ANTI-EBV EA IgM ELISA
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Analisi immunoenzimatica per la determinazione
in vitro di anticorpi IgM contro l’antigene precoce
(EA) p54/p138 del virus di Epstein-Barr in siero o
plasma umano
SOMMARIO
1.
USO PREVISTO..............................................................................51
2.
PRINCIPI DELLA PROCEDURA.....................................................51
3.REAGENTI......................................................................................52
4.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI....................................................53
5.CAMPIONE.....................................................................................54
6.
MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO...........................54
7.
ISTRUZIONI PER L’USO................................................................54
8.
CONTROLLO QUALITÀ..................................................................56
9.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI.............................................56
10. LIMITAZIONI DEL TEST.................................................................57
11. RISULTATI PREVISTI.....................................................................58
12. CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE......................................58
13. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI ....................................................58
14. GUIDA PER LA RISOLUZIONE DI PROBLEMI..............................59
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1. USO PREVISTO
Anti-EBV EA IgM ELISA è un sistema per uso diagnostico in vitro per la
determinazione di anticorpi IgM contro gli antigeni precoci (EA) p54 e
p138 del virus EBV. I risultati ottenuti con questo test, congiuntamente ad
altri dati clinici e relativi a pazienti, ottenuti in saggi per la ricerca di altri
anticorpi specifici per il virus Epstein-Barr, quali IgG anti-EA, IgG/IgM antiVCA e IgG anti-EBNA-1, agevolano la diagnosi sierologica dell’infezione da
EBV. L’infezione primaria da EBV può avere esito in mononucleosi infettiva
(IM = morbo di Pfeiffer) (1,2). La malattia si verifica in modo predominante
tra gli adolescenti più prossimi all’età adulta e tra gli adulti giovani. La
malattia acuta può essere caratterizzata dalla seguente sintomatologia:
febbre, faringite, tonsillite, linfoadenopatia, nausea, mal di testa, mialgia,
epato-splenomegalia, leucocitosi (2). Altri agenti infettivi patogeni, quali
Citomegalovirus, Toxoplasma gondii, virus della Rosolia, virus dell’epatite,
virus dell’immunodeficienza umana (HIV) possono causare sintomi simili.
Anti-EBV EA IgM ELISA può essere impiegato per identificare un’infezione
da EBV.
2. PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Anti-EBV EA IgM ELISA è un’analisi immunoenzimatica (enzyme immuno
sorbent assay, ELISA) indiretta ad elevata sensibilità per la determinazione di
anticorpi specifici per l’EBV nel siero o nel plasma. Durante la prima fase di
incubazione gli anticorpi IgM del campione si legano agli antigeni ricombinanti
(rec) p54 e p138 (3-5) rivestiti per la micropiastra. Il materiale aspecifico sarà
rimosso mediante lavaggio. Il complesso risultante antigene-anticorpo viene
rilevato utilizzando un anticorpo monoclonale specifico marcato con enzimi,
diretto contro le IgM umane. Il coniugato legato in modo non selettivo sarà
rimosso in un’ulteriore fase di lavaggio. Nella fase di incubazione finale, la
soluzione di substrato (TMB, 3,3´,5,5´-tetrametilbenzidina) viene aggiunta nei
pozzetti. La reazione enzimatica viene bloccata aggiungendo acido solforico
(la colorazione cambia da blu a gialla) e la densità ottica (OD) è misurata con
uno spettrofotometro a 450 nm e con un filtro di riferimento di 615-690 nm.
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3.REAGENTI
Le quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire
l’esecuzione di 96 testi. Tutti i reagenti sono destinati all’uso esclusivo nella
diagnostica in vitro.
Identificazione
sull’etichetta
R1
Microplate
Descrizione
Micropiastra:
12 singoli strip con 8 pozzetti ciascuno,
rivestiti di antigeni ricombinanti p54/138 EAEBV (concentrazione: ≥ 0,4 μg/ml)
R2 EBV Concentrated Soluzione di Lavaggio Concentrata (x 500):
Washing Solution Conservante: 2-bromo-2-nitro-1,3(500x)
propandiolo 0,01%
Presentazione
1
Pronto per l’uso
1 x 6 ml
Da diluire
R3
EBV EA IgM
Negative
Control
Controllo Negativo IgM EA EBV:
Siero umano negativo per anticorpi IgM anti
EBV-EA e negativo per antigene HBs, antiHIV1, anti-HIV2 e anti-HCV
Conservante: gentamicina 0,005%,
streptomicina 0,05%, penicillina V 0,05%
1 x 1,2 ml
Pronto per l’uso
R5
EBV EA IgM
Positive
Control
Controllo Positivo IgM EA EBV:
Siero umano reactivo per anticorpi IgM anti
EBV-EA e negativo per antigene HBs, antiHIV1, anti-HIV2 e anti-HCV
Conservante: gentamicina 0,005%,
streptomicina 0,05%, penicillina V 0,05%
1 x 1,2 ml
Pronto per l’uso
R6
Conjugate
R7
EBV
Sample
Diluent
Diluente per campioni:
Conservante: solfato di neomicina 0,01%,
cloramfenicolo 0,03%
1 x 45 ml
Pronto per l’uso
R9
EBV
Chromogen
TMB
Cromogeno:
3,3´,5,5´ Soluzione di tetramethylbenzidina
(TMB) < 0,05 % in H2O
Vedere Avvertenze e Precauzioni
1 x 13 ml
Pronto per l’uso
R10
EBV Stopping
Solution
Soluzione Bloccante:
Acido solforico < 1 N H2SO4
1 x 15 ml
Pronto per l’uso
52
1 x 15 ml
Anti-IgM Umane Coniugato:
Pronto per l’uso
Anticorpo monoclonale marcato con
perossidasi di rafano
Conservante: penicillina V 0,025%, solfato di
streptomicina 0,025%, ProClin™ 300 < 1,5%
Identificazione
sull’etichetta
Storage Bag
Self-adhesive
transparent
foils
Descrizione
Presentazione
Sacchetto per Conservazione:
Sacchetto in polietilene per conservare le
strip per micropiastra residue
1
Pellicole Trasparenti Adesive:
Pellicole trasparenti adesive per sigillare
i pozzetti della micropiastra durante
l’incubazione
4
Conservanti: concentrazione totale < 0,11%
Requisiti per la manipolazione e la conservazione
I reagenti restano stabili fino alla data di scadenza indicata su ciascuna
singola etichetta, a condizione che gli stessi siano conservati ad una
temperatura di 2-8°C. Dopo l’apertura, i reagenti devono essere utilizzati
entro 30 giorni. In caso di test ripetuti, avere cura di conservare i reagenti
subito dopo l’utilizzo, ad una temperatura di 2-8°C. La micropiastra è sigillata
in un involucro di alluminio contenente essiccante e deve essere aperta solo
una volta raggiunta la temperatura ambiente. Riporre le strip non utilizzate
insieme all’essiccante nella busta con chiusura a zip e conservare come
indicato a 2-8°C. Non toccare il bordo superiore o il fondo dei pozzetti con
le dita.
4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Non ingerire i reagenti. Evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Tutti
i campioni e i materiali utilizzati per l’analisi devono essere trattati come
potenzialmente infetti, adottando adeguate precauzioni di sicurezza. I
controlli sono negativi per anti-HIV 1/2, anti-HCV, HBsAg, anti-sifilide e
transaminasi elevate. Non pipettare con la bocca. Adottare idonee pratiche
di laboratorio indossando guanti, abbigliamento e occhiali protettivi
adeguati. I liquidi e i materiali non combustibili devono essere decontaminati
con ipoclorito di sodio (concentrazione finale: 3%, con tempo di attività
di almeno 30 minuti). I rifiuti liquidi che contengono acidi devono essere
neutralizzati prima di essere eliminati. Le micropiastre e tutti i materiali da
riutilizzare devono essere autoclavati per 1 ora a 121°C. Il Cromogeno (R9) è
sensibile alla luce ed è quindi necessario proteggerlo dalla luce stessa. Il test
deve essere eseguito da tecnici di laboratorio autorizzati ed adeguatamente
addestrati. La procedura richiede condizioni asettiche e microbiologicamente
controllate. Se il kit originale è danneggiato informare il produttore.
AVVERTENZA: Alcuni reagenti contengono ProClin™ 300 < 1.5%
Per i rischi e le raccomandazioni di sicurezza consultare la tabella alla
fine dell’inserto della confezione.
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5.CAMPIONE
È necessario utilizzare campioni di siero o di plasma freschi, privi di emolisi.
Campioni di siero o plasma fortemente lipemici, itterici o microbicamente
contaminati e preparati di immunoglobuline concentrati potrebbero
compromettere l’affidabilità dei risultati del test. Evitare di congelare e
scongelare ripetutamente i campioni. Se è necessario trasportare i campioni,
confezionarli conformemente alle direttive in vigore per il trasporto di
materiale infetto. Non inattivare i campioni, per evitare reazioni aspecifiche.
6. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
Micropipette, spettrofotometro (450 nm, lunghezza d’onda di riferimento
615-690 nm), sistema di lavaggio micropiastra (con lavaggio del fondo),
incubatrice (37°C) per micropiastre.
7. ISTRUZIONI PER L’USO
Preparazione dei reagenti
Diluire la Soluzione di Lavaggio Concentrada (R2) con acqua demineralizzata
o deionizzata (1:501). La Soluzione di Lavaggio così preparata rimane stabile
per 1 settimana, a condizione che sia conservata a 2-8°C. Tutti gli altri
componenti per il test vengono preparati in modo da essere pronti per l’uso.
Tutti i reagenti sono specifici per lotto e non possono essere utilizzati con kit
di lotti diversi. Non utilizzare reagenti di altri produttori.
Preparazione dei campioni
Si raccomanda di attenersi strettamente al protocollo (vedere la procedura
di pipettamento).
• Diluizione campione 1:21 con prediluizione in provette:
Diluire i Controllo Negativo (R3), Controllo Positivo (R5) e i campioni a 1:21
in una provetta (ossia 25 μl di controllo o campione + 500 μl di Diluente
(R7)). Miscelare accuratamente.
• Diluizione del campione 1:21 con diluizione direttamente nella piastra:
Pipettare 200 μl di Diluente (R7) in ciascun pozzetto. La diluizione effettuata
direttamente nella micropiastra è consigliata soprattutto con l’utilizzo di
pipettatrici automatiche. Se la diluizione effettuata nella piastra viene
eseguita manualmente, è importante evitare legami aspecifici di proteine,
attenendosi alle seguenti fasi: Pipettare prima 200 μl di Diluente (R7) nel
pozzetto, quindi aggiungere 10 μl di campione o controlli. Miscelare da 5
a 7 volte, aggiungendo 10 μl di campione o controllo.
Procedura di lavaggio
54
La procedura di lavaggio ha un’importanza primaria. Un lavaggio
insufficiente potrebbe compromettere la precisione e provocare reazioni
aspecifiche.
Lavare 5 volte con soluzione tampone. Per farlo, rimuovere il liquido nel
pozzetto ed erogare 300μl di soluzione tampone. Ripetere la procedura di
lavaggio 5 volte. A lavaggio terminato, picchiettare sulla piastra. Non lasciare
che la piastra diventi secca.
Procedura di pipettamento per la determinazione qualitativa delle
IgM (provetta di diluizione)
Consentire a tutti i reagenti di raggiungere la temperatura ambiente prima dell’uso.
I controlli e il bianco devono essere pipettati per ultimi. Dopo avere pipettato i controlli e i campioni,
procedere immediatamente all’incubazione della piastra.
Fase 1
Pozzetto [µl]
A1/B1
C1/D1
E1/F1
G1…
200 µl R7
-
-
-
Doppio test Controllo Negativo (R3)
-
200 µl R3
-
-
Doppio test Controllo Positivo (R5)
-
-
200 µl R5
-
Campione 1:21
-
-
-
200 µl Campione
Blanco
Sigillare la piastra utilizzando le pellicole adesive (non richiesto in sistema ELISA*)
Incubazione 60 ± 2 min., 37 ± 1°C Sistema*: 60 ± 2 min., 37 ± 1°C
Lavaggio 5x
Soluzione di Lavaggio Diluata (R2)
300 µl
300 µl
Fase 2
Coniugato (R6)
300 µl
300 µl
Pozzetto [µl]
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Sigillare la piastra utilizzando le pellicole adesive (non richiesto in sistema ELISA*)
Incubazione 30 ± 1 min., 37 ± 1°C Sistema*: 30 ± 1 min., 37 ± 1°C
Lavaggio 5x
Soluzione di Lavaggio Diluata (R2)
300 µl
300 µl
Fase 3
Cromogeno (R9)
Incubazione 30 ± 1 min.,
a temperatura ambiente e al buio
Soluzione Bloccante (R10)
300 µl
300 µl
Pozzetto [µl]
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Sistema*: 15 ± 1 min.,
a temperatura ambiente e al buio
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Misurare l’estinzione immediatamente o entro 15 minuti dopo il bloccaggio a 450 nm utilizzando
uno spettrofotometro (lunghezza d’onda di riferimento: 615 - 690 nm).
* Se viene impiegato un sistema ELISA, è responsabilità dell’operatore
convalidare il test.
55
8. CONTROLLO QUALITÀ
Tutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di
qualità, dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del
prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può essere
commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La
documentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto è
conservata presso Bio-Rad.
9- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
I campioni con un valore di estinzione al di sotto dell’area grigia sono da
considerarsi negativi. Un campione che presenti un valore di estinzione
uguale o maggiore rispetto alla zona grigia, è da considerarsi positivo per
anticorpi IgM specifici per EA-EBV. Se il valore OD del campione ritestato è
compreso nella zona grigia (risultato non affidabile), si consiglia di richiedere
un campione di controllo.
Calcolo del valore di cut-off e dell’area grigia
Il valore di cut-off viene calcolato dal valore medio OD (densità ottica) del
Controllo Negativo (R3X) più 0,200:
• Valeur seuil = R3X + 0,200
L’area grigia si estende tra il valore di cut-off e il valore di cut-off meno 10%.
Criteri di convalida della determinazione qualitativa
Dopo la misurazione dei valori di estinzione a 450 nm in tutti i pozzetti (filtro
di riferimento: 615-690 nm), il valore medio dei bianchi viene sottratto dai
valori di estinzione dei controlli e dei campioni:
• Estinzione media dei bianchi ≤ 0,100 OD
Dopo la sottrazione del bianco, i valori di controllo devono soddisfare i
seguenti criteri di validità:
• Valore OD medio di R3 ≤ 0,200
• Valore OD medio di R5 ≥ 0,400
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Schema intepretativo del test IgM EA
Stato dell’infezione
da EBV
Tipologia di reazione Anti-EBV EA + EBNA ELISA
EA
IgM
EA
IgG
EBNA
IgG
IgM EA
soglia
(DO=0,5)
EBNA
soglia
(DO=0,5)
Infezione acuta
Fase precoce
+
–
–
≥ 0,5
–
Infezione primaria
+
+
–
–
–
Infezione primaria
+
+
(+)
–
< 0,5
Fase tardiva
–
+
–
–
–
Infezione acuta incerto
–
–
–
–
–
Fase precoce incerto
Sieronegativo
(+)
–
–
< 0,5
–
Fase tardiva incerto
+
–
(+)
–
< 0,5
Riattivazione
Secondaria (debole)
+
–
+
≥ 0,5
≥ 0,5
Riattivazione
+
+
+
–
≥ 0,5
Infezione precedente
–
+
+
–
–
Infezione precedente
–
–
+
–
–
Infezione precedente
(+)
–
+
< 0,5
–
Infezione precedente
10-LIMITAZIONI DEL TEST
Un risultato negativo del test ottenuto con l’analisi Anti-EBV EA IgM ELISA
non è sufficiente per escludere completamente un’infezione da EBV. I risultati
dell’analisi vanno interpretati congiuntamente alle informazioni disponibili
sulla valutazione clinica del paziente e ad altre procedure diagnostiche. I
risultati ottenuti testando campioni prelevati da pazienti immunodepressi
non sono semplici da interpretare. Il test potrebbe fornire risultati falsamente
positivi per individui che abbiano ricevuto trasfusioni di sangue o altri
prodotti emoderivati nei mesi immediatamente precedenti. Anti-EBV EA IgM
ELISA è stato impiegato con i seguenti campioni con potenziale reattività
crociata: campioni con positività per gli anticorpi anti-Varicella stato acuto
(6), positività per gli anticorpi anti-Citomegalovirus stato acuto (6), antiHerpes simplex tipo 1 e 2 (5) e anti-Toxoplasmosi (5). Nessuno dei campioni
analizzati è risultato positivo con Anti-EBV EA IgM ELISA.
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11.RISULTATI PREVISTI
99 campioni di siero prelevati da donatori di sangue sani e asintomatici,
sono stati analizzati con il Bio-Rad EA IgM ELISA. Dei 99 campioni, 5
sono risultati positivi (5,05%) e 94 sono risultati negativi (94,95%), il che
corrisponde alle statistiche riconosciute per la prevalenza di esposizione
all’EBV nella popolazione adulta. La prevalenza varia secondo una serie di
fattori quali la posizione geografica, lo stato socioeconomico, la razza, il tipo
di test impiegato, le procedure di prelievo e manipolazione campioni e la
storia clinica e epidemiologica (5,6). Sono stati analizzati i sieri prelevati da
pazienti reduci da malattie da CMV (20), Toxoplasma (20) e reumatoide. (20)
Impiegando il sistema EA IgM, EA IgG e EBNA IgG ELISA, è stato possibile
identificare 7, 17 e 29 campioni con infezione da EBV primaria, riattivata e
precedente (4).
12.CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE
Sensibilità e specificità
I risultati ottenuti con il test per la determinazione delle IgM EA anti-EBV
unitamente ad altre analisi quali la determinazione delle IgG anti-EA e delle
IgG anti-EBNA-1 agevolano la diagnosi sierologica dell’infezione da EBV (3).
In pazienti affetti da mononucleosi infettiva (IM), la sensibilità del sistema
di test ELISA relativa a queste tre analisi è stata definita pari al 99,2%. La
specificità era pari al 98,8% (4).
Precisione
Un testpanel di 10 sieri rappresentanti campioni con reattività scarsa, bassa
ed elevata è stato testato in 11 giorni differenti. La variabilità inter-analisi di
questi sieri era compresa nel range 10,0%-16,9%.
I campioni dello stesso panel sono stati testati 8 volte nell’ambito dello
stesso ciclo di test. La variabilità intra-analisi di questi sieri era compresa
nel range 2,8%-6,3%.
13.RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
1.Linde, A. (1992). Rev. Med. Microbiol. 3, 43-51.
2.Straus, S., Cohen, J.I., Tosato, G. and Meier, J. (1993). Ann. Int. Med. 118,
45-58.
3.Gorgievski-Hrisoho, M., Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J.,
Vornhagen, R., Sonneborn, H.-H., H., Wolf, H. and Siegl, G. (1990). J. Clin.
Microbiol. 26, 2305-2311.
4.Färber, I., Wutzler, P., Wohlrabe, P., Wolf, H., Hinderer, W. and Sonneborn,
H. -H. (1993). J. Virol. Meth. 42, 301-108.
58
5.Hinderer, W., Nebel-Schickel, H., Horn, J., Vornhagen, R., Wenger-Süss,
R. and Sonneborn, H. -H. (1993). Biotest Bulletin 5, 33-46.
6.Tamir, D., Benderley, A., Levy, J. et al. (1974). Pediatrics 53, 330.
14.GUIDA PER LA RISOLUZIONE DI PROBLEMI
1.Inatteso alto tasso di risultati reattivi:
a.I campioni e i controlli sono stati pipettati prima di pipettare il Diluente
(R7).
b.La miscelazione è stata insufficiente.
2.Valore di bianco medio maggiore rispetto al criterio di validità, ≥ 0,100 OD:
a.Il Cromogeno (R9) ha assunto colorazione blu a causa di ossidazione o
contaminazione.
b.Errore lavaggio: Eseguire la fase di 5 cicli di lavaggio. Se si utilizza un
dispositivo di lavaggio manuale, eseguire una fase di 7 cicli di lavaggio.
Utilizzare La Soluzione de Lavaggio (R2) Bio-Rad se contenuto nel kit.
c.Errore durante l’incubazione: Temperatura troppo elevata, il tempo
di incubazione è stato superato o la piastra non è stata incubata
direttamente dopo il pipettamento.
d.Errore di lunghezza d’onda: La misurazione senza un filtro di riferimento
determina un aumento dei valori OD di circa + 0,120 OD.
3.Colorazione gialla in tutti i pozzetti (vedere 2a, 2b):
a.Contaminazione del Soluzione de Lavaggio (R2); preparare una nuova
soluzione Soluzione de Lavaggio (R2).
b.Contaminazione del Diluente (R7) o del Coniugato (R6); ripetere il
test con reagenti provenienti da fiale sigillate. Utilizzare i reagenti in
condizioni di ridotta presenza microbica.
4.Valore medio di Controllo Positivo (R5) ≤ 0,400 OD:
a.Superamento della data di scadenza.
b.Temperatura troppo bassa o scesa durante l’incubazione.
c.Errore lavaggio: Lavaggio troppo intensivo o contatto meccanico del
collettore e della fase solida del pozzetto.
d.Contaminazione di Controllo Positivo (R5) o 3b.
5.Valore medio di Controllo Negativo (R3) ≥ 0,200 OD (vedere 1 e 2 a-d):
a.Controllo Negativo (R3) non è stato pipettato dopo il pipettamento
dei campioni; pipettare tutti i campioni prima di pipettare i bianchi e i
controlli.
b.Contaminazione con il coperchio del Controllo Positivo (R5).
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60
61
Printed in France
Bio-Rad
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