno importanti nei livelli di GAG urinari. Inoltre, dopo 10
mesi di terapia, il contenuto totale di GAG urinari misurato al DMB produceva
ancora più alti valori rispetto al normale in accordo con altri studi mostrando una
riduzione ma non una normalizzazione dei valori di DMB urinari dopo molti mesi di
terapia [36,37]. Dobbiamo tener presente che il metodo al DMB è capace di misurare
i GAG ad alto peso molecolare insieme ai loro frammenti [17], al contrario
l’elettroforesi in gel di agarosio è capace di valutare molecole che hanno un peso
molecolare sopra i 1500 [30,31]. Di conseguenza, come illustrato in Fig. 10B,
confrontando i diversi dati, abbiamo calcolato che il totale di frammenti dei GAG
urinari con peso minore a 1500 eliminati durante l’ERT hanno un comportamento
similare ai GAG totali così come al DS ad alto peso molecolare. Infine, dopo le prime
due infusioni, è stata osservata una costante diminuzione del contenuto dei GAG
56 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
urinari ad alto peso molecolare ma con valori comunque ancora più alti di quelli dei
soggetti normali di pari età. Pertanto possiamo supporre che immediatamente dopo le
prime infusioni un alto ammontare di DS anomalo sia rimosso dai tessuti ed eliminato
con le urine in particolare durante le prime due settimane successive all’inizio della
terapia.
Tab. 5. CARATTERIZZAZIONE DEI GALATTOSAMINOGLICANI URINARI IN UN PAZIENTE AFFETTO
DA MPS II PRIMA E DOPO 120 GIORNI DI ERT
4S/6S Ratio
29.9
6.8
57 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Fig. 11. HPLC ed UV
detection a 232 nm di
disaccaridi nonsolfati e solfati
di galattosaminoglicani urinari
prima della terapia e digeriti
con A) condroitinasi ABC e B)
condroitinasi B
Fig. 12. HPLC ed UV
detection a 232 nm di
disaccaridi nonsolfati e solfati
di galattosaminoglicani urinari
dopo 300 giorni di terapia e
digeriti con A) condroitinasi
ABC e B) condroitinasi B
58 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
La banda principale di GAG urinari misurata in elettroforesi su gel d’agarosio prima
della terapia è stata definitivamente caratterizzata come DS da uno specifico
trattamento con condroitinasi ABC e liasi B, quest’ultima capace di degradare
polimeri di acido iduronico tipico di DS quindi specifica per DS [15].
I
galattosaminoglicani urinari, CS e DS, presenti nel nostro paziente MPS II prima
dell’ ERT (Fig. 11a) sono risultati essere composti principalmente da circa il 90% di
∆Di4s, circa il 3% di ∆Di6s e circa il 3% di ∆Di0s (Tab.5). Percentuali minori ma
significative di disaccaridi bisolfati, in particolare ∆Di2,4dis (2%) tipico del DS [15],
sono state anche osservate (tab.5). Di conseguenza, un polisaccaride molto ricco di
gruppi 4-sulfati sull’esosamina (rapporto 4s/6s di circa 30) è stato misurato nel
soggetto MPS II. Inoltre, l’uso di condroitinasi B (Fig.11b)mostrava la presenza
essenzialmente di
∆Di4s corrispondente a circa l’89% del totale dello stesso
disaccaride ottenuto dopo digestione con condroitinasi ABC nel nostro paziente
(Tab.5), confermando che i GAG urinari escreti sono essenzialmente composti per il
90% da DS e per il 10% da CS.
Dopo 10 mesi di terapia enzimatica sostitutiva continuativa, i GAG nelle urine erano
maggiormente composti dal 78 % di ∆Di4s, da circa l’11% di ∆Di6s e da circa il 4%
di ∆Di0s (Tab.5), mostrando un polisaccaride che ha ancora un alto rapporto 4s/6s
(circa 7) ma minore di quello presente prima della terapia dimostrando una riduzione
di DS di circa il 55-60%. Percentuali minori ma significative di disaccaridi
bisolfatati, in particolare ∆Di2,4dis (4%) sono state rilevate (Fig.12a) (Tab.5). L’uso
della condroitinasi B (Fig.12b) mostrava la presenza essenzialmente di
∆Di4s
corrispondente a circa il 40% dei disaccaridi prodotti dalla condroitinasi ABC,
confermando così che i GAGs urinari escreti durante l’ERT sono una miscela di CS
(circa 60%) e DS (circa 40%).
59 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Fig. 13. Percentuale di acido iduronico urinario (galattosaminoglicani) durante trattamento con ERT
analizzato mediante separazione HPLC dei disaccaridi ottenuti dopo digestione con condroitinasi ABC e
B.
La % di polisaccaride urinario composto da acido iduronico è riportata in Fig.13 in
dipendenza dei giorni e delle ore prima e durante terapia. In particolare, un
incremento di DS è stato misurato dopo la prima infusione enzimatica seguito da un
decremento progressivo intorno alla seconda infusione , dopodiché un nuovo
incremento di DS è risultato evidente , seguito da un decremento progressivo
continuo. Comunque, dopo 300 giorni di trattamento, l’ERT non è stata capace di
rimuovere totalmente il DS dalle urine, essendo ancora presente in un alta percentuale
di circa il 40%.
60 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Caratterizzazione dei GAGs urinari in due pazienti MPS I prima di ERT
2 millimetri di urine di due pazienti affetti da MPS I Hurler/Scheie con il metodo
convenzionale [31] ed analizzati con elettroforesi in gel di agarosio (Fig.14A) e
valutazione densitometrica (Fig. 14B) realizzata attraverso l’analisi di una singola
banda polisaccaridica, e quantificata rispetto a specifiche curve di calibrazione
costruite con una quantità assoluta totale di DS standard in progressivo aumento (da
0.5 a 5.0 µg).
Fig. 14 A) Elettroforesi GAG urinari con gel d’agarosio prima dell’ ERT, (B) Acquisizione densitometrica
delle bande
Come è evidente dall’elettroforesi, una singola banda che ha un tempo di migrazione
simile al DS standard è stata osservata per entrambi i pazienti. La natura DS di questa
61 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
specie è stata anche confermata col metodo di separazione dei disaccaridi in HPLC e
con l’elettroforesi in gel di agarosio dopo trattamento con condroitinasi ABC.
L’analisi quantitativa ha prodotto valori inferiori rispetto al DMB (513.3 vs circa 805
µg/mg creatinina per il paziente F e 336.5 vs circa 652 µg/mg creatinina per il
paziente M). Dobbiamo considerare che il metodo al DMB è capace di rilevare GAG
ad alto peso molecolare insieme con i frammenti [17], al contrario l’elettroforesi in
gel di agarosio è capace di valutare molecole che hanno una massa molecolare
superiore a 1500 [30,32]. Di conseguenza, circa il 36% e il 48% dei GAG totali (per
il paziente F e il paziente M rispettivamente) sono stati calcolati come frammenti con
massa molecolare inferiore ai 1500. In particolare, una gran percentuale di questi
frammenti a basso peso molecolare dovrebbe essere composta da HS che è stato
dimostrato essere presente nelle urine come oligomeri [11,12,13]. Inoltre, questi
frammenti non sono stati rilevati dall’elettroforesi e dall’ acquisizione densitometrica
(Fig. 14B) anche dopo trattamento specifico con condroitinasi ABC, che era stata
capace di rimuovere totalmente CS/DS confermando la loro natura di masse a basso
peso molecolare, inferiore ai 1500.
Attraverso l’applicazione del metodo di separazione dei disaccaridi con HPLC/UV e
trattamento con condroitinasi ABC (Fig.15), i GAG urinari dei soggetti MPS prima
della terapia risultavano composti da circa l’ 80% di ∆Di4s, circa il 10% di ∆Di6s e
circa il 7-8% di ∆Di0s (Tab.6).
62 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Fig.15. HPLC e UV detection a 232 nm di disaccaridi urinari dopo digestione con condroitinasi
ABC nel paziente F (A) e nel paziente M (B) prima della terapia.
Tab.6.
63 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Percentuali minori ma significative di disaccaridi bisolfati, in particolare ∆Di2,4dis
(1-2%) tipici del DS [15], sono state anche osservate (tab.6). Di conseguenza, un
polisaccaride molto ricco di gruppi 4-solfati sull’esosamina (rapporto 4s/6s di circa 710) (tab.6) è stato misurato nei soggetti MPS I. Inoltre, l’uso di condroitinasi B
specifica per l’acido iduronico tipico di DS mostrava la presenza essenzialmente di
∆Di4s corrispondente a circa il 75-78% del totale dello stesso disaccaride ottenuto
dopo digestione con condroitinasi ABC in entrambi i pazienti (Tab.6), confermando
che i GAG urinari escreti sono essenzialmente composti per il 75-80% da DS con un
20-25% di CS.
Caratterizzazione dei GAG urinari in due pazienti MPS I durante la ERT
Fig. 16. Elettroforesi dei
GAGs urinari in gel
d’agarosio durante l’ERT
del A)paziente F e
B)paziente M. C)
L’acquisizione
densitometrica delle bande
al tempo 0del paziente m è
anche illustrata.
64 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
La Fig.16 illustra il pattern elettroforetico dei GAGs urinari dei due pazienti MPS I
dopo 2 settimane di terapia. Una grande quantità di una singola banda è stata
individuata nelle urine del paziente M al giorno etichettato come 0 ossia quando
l’enzima è stato infuso ed è rimasta alta nei giorni 1,2 e 3 successivi al trattamento.
D’altra parte, nei giorni 4 e 5 le urine non hanno mostrato GAGs che al contrario
sono stati rilevati nei giorni 6 e 7 dopo l’infusione. Di conseguenza la seconda
infusione è avvenuta al giorno 7 e i GAG sono scomparsi il giorno 10 per poi
riapparire dal giorno 11 al giorno 14 (Fig. 16B). Un profilo simile è stato osservato
per il paziente F in cui una banda GAG presente in gran quantità è scomparsa dalle
urine il giorno 6 successivo alla prima infusione e nei giorni 9 e 10 ha mostrato una
ridotta concentrazione urinaria (Fig. 16A). Inoltre, al contrario dell’urina dei pazienti
prima dell’ERT (vedi Fig. 14B), una seconda banda che possiede minore mobilità e
lo stesso comportamento migratorio dell’HS standard è stata osservata (Fig. 16A e
16B) e più accuratamente determinata con l’analisi densitometrica (Fig. 16C). Questa
specie macromolecolare è stata rilevata in tutti i campioni di urine prelevati durante
l’ERT e confermata essere HS da specifico trattamento con acido nitroso.
I dati elettroforetici sono stati quantitativamente confermati dal metodo al DMB su
urine intatte [17] e dalla valutazione dei disaccaridi in HPLC. Applicando le
procedure di estrazione su 5 ml di urine, noi siamo stati in grado di determinare,
mediante la media di tre differenti approcci analitici (Fig.17) un contenuto di GAGs
urinari di circa 20-100 µg/mg creatinina, che sono assai vicini ai valori normali per
età [4].
65 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Fig.17. GAG urinari totali espressi in µg/mg creatinina del paziente F e del paziente M in differenti
giorni durante la terapia determinati dall’elettroforesi in gel di agarosio, dalla valutazione dei
disaccaridi in HPLC e dal metodo col DMB.
L’elettroforesi in gel di agarosio (e l’HPLC) ha rilevato il 64% per il paziente F e il
52% per il paziente M, prima dell’ERT, di GAG urinari misurati col DMB. Secondo
un precedente report, questi valori più bassi sarebbero dovuti alla presenza di
frammenti dei GAG e di oligomeri che si è dimostrato essere presenti nei soggetti
MPS I [12,13] e che hanno massa molecolare minore ai 1500 dalton non rilevabili
all’elettroforesi. Al contrario, in entrambi i pazienti sottoposti a ERT, i dati ottenuti
dal DMB concordano con quelli determinati dall’elettroforesi (vedi Fig. 17) e ciò è
probabilmente indicativo di una drastica diminuzione dei frammenti a basso peso
molecolare e degli oligomeri durante l’ERT. I GAG urinari dei pazienti MPS I
66 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
durante la terapia sono principalmente composti da circa il 61-62% di ∆Di4s, circa il
20% di ∆Di6s e circa il 13-15% di ∆Di0s (Tab.6), mostrando un polisaccaride con un
alto rapporto 4s/6s (circa 3.1). Percentuali minori ma significative di disaccaridi
bisolfati, in particolare ∆Di2,6dis (2%), ∆Di4,6dis (2%) e ∆Di2,4dis (1%), sono state
anche osservate (Fig. 18) (Tab.6).
Fig.18. HPLC e UV detection a 232 nm di disaccaridi urinari dopo digestione con condroitinasi
ABC nel paziente F (A) e nel paziente M (B)al tempo 0 dell’ERT.
67 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
L’uso della condroitinasi B mostrava la presenza essenzialmente di
∆Di4s
corrispondente a circa il 55-60% dei disaccaridi prodotti dalla condroitinasi ABC in
entrambi i pazienti, confermando che i GAG urinari escreti durante la terapia sono
una miscela di CS (circa il 40%) e DS (circa il 60%). Ai giorni 4,5 e 10 del paziente
M e al giorno 6 del paziente F non siamo stati in grado di mettere in evidenza alcun
tipo di polisaccaride solfato (Fig. 16).
68 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
DISCUSSIONE
Una diagnosi precoce ed accurata di mucopolisaccaridosi (MPS) è necessaria per
ottimizzare l’esito del trattamento, prevenendo così danni irreversibili ad organi, in
particolare per quelle forme in cui sono disponibili nuovi ed efficaci approcci
terapeutici quali la terapia enzimatica sostitutiva (ERT). Inoltre una valutazione
accurata del follow-up di trattamento con l’impiego di markers affidabili potrebbe
aumentarne l’efficacia, attraverso una migliore definizione di dosaggi e tempi.
L’obiettivo di questo lavoro è proprio quello di proporre dei metodi semplici,
affidabili, non invasivi, riproducibili ed economici utilizzabile sia per la diagnosi che
per il monitoraggio del trattamento.
Dal punto di vista sperimentale, è stato ideato un protocollo di determinazione
qualitativa e quantitativa delle esosamine contenute nelle urine mediante Elettroforesi
Capillare in UV e HPLC in fluorescenza. La loro concentrazione è di fatto correlabile
al contenuto in GAG; i risultati ottenuti con entrambi i metodi sono sovrapponibili.
Inoltre è stata impiegata una procedura d’analisi già nota, la misurazione dei
disaccaridi con HPLC in UV, ma mai applicata sinora allo studio dei GAG umani,
per il monitoraggio della terapia al fine di ottimizzarne l’efficacia.
Al momento, questo approccio analitico risulta non essere mai stato applicato
all’analisi quantitativa e qualitativa delle esosammine nella diagnosi di MPS. Questo
è molto importante considerando che i diversi tipi di MPS sono caratterizzati dal
deficit di differenti enzimi lisosomiali e dal conseguente accumulo nei lisosomi delle
cellule malate e successiva escrezione nei liquidi biologici di una vasta gamma di
eteropolisaccaridi ad alto peso molecolare, condroitin solfato (CS)/dermatan solfato
(DS), eparan solfato (HS) e cheratan solfato (KS), così come di frammenti di minor
peso molecolare. Tutti gli eteropolisaccaridi prodotti nelle urine di soggetti affetti da
MPS sono formati da disaccaridi, nei quali uno dei due monosaccaridi è sempre
galattosamina (GalN) o glucosamina (GlcN), a seconda del tipo di GAG. Questo
69 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
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approccio è capace di misurare i polisaccaridi ad alto peso molecolare e i frammenti a
basso peso molecolare, dopo una tappa controllata di degradazione chimica, così
come le esosammine presenti nei campioni come semplici monosaccaridi. La
valutazione simultanea di entrambe le esosammine ci permette di determinare le due
grandi famiglie di GAGs, i glucosaminoglicani composti da GlcN, come HS e KS
(HA ed eparina non sono comuni nelle urine) e i galattosaminoglicani composti da
GalN, come CS e DS, producendo così un altro utile marker per queste patologie.
Sono state osservate infatti correlazioni importanti tra la risposta analitica, la diagnosi
clinica e la gravità della malattia. Nei soggetti di controllo sono stati osservati bassi
livelli di entrambe le esosamine sono state osservate (mediante la HPCE e HPLC)
senza significative differenze dovute all’età. Simili quantità delle due esosammine
sono state trovate nei controlli con un piccolo incremento in GlcN, e nessuna
differenza per il rapporto GalN/GlcN calcolato come µg/mg creatinina. L’MPS I è
causato da una deficienza di α-L-iduronidasi, l’enzima lisosomiale che rimuove
selettivamente l’acido L-iduronico da GalNAc nel DS e GlcNAc nelle molecole di
HS. L’MPS I è caratterizzato da un ampio spettro di segni clinici, da una forma
severa, sindrome di Hurler, caratterizzata da un’inesorabile declino delle capacità
cognitive, alla forma attenuata, la sindrome di Hurler-Scheie e di Scheie, con una
minore progressione e moderato coinvolgimento del sistema nervoso centrale. In 14
nostri pazienti, abbiamo osservato un incremento della concentrazione urinaria di
esosammine, in particolare nella forma severa dovuto al forte incremento del
contenuto in GalN piuttosto che GlcN. Come conseguenza, il contenuto totale di
esosammine e il rapporto GalN/GlcN potrebbe essere usato come marker per uno
screening di massa per l’MPS I. Ad oggi, nessun dato analitico è stato mai trovato
essere correlato con la diagnosi clinica, segni di severità dell’MPS e sintomi. Le
procedure analitiche proposte sono invece capaci di distinguere tra la forma
mediamente severa e la severa di MPS I, utili per l’applicazione di possibili
appropriati interventi terapeutici. La sindrome di Hunter, legata al cromosoma X
70 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
(MPS II) è dovuta alla deficienza di attività dell’enzima L-iduronato-2- solfatasi, ed è
presente in due forme cliniche e genetiche distinte, una forma media ed una severa
che sono indistinguibili dal punto di vista biochimico. Il metodo proposto risulta in
grado di correlare lo spettro clinico con la severità delle due forme (in 11 pazienti),
con il contenuto totale di esosammine ed il rapporto GalN/GlcN [33]. Anche se
l’incremento del contenuto totale di esosamine non appare significativo comparato ai
controlli, la forma intermedia di MPS II mostra un significativo incremento nel
rapporto, utile come marker di screening. D’altra parte, la forma severa di MPS II
produce un forte aumento nelle esosamine totali e nel rapporto GalN/GlcN dovuto in
particolare al significativo aumento di GalN (come osservato nella forma intermedia).
Come per la forma severa di MPS I, questo approccio analitico potrebbe essere utile
per distinguere tra la forma intermedia e severa di MPS II per ulteriori possibili
interventi. MPS III, o sindrome di Sanfilippo, risulta dal deficit di 4 differenti enzimi
che sono necessari per degradare specificatamente l’HS. Abbiamo analizzato 12
pazienti affetti da MPS III appartenenti ai sottotipi A, B e C ma non è emersa nessuna
differenza significativa. Al contrario, il contenuto totale di esosamine risulta
fortemente aumentato comparato ai controlli e il rapporto GalN/GlcN trovato non è
significativo a causa dell’alto contenuto di HS. Questi risultati potrebbero essere
utilizzati come possibile marker di screening neonatale, anche considerando che la
sindrome di Sanfilippo è considerata la forma di MPS più comune. Nella sindrome di
Morquio (MPS IV) nessuna variazione nel totale di esosamine e/o nel rapporto
GalN/GlcN è stata osservata rispetto ai controlli, comparando i sottotipi IVA e IVB.
In ogni caso, due pazienti affetti dal tipo IVA mostravano un alto valore di
esosammine e in particolare la GalN era rilevante, con un forte incremento in KS e/o
CS (o DS). Approfonditi e più specifici approcci analitici sono necessari per
evidenziare possibili galattosaminoglicani anomali ed eventualmente per delineare
nuovi sottotipi. MPS VI (syndrome di Maroteaux-Lamy) deriva dal deficit dell’
attività
dell’enzima
N-acetilgalattosamina-4-solfatasi
71 (arilsolfatasi
B)
e
Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
dall’accumulo di DS. Come conseguenza, osserviamo un forte aumento di
esosammine nelle urine, relativo in particolare alla presenza di GalN proveniente dal
DS che determina un incremento del rapporto GalN/GlcN. Dopo maggiori ed
esaustivi trials clinici e di laboratorio, questi dati potrebbero essere utili per una
diagnosi biochimica di questa sindrome.
La valutazione qualitativa e quantitativa dei disaccaridi di GAG in seguito a
trattamento con enzimi [34], ha permesso lo studio della cinetica urinaria degli
enzimi ricombinanti impiegati nella terapia delle malattie d’accumulo. Questo è
molto importante considerando l’applicazione di queste misurazioni altamente
specifiche e sensibili con la caratterizzazione strutturale dei GAG nelle urine ed
eventualmente nel plasma, poiché può essere di estrema utilità per una valutazione
accurata della cinetica dei prodotti catabolici, suggerendo nuove strategie
terapeutiche più efficaci.
Di conseguenza, lo scopo finale di questo studio è l’esecuzione di trials clinici ed
analitici di gravi patologie, per la diagnosi ed il trattamento.
Abbiamo applicato il metodo dei disaccaridi alle urine di due pazienti affetti da MPS
I Hurler/Scheie in trattamento con alfa-L-iduronidasi da oltre 6 anni prima
dell’infusione e durante terapia per un periodo di osservazione complessivo di due
settimane. I pazienti M ed F sono stati riportati nei loro aspetti diagnostici e clinici in
un precedente lavoro [4] dove si metteva bene in evidenza l’efficacia clinica della
terapia in termini di stabilizzazione dei segni clinici preesistenti e di mancata
comparsa di nuovo effetti d’accumulo. Detto ciò, era ragionevole aspettarsi anche una
normalizzazione del profilo urinario dei GAGs. In realtà, a dispetto dell’evidente
efficacia clinica, la capacità dell’ERT con α-L-iduronidasi alle dosi standard
nell’eliminare definitivamente i DS patologici dalle urine è risultata parziale. Infatti,
un polisaccaride ad alto peso molecolare, di circa 11.500-12.000, appena maggiore
rispetto ai controlli (circa 11.000) è stato trovato nelle urine di entrambi i pazienti.
72 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
Questa macromolecola è risultata essere formata da una miscela di DS/CS avente
un’alta percentuale di disaccaride 4 solfato e acido iduronico (circa il 60%) per la
maggior parte associato con DS. Inoltre, minori ma significative percentuali (circa il
5%) di disaccaridi bisolfati, mai trovati nel CS urinario fisiologico, sono stati anche
evidenziati [31]. Insieme con questo inaspettato DS, dopo 6 anni di terapia
enzimatica sostitutiva continuativa, i disaccaridi tipici del CS fisiologico sono stati
anche osservati, così come i disaccaridi monosolfati composti da acido glucuronico
[31].
Da un punto di vista quantitativo, i GAG nei pazienti M e F sottoposti a ERT sono
risultati pari ai livelli normali per età in accordo con precedenti studi [4]. In aggiunta,
è stata misurata nelle urine di prima e dopo terapia una diminuzione di 5.6-5.7 volte
dei GAGs. Inoltre, valori normali o borderline di GAGs urinari sono stati misurati in
altri pazienti MPS soggetti a ERT in precedenti lavori col DMB test. Infine, molti
pazienti MPS I soggetti a ERT mostravano una marcata diminuzione dei disaccaridi
DS e HS nelle urine malgrado l’età e la severità clinica [27].
Insieme con i GAGs ad alto peso molecolare [11], anche i frammenti e gli
oligosaccaridi HS/DS sono escreti nelle urine dei pazienti MPS I [12,13]. Al
momento, non possiamo escludere la presenza di oligomeri derivati da HS e DS nelle
urine di pazienti trattati con ERT, ciò dovuto all’incapacità dell’elettroforesi di
rilevare molecole a basso peso molecolare. In ogni caso, la valutazione quantitativa
realizzata a seguito della comparazione tra DMB test e dati dell’elettroforesi prima e
durante terapia indicano la possibile assenza di questi frammenti in corso di terapia.
E’ interessante notare che la presenza di DS ad alto peso molecolare nelle urine dei
pazienti MPS I soggetti a ERT non è costante durante le due settimane di
osservazione, dimostrando l’incapacità dell’ERT alle dosi standard di eliminare
totalmente questo polimero dalle urine. Inoltre, è stato osservato un differente profilo
urinario della presenza di DS nei due pazienti trattati alle medesime condizioni,
73 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
suggerendo una possibile variabilità dell’efficacia in dipendenza del singolo
individuo. E’ noto che ci sono variazioni individuali [31] e quotidiane [35]
nell’escrezione dei GAGs urinari dei soggetti sani. Abbiamo anche osservato
variazioni giornaliere di GAGs urinari nei due pazienti anche prima della terapia.
L’ERT si è dimostrata incapace di eliminare completamente il DS dalle urine
indipendentemente dalle variazioni giornaliere verificatesi nell’arco delle due
settimane di osservazione così come allo stesso modo la caratterizzazione qualitativa
ha messo in evidenza ancora la presenza di un polimero anomalo non fisiologico
insieme con normale CS escreto nelle urine. Di conseguenza, noi crediamo che le
differenze giornaliere osservate per il DS urinario di entrambi i pazienti non siano
dovute
a normali cambiamenti quantitativi quotidiani ma all’ERT come unico
“meccanismo di catabolismo” capace in questi pazienti di rimuovere il DS
patologico. Al momento, noi non sappiamo se queste differenze nei profili dei GAGs
urinari dei pazienti in esame siano dovute ad una specifica capacità enzimatica o a
qualche fattore endogeno fortemente correlato all’individuo, o a qualche fattore
esterno capace di modificare l’efficacia enzimatica. Le nuove procedure analitiche
impiegate possono essere di estrema utilità nel monitorare la terapia e nel valutarne il
rapporto rischio-beneficio. Cosa è all’origine della costante presenza di DS ad alto
peso molecolare nelle urine dei pazienti trattati? Noi possiamo supporre che queste
molecole abbiano un’origine sistemica, che non siano totalmente degradate
dall’iduronidasi, escrete nel plasma, filtrate nel rene ed eliminate nelle urine. D’altra
parte, è noto che DS (e HS) si trova normalmente nel rene e nel tratto urinario,
pertanto il polisaccaride presente nelle urine dei soggetti MPS trattati potrebbe
originare direttamente da quegli specifici distretti a causa dell’incapacità dell’enzima
alfa-l-iduronidasi di agire in tale area. In conclusione, noi dimostriamo che a dispetto
di un drastico miglioramento clinico e della qualità della vita, un GAG ad alto peso
molecolare è ancora presente nelle urine dei pazienti MPS I soggetti a ERT da oltre 6
anni. Tale risultato implica alcune considerazioni. Il GAG urinario in questione è
74 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
stato caratterizzato come DS generalmente prodotto da MPS I, anche se presente in
minor quantità e con caratteristiche distintive. Inoltre, l’incapacità dell’ERT a
rimuovere totalmente i cataboliti prodotti in MPS I pone l’attenzione sulla possibilità
che il regime terapeutico attualmente in uso possa non essere efficace nel
diminuire/rimuovere completamente l’accumulo dei GAGs lisosomiali in specifici
distretti. Inoltre, una variazione dell’escrezione dei GAGs in dipendenza
dall’individuo è evidente e suggerisce la possibilità di adattare la terapia al paziente,
definendo un regime terapeutico più accurato e “personalizzato”.
Il metodo dei disaccaridi è stato applicato anche alle urine di un paziente affetto da
MPS II forma severa in trattamento con iduronato-2-solfatasi al tempo 0, ossia prima
di iniziare terapia, e durante terapia per un periodo di osservazione complessivo di 10
mesi.
L’ERT con iduronato-2-solfatasi è disponibile in commercio dal 2007 ma le prime
applicazioni in fase sperimentale sono state realizzate sin dal 2005. Nonostante ciò,
assai limitate sono le informazioni attualmente disponibili sugli effetti di questa
terapia enzimatica sostitutiva nei confronti delle macromolecole accumulate. In studi
clinici recenti [36,37,38] è stato trovato che l’escrezione dei GAGs urinari diminuisce
rapidamente nei primi tre mesi di trattamento, semplicemente attraverso la
valutazione con DMB.
Nel nostro studio, abbiamo applicato il metodo dei disaccaridi alle urine di tale
paziente prima e dopo terapia come fatto in precedenza per i pazienti affetti da MPS
I. Il difetto dei due enzimi responsabili per MPS I e II comporta l’accumulo della
stessa molecola GAG ad alto peso molecolare ossia DS e HS urinari (HS
maggiormente presente in piccoli frammenti). Infatti, anche nel paziente MPS II
prima della terapia, i GAGs urinari, si sono rivelati per la maggior parte composti da
circa il 90% ∆Di4s, con minori ma significative percentuali di disaccaridi bisolfati e
per il 90% da acido iduronico. Questo potrebbe spiegare la presenza di aspetti clinici
75 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
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simili per MPS I e II. Inoltre, sono state osservate correlazioni importanti tra la
risposta analitica, la gravità della malattia e l’efficacia di terapia. In un recente studio
[34] abbiamo trovato una correlazione tra la quantità totale di GAGs e la severità
della malattia MPS tipo I e tipo II. Di conseguenza, possiamo supporre ad esempio
che nel nostro paziente MPS II affetto, in quanto affetto dalla forma severa, l’ERT
possa essere risultata meno efficace nel rimuovere totalmente l’alto contenuto di DS
patologico. Come DS accumulato in MPS II che è ovviamente composto da acido
iduronico in opposizione al CS fisiologico non solfato presente anch’esso nelle urine,
noi abbiamo usato la % di acido iduronico calcolata nel totale dei GAGs per
monitorare l’efficacia di terapia dopo la prima infusione e a oltre 10 mesi di
trattamento. Nelle urine, un incremento di DS è stato misurato dopo la prima e la
seconda infusione seguito da una continua e progressiva diminuzione. Noi abbiamo
supposto che immediatamente dopo la prima infusione, un largo numero di DS
anomalo sia rimosso dai tessuti ripulendo il compartimento plasmatico ed eliminato
con le urine. E che in seguito solo piccoli cambiamenti si verifichino. Detto ciò, la %
di acido iduronico eliminata nelle urine rimane in fasi successive più o meno
costante. I dati sopra riportati, sono i primi a disposizione circa la cinetica urinaria di
tale enzima. E’ interessante notare che dopo 10 mesi di trattamento un’alta %(circa
40%) di DS nelle urine del paziente MPS II sia ancora presente. L’ERT con
iduronato-2-solfatasi alle dosi standard non rimuove completamente il DS dalle urine
dopo una terapia prolungata anche se ci sono evidenze che elimini un largo numero di
GAGs patologici già dopo le prime settimane di terapia infusionale. Infatti, dopo 10
mesi di trattamento, un basso numero di molecole ad alto peso molecolare sono state
misurate rispetto al pretrattamento, al contrario di quanto è accaduto per i frammenti,
ancora presenti nelle urine in largo numero. In accordo con quanto osservato nel
precedente lavoro sui pazienti MPS I, la presenza di DS nelle urine del paziente MPS
II durante le diverse settimane di trattamento è risultata incostante a conferma della
incompleta efficacia della terapia alle attuali dosi standard.
76 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
In conclusione, misure specifiche e sensibili e una caratterizzazione strutturale dei
GAGs urinari potrebbero essere utili per un più accurato follow-up dell’ERT, per la
messa a punto di nuovi trials clinici allo scopo di “personalizzare” le terapie o
ottimizzarne tempi e dosi, per la valutazione di nuovi approcci terapeutici e
possibilmente per una più precisa delineazione clinica, in particolare per l’MPS I e II
ma anche per tutte le altre forme di MPS.
77 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
CONCLUSIONI
Questo nuovo e mai applicato approccio analitico basato sulla determinazione delle
principali esosamine formanti i GAGs, produce importanti differenze comparate al
gruppo di controllo se applicato alle urine di pazienti affetti da varie forme di MPS.
In particolare, il contenuto totale di esosammine è indicativo di un’anormale
escrezione di GAGs e la specifica quantificazione di GalN e GlcN e il loro rapporto
relativo rappresentano i markers delle varie forme di MPS, sia severe che leggere.
Inoltre, sulla base dei dati ottenuti, possiamo supporre che la severità della sindrome
potrebbe essere ascritta alla quantità totale di GAGs, come polimeri ad alto peso
molecolare e frammenti, accumulati nelle cellule e direttamente escreti nelle urine.
Questo è un dato importante poiché, fino ad oggi, il livello urinario dei GAGs non è
stato considerato un attendibile indicatore della severità di MPS. Questi metodi sono
disponibili per nuovi screenings per la diagnosi precoce dei disordini e del loro
trattamento, oltre che per un accurato follow-up degli interventi terapeutici. In
aggiunta a quanto detto sinora, infatti, l’applicazione di metodiche analitiche già in
uso ad alta processività quale è la misurazione dei disaccaridi urinari applicata ai due
pazienti affetti da MPS I Hurler/Scheie e al paziente MPS II forma severa, ha fornito
per la prima volta dati importanti sulla cinetica dell’attività degli enzimi ricombinanti
α-L-iduronidasi e iduronato-2-solfatasi, attraverso la misurazione diretta dei prodotti
urinari da essi rilasciati e, seppur trattandosi di dati preliminari, può risultare
estremamente utile per una ottimizzazione dei regimi terapeutici già in uso in termini
di dosaggio e timing di infusione, per una eventuale messa a punto di un regime
terapeutico “personalizzato” e per una migliore valutazione delle nuove proposte
terapeutiche.
78 Caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari:
applicazione di nuove metodiche alla diagnosi e
al follow-up delle mucopolisaccaridosi
Dott.ssa Lucia Santoro
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Dott.ssa Lucia Santoro
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syndrome (mucopolysaccharidosis II, MPS II), Mol Genet Metab (2010) 99:18–25.
83 Ringrazio il Prof. Gabrielli ed il Prof. Coppa della Clinica Pediatrica dell’Università di Ancona ed
il Prof. Volpi del Dipartimento di Biologia Animale dell’Università di Modena che mi hanno
coinvolta in un progetto collaborativo di ricerca dal carattere di forte innovatività ed estrema
utilità. Ringrazio inoltre le biologhe del Laboratorio di Diagnosi e Prevenzione delle Malattie
Metaboliche di Ancona che sono la Dott.ssa Lucia Zampini, la Dott.ssa Lucia Padella e la Dott.ssa
Tiziana Galeazzi ed i Biologi del Laboratorio di Modena ossia la Dott.ssa Francesca Maccari, il
Dott. Fabio Galeotti e la Dott.ssa Dania Buzzega per aver reso possibile la messa a punto di queste
nuove metodiche.
Ringrazio sentitamente il mio caro marito, le mie adorate figlie, i miei impagabili genitori e tutti i
familiari e gli amici che sostengono quotidianamente il mio impegno nello studio e nella ricerca.