UNIVERSITA’ POLITECNICA DELLE MARCHE
FACOLTA’ DI AGRARIA
Scuola di Dottorato di Ricerca in Scienze Agrarie
ALIMENTI E SALUTE
X ciclo nuova serie
Coordinatore: Prof. Silverio Ruggieri
ANALISI FUNZIONALE E STRUTTURALE DELLA
NICOTINAMMIDE MONONUCLEOTIDE DEAMIDASI, UN
NUOVO ENZIMA DEL METABOLISMO DELLA VITAMINA B 3
Dottoranda:
Paola Bocci
Docente guida:
Prof.ssa Nadia Raffaelli
A.A. 2008-2009/2010-2011
Indice
INDICE
1.INTRODUZIONE
4
1.1 La vitamina B 3
4
1.2
Le forme mononucleotidiche della vitamina B3
9
1.3
La biosintesi della vitamina B 3 nei batteri
12
1.3.1 Biosintesi de novo
1.3.2 Vie di recupero
14
18
1.4 M etabolismo dei mononucleotidi piridinici nei batteri
23
1.5 NM N deamidasi
23
2. MATERIALI E METODI
26
2.1 Determinazione dell’attività NMN deamidasica
26
2.1.1 Saggio in HPLC
2.1.1.1 Saggio accoppiato
2.1.1.2 Saggio diretto
2.1.2 Saggio spettrofotometrico
2.1.2.1 Saggio continuo
2.1.2.2. Saggio discontinuo
26
26
28
29
29
32
2.2 Preparazione degli estratti di S.oneidensis
34
2.3 Determinazione della concentrazione proteica
35
2.4 Determinazione dei livelli di NM N e NaM N
35
2.4.1 Estrazione acida dei nucleotidi
2.4.2 Estrazione con etanolo dei nucleotidi
2.4.3 Rilevazione e quantificazione dei mononucleotidi
2.5 Purificazione dell’ NaM N adeniltrasferasi (nadD)
2.5.1 Determinazione dell’attività NaMN
adeniltrasferasica (NadD)
35
35
36
37
39
2
Indice
2.6 Espressione e purificazione delle proteine YgaD, YdeJ
e YfaY
41
2.7 Analisi elettroforetica
42
2.8 Determinazione del peso molecolare nativo dell’NM N
deamidasi
42
2.9 Analisi bioinformatiche
43
2.10 Homology modelling e docking
43
2.11 Costruzione dei mutanti di S. oneidensis
44
3. RISULTATI E DISCUSSIONE
45
3.1 Conferma del ruolo fisiologico di PncC nel
recupero/riciclo della nicotinammide
45
3.2 Ruolo dell’ NM N deamidasi nel controllo dei livelli
intracellulari di NM N
49
3.3 Analisi della composizione in domini dell’NM N
deamidasi di S.oneidensis
52
3.4 Identificazione del dominio responsabile dell’attivita’
NM N deamidasica
54
3.5 Caratterizzazione dell’NM N deamidasi di E. coli
58
3.5.1 Purificazione della proteina ricombinante
3.5.2 Proprietà molecolari
3.5.3 Proprietà catalitiche
3.5.3.1 pH ottimale
3.5.3.2 Determinazione della Km
3.5.3.3 Specificità di substrato ed effetto di molecole correlate
al metabolismo del NAD
58
59
60
60
61
62
3.6 Distribuzione filogenetica del dominio PncC
63
3.7 Analisi strutturale dell’ NM N deamidasi
68
4. CONCLUSIONI
71
5. BIBLIOGRAFIA
73
3
1- Introduzione
Capitolo 1
INTRODUZIONE
1.1 La vitamina B 3
Con il termine Vitamina B3 (o niacina, o vitamina PP) ci si riferisce
all’acido
nicotinico
(acido
piridin-3-carbossilico)
e
ai
suoi
derivati
nicotinammide e nicotinammide riboside (Figura 1) che possiedono attività
biologica simile.
Nicotinato
(Na)
Nicotinammide
(Nm)
Nicotinammide
riboside (RNm)
Figura 1 Struttura molecolare delle tre forme della vitamina B 3
Tutte e tre le forme della vitamina B 3 sono precursori della sintesi del
nicotinammide adenin dinucleotide (NAD+) e del suo derivato fosforilato
(NADP+) (Figura 6).
La niacina è abbondante in molti tipi di carne, fegato, legumi, latticini,
fagioli, vegetali a foglia verde, caffè e tè. Anche il mais contiene elevate
quantità di Na e Nm, ma in forme legate e quindi non biodisponibili. Per
incrementare la biodisponibilità di niacina è necessario sottoporre questo
cereale ad un trattamento alcalinizzante. Tale pratica era utilizzata dalle
popolazioni native del Sud America, le quali infatti erano pr otette dalla
deficienza da vitamina. Studi condotti su animali hanno dimostrato che il mais
4
1- Introduzione
non trattato causa la deficienza di vitamina e che tale effetto può essere
contrastato integrando la dieta a base di mais con il latte, alimento noto per
essere ricco di NmR (Bieganowski & Brenner, 2004). Nella carne, la vitamina si
trova principalmente sotto forma di NAD e NADP, mentre relativamente bassi
sono i livelli di Na e Nm (Turner & Hughes, 1962). La Nm viene liberata dal
NAD(P) dagli enzimi della mucosa intestinale (Turner & Hughes, 1962), mentre
l’Na viene formato per deamidazione della Nm ad opera della nicotinammidasi
dei batteri presenti nel lume intestinale (Bernofsky, 1980). Le due forme di
niacina, sia introdotte tal quali, sia prodotte nell’intesti no come descritto, dopo
essere state assorbite, entrano nel flusso sanguigno per essere distribuite nei
vari tessuti (Turner & Hughes, 1962; Ijichi et al., 1966; Tanigawa et al., 1970).
E’ stato riportato che l’assorbimento di Nm è maggiore rispetto a quel lo di Na
quando le fonti di vitamina nella dieta sono il NAD e il NADP (Streffer & Benes,
1971). Infine, il NAD introdotto come tale con la dieta può essere degradato nel
lume intestinale a NMN e questo defosforilato a NmR, il quale viene assorbito
dalle cellule, e attraverso una serie di pathway metabolici, viene riconvertito a
NAD.
L’uomo è in grado di sintetizzare la niacina a partire dal triptofano; si
ritiene che 60 mg di triptofano possano dare origine a livello epatico a 1 mg di
niacina (1 mg di “equivalente di niacina” o NE). Le vitamine B 2 e B6, insieme al
ferro, sono necessarie per la conversione del triptofano a niacina. La capacità
di conversione dell’amminoacido nella vitamina varia da individuo a individuo,
aumenta in condizioni di deficienza di proteine e di triptofano, mentre
diminuisce in presenza di un’assunzione eccessiva di leucina. La dose
giornaliera raccomandata espressa in equivalenti di niacina è di 16 NE per
l’uomo e di 14 NE per la donna.
In Figura 2 sono schematizzate le principali vie metaboliche attraverso
cui
il
triptofano,
la
nicotinammide
e
l’acido nicotinico
assunti
con
l’alimentazione vengono convertiti a NAD.
5
1- Introduzione
Figura 2 Schema del metabolismo della vitamina B3 e dell’enzima PARP-1. Nella figura, il
termine niacina si riferisce alla forma deamidata della vitamina (acido nicotinico)
La deficienza di niacina causa la pellagra, i cui sintomi principali sono
rappresentati
da
sfoghi
cutanei
foto-indotti,
dermatiti,
disturbi
gastrointestinali e neuropsichiatrici. Circa un centinaio di anni fa la pellagra
era una malattia molto diffusa tra la popolazione rurale povera di molti Paesi,
compresa l’Italia, e si credeva fosse una malattia di tipo infettivo. Tuttavia nel
1914, Joseph Goldberger verificò l’ipotesi per cui la pellagra potesse essere
causata da una deficienza alimentare, e scoprì che sostituendo una dieta a
base di frumento con uova, latte e carne, la malattia veniva curata e prevenuta
(Goldberger, 1914). Ventitre anni più tardi, Conrad Elvehjem dopo aver
ottenuto da un estratto deproteinizzato di fegato una frazione di Na e Nm,
dimostrò che queste molecole avevano la proprietà di guarire una malattia dei
cani nota per la sua sintomatologia come "black tongue" (lingua nera),
conosciuta da tempo come l’equivalente della pellagra umana (Elvehjem et al.,
1937). I successivi studi biochimici identificarono la Nm come componente
fondamentale del NAD e del NADP e dimostrarono che gli animali affetti da
pellagra mostravano una significativa diminuzione dei livelli di NAD e NADP
nei muscoli e nel fegato (Axerold et al., 1939).
Oggi la deficienza di vitamina B 3 è un evento molto raro nei paesi
industrializzati (Graham, 1993); tuttavia diete povere, anoressia, alcolismo,
AIDS e altre malattie, possono causare sintomi pellagra-simili. Inoltre, disturbi
pellagra-simili (dermatite,
disturbi
psichici) sono tipici
della sindrome
6
1- Introduzione
metabolica, nota come malattia di Hartnup, causata da un’anomalia nel
trasporto gastrointestinale e renale di alcuni aminoacidi, tra cui il triptofano.
Tali sintomi vengano alleviati e in alcuni casi addirittura prevenuti dalla
somministrazione della vitamina B3 (Penberthy W.Todd, 2007).
Per molto tempo si è pensato che le manifestazioni cliniche della pellagra
fossero dovute alla diminuzione dei livelli di NAD e NADP a concentrazioni non
più sufficienti a garantire l’energia necessaria per le varie funzioni cellulari. In
effetti queste molecole svolgono un ruolo centrale nel metabolismo cellulare di
tutti gli organismi viventi essendo cofattori universali e ubiquitari di gran parte
delle deidrogenasi impegnate nelle vie metaboliche. Tuttavia, la comprensione
della grande varietà e complessità dei sintomi della pellagra è progredita in
seguito alla scoperta che la massima parte del pool cellulare del NAD non è
utilizzato come coenzima nelle reazioni metaboliche di ossidoriduzione, ma
viene consumato dalle poli (ADP-riboso)polimerasi (PARPs). Questi enzimi
idrolizzano il legame N-glicosidico del dinucleotide, liberando la nicotinammide
e trasferendo l’ADP-riboso a proteine accettrici di varia natura, ADPribosilandole e modificandone così la funzione biologica.
La poli-ADP-ribosilazione svolge ruoli molteplici nella riparazione del DNA
danneggiato, nel mantenimento della stabilità genomica, nella regolazione
trascrizionale, nell’ apoptosi e in molte altre funzioni cellulari. Per quanto
riguarda ad esempio il coinvolgimento della PARP-1 nel riparo del DNA, è noto
che la sua attivazione può stimolare tre diversi pathway cellulari, a seconda
dell’intensità del danno. Nel caso in cui il danno al DNA è lieve, l’attivazione
della PARP-1 stimola il riparo del DNA e determina quindi la sopravvivenza
della cellula; se il danno non è riparabile, l’attivazione dell’enzima induce la
morte cellulare per apoptosi; infine, se il danno è severo, la PARP-1 viene
iperattivata, con conseguente diminuzione dei livelli cellulari di NAD, le cellule
consumano ATP cercando di risintetizzare il NAD e questo porta ad una
significativa diminuzione dell’energia disponibile con conseguente necrosi
(Figura 3).
7
1- Introduzione
Figura 3 Ruolo della PARP-1 nella risposta cellulare al danneggiamento del DNA
Studi effettuati sia in vivo che in vitro hanno dimostrato che la
diminuzione dei livelli di NAD+ nelle cellule determina un rallentamento dei
meccanismi di poli-ADPribosilazione, causando così l’ aumento dell’ instabilità
genomica conseguente a stress ossidativi o genotossici. La nicotinammide
assunta con la dieta è in grado di rifornire le PARPs del substrato NAD, e in
alcuni studi è stato osservato che mantenere la vitamina ad un livello ottimale
è indispensabile nei malati di cancro e negli individui a rischio di esposizione
ad agenti genotossici. Studi su modelli animali hanno tuttavia dimostrato che
la
somministrazione
carcinogenesi
a
di
nicotinammide
seconda
del
può avere effetti
carcinogeno
e
dell’organo
diversi sulla
target.
Ciò
probabilmente riflette la differente sensibilità di ogni organo agli agenti che
danneggiano il DNA, al fatto che la distribuzione della PARP-1 è tessuto- e
cellula-specifica, e all’osservazione che il NAD viene sintetizzato a partire da
precursori vitaminici diversi (Na, Nm, NmR) a seconda dell’or gano (Surjana et
al., 2010).
Sia la nicotinammide che l’acido nicotinico sono proposti come agenti
farmacologici nei confronti di altre patologie: la nicotinammide, ad esempio, ha
azione
protettiva
nei
confronti
della
neurodegenerazione
indotta
dall’assunzione di etanolo durante lo sviluppo del feto (Ieraci & Herrera, 2006)
8
1- Introduzione
e la somministrazione di alte dosi di acido nicotinico è in grado di abbassare i
livelli di colesterolo e di trigliceridi nel sangue (Capuzzi et al., 2000; Kamanna
& Kashyap, 2000).
1.2 Le forme mononucleotidiche della vitamina B 3
Le due forme mononucleotidiche della vitamina B 3 (Figura 4), la
nicotinammide mononucleotide (NMN) e il nicotinato mononucleotide (NaMN),
sono state oggetto di recenti studi che ne hanno dimostrato il coinvolgimento
in diversi processi cellulari.
C
NadC
NadV
PRPP
PPi
Nicotinammide
mononucleotide
(NMN)
Nicotinato
mononucleotide
(NaMN)
Figura 4 Struttura molecolare delle forme monucleotidiche della vitamina B 3
Yoshino et al. (2011) hanno osservato che negli organi di topi affetti da
diabete di tipo 2, indotto da una dieta ricca di grassi, la sintesi del NAD a
partire dal mononucleotide NMN è seriamente compromessa e i livelli di NAD
sono
significativamente
ridotti.
Gli
Autori
hanno
dimostrato
che
la
somministrazione del mononucleotide determina il ripristino dei livelli di NAD
nel fegato e nel tessuto adiposo e migliora la tolleranza al glucosio. L’NMN
aumenta anche la sensibilità epatica all’insulina nei topi femmina; nei maschi
l’effetto risulta meno evidente facendo ipotizzare che l’NMN risulti efficace su
tessuti target diversi nei due sessi. L’NMN è inoltre in grado di ripristinare
l’espressione di quei geni che vengono soppressi da una dieta ricca di grassi e
che sono correlati allo stress-ossidativo, alla risposta infiammatoria e al ritmo
9
1- Introduzione
circadiano. Infine gli Autori hanno osservato che i livelli di NAD diminuiscono
significativamente in diversi organi durante l’invecchiamento e l’NMN è in
grado di migliorare l’intolleranza al glucosio e i profili lipidici in topi affetti da
diabete di tipo 2 indotto dall’invecchiamento. In accordo con questi risultati,
Caton et al. (2011) hanno osservato che la somministrazione dell’NMN a topi
diabetici in cui la patologia è stata indotta da una dieta ricca in fruttosio,
protegge la funzionalità delle cellule beta ripristinando la secrezione di
insulina. Uno studio più approfondito ha rilevato che l’NMN ripristina
l’espressione di diversi geni essenziali per la tolleranza al glucosio e per la
differenziazione delle cellule beta che risulta soppressa nei topi diabetici per
effetto di citochine pro-infiammatorie. L’ effetto non si riscontra se viene inibita
SIRT1, una deacetilasi NAD-dipendente capace di controllare numerosi fattori
trascrizionali
coinvolti
nell’omeostasi
metabolica
di
tutto
l’organismo,
suggerendo il coinvolgimento di SIRT1 nel mediare l’effetto protettivo dell’NMN.
Nel complesso questi risultati suggeriscono che l’NMN potrebbe rappresentare
una molecola promettente nella lotta contro il diabete.
Ulteriori studi (Wang et al., 2009) hanno dimostrato che l’NMN svolge
anche un ruolo nella proliferazione del tessuto muscolare liscio vascolare
(VSMC), step molto importante del rimodellamento della parete del vaso
sanguigno in seguito a danneggiamento dopo angioplastica o trapianto di
vena. L’NMN interviene stimolando la proliferazione delle cellule di tale
tessuto, attivando le vie di trasduzione del segnale mediate da ERK1/2 e p38.
L’NMN svolge un ruolo protettivo anche nel sistema nervoso. Wang et al.
(2011), hanno infatti dimostrato che è in grado di ridurre i danni cerebrali
indotti da ischemia. La somministrazione di NMN a topi MCAO (con occlusione
dell’arteria
cerebrale
media),
infatti,
attenua
la
dimensione
cerebrale
dell’infarto, il deficit neuronale e la morte delle cellule neuronali. Inoltre, l’NMN
protegge le cellule neuronali dal danneggiamento dovuto alla privazione di
glucosio e ossigeno poiché è in grado di diminuire i livelli di proteine
proapoptotiche e di aumentare i livelli di quelle antiapoptotiche. Nel
lievito
Saccharomyces cerevisiae, entrambe le forme del mononucleotide piridinico
sono coinvolte nel “phosphate responsive signaling (PHO) pathway” (Lu & Lin,
2011). Questo pathway viene attivato dalla diminuzione della disponibilità di
fosfato inorganico e controlla l’espressione di geni codificanti specifici
trasportatori del fosfato, fosfatasi e regolatori che mobilizzano il fosfato dalle
10
1- Introduzione
forme di deposito. L’attivazione del pathway determina anche la rimozione
della molecola di fosfato dall’NMN con formazione di NmR. D’ altro canto, una
diminuzione dei livelli di NaMN, segnale di una ridotta biosintesi del NAD,
inibisce l’attivazione del PHO pathway e stimola la sintesi del coenzima dalla
NmR.
Contrariamente a quanto descritto negli eucarioti, nei batteri l’NMN è
potenzialmente tossico. Il mononucleotide, infatti, è un forte inibitore della
DNA ligasi batterica NAD-dipendente (Park et al., 1989; Chen et al., 2002),
l’enzima che catalizza la formazione di un legame fosfodiesterico tra l’estremità
3’-OH e quella 5’-fosfato di due frammenti di DNA (Figura 5). L’IC50 dell’NMN è
pari a 9,5 μM (Chen et al., 2002).
Enzima
NH3
NAD
1. Adenilazione della
DNA ligasi
NMN
Enzima
+NH
2
3. Rilascio di AMP sigilla
interruzione
AMP
3’
5’
ÖH
O
O
5’
3’
3’
5’
5’
ÖH
O
P
O-
AMP
NH3
Enzima
O
P
O-
O
2. Attivazione del fosfato
in 5’ nell’interruzione
O-
3’
3’
DNA ligasi
5’
5’
O
O
P
O
3’
O-
AMP
Figura 5 Meccanismo della reazione della DNA ligasi NAD dipendente. In ognuna delle tre
tappe si forma un legame fosfodiestere a spese di un altro. Le tappe 1 e 2 portano all’attivazione
del gruppo fosforico 5’ al punto di interruzione. Un gruppo AMP viene trasferito prima a un
residuo di lisina sull’enzima e poi al gruppo fosforico 5’ dell’interruzione. Nella tappa 3 il gruppo
ossidrilico 3’ si lega a questo gruppo fosforico e sposta l’AMP; si forma così un legame
fosfodiestere che elimina l’interruzione (da I Principi di Biochimica di Lehninger, Zanichelli
Editore).
11
1- Introduzione
1.3 La biosintesi della vitamina B 3 nei batteri
Una caratteristica peculiare della vitamina B 3 è che la sua sintesi passa
attraverso la formazione della sua forma coenzimatica, il NAD. Nei batteri la
molecola del NAD viene costruita de novo a partire da quattro diversi composti:
l’ L-aspartato (L-asp), il didrossiacetone
fosfato (DHAP), il fosforibosil
pirofosfato (PRPP) e l’ATP, metaboliti di pathways essenziali quali il ciclo
dell’acido citrico, la glicolisi e la via dei pentoso fosfati ( Figura 6).
Figura 6 Precursori metabolici del NAD (tratta da Osterman A., 2008. Biosynthesis and
Recycling of NAD, Escherichia coli, Sal monella, American Society for Microbiology, 3rd ed.).
Le reazioni della biosintesi de novo del NAD e della sua fosforilazione a
NADP sono ben conosciute e conservate nella maggior parte dei procarioti.
Il principale centro reattivo della molecola del NAD(P) è l’anello piridinico
della nicotinammide e in particolare l’atomo di carbonio C-3, coinvolto nel
trasferimento reversibile di uno ione idruro con conseguente riduzione della
molecola a NAD(P)H, evento chiave di tutte le reazioni redox (Figura 7). La
molecola può anche subire la rottura dei legami pirofosforico, N-glicosidico e
amidico generando una serie di prodotti, tra cui le tre forme vitaminiche, che
possono essere riconvertite a NAD attraverso le
vie
di recupero del
12
1- Introduzione
dinucleotide. Queste vie sono meno studiate e non tutti i geni coinvolti sono
ancora noti.
Figura 7 Centri reattivi nella molecola del NAD e prodotti primari delle reazioni di
consumo del dinucleotide. I metaboliti che possono essere riconvertiti a NAD sono indicati
dalle frecce curve (tratta da Osterman A., 2008. Biosynthesis and Recycling of NAD, Escherichia
coli, Salmonella, American Society for Microbiology, 3rd ed.).
Nonostante i primi studi sul metabolismo del NAD siano stati condotti in
sistemi eucariotici (mammiferi e lieviti) (Preiss & Handler, 1958a; Kornberg,
1948), gli studi effettuati nei batteri, specialmente Escherichia coli e Salmonella
thyphymurium, sono i primi che hanno consentito l’identificazione dei geni chiave responsabili della biosintesi del coenzima. Lo sviluppo delle tecniche
che hanno portato al sequenziamento di interi genomi e l’introduzione di
analisi bioinformatiche di tipo comparativo hanno fornito un contributo
enorme per la ricostruzione del metabolismo del NAD in numerose specie
batteriche (Bieganowski & Brenner, 2004). Un ulteriore importante supporto
alla comprensione delle vie metaboliche del dinucleotide è stato offerto dalla
disponibilità di tecniche di cristallografia che hanno permesso la risoluzione
delle strutture 3D di molti degli enzimi coinvolti.
In figura 8 sono schematizzate le principali vie ad oggi conosciute della
biosintesi del NAD nei batteri.
13
1- Introduzione
Aspartato
nadB
IA Diidrossiacetone
fosfato
nadA
Qa
Triptofano
nadC
PRPP
Acido nicotinico
PPi
PRPP
PPi
NaMN
pncB
nadD
NH3
pncA
ATP
PPi
NaAD
Gln
ATP
nadE
PRPP
Nicotinammide
nadV
RP
RnmP
P
ATP
PPi
NMN
nadR
PPi
nadR
nadM
Glu
ADP+Pi
NAD
ATP
nadF
ADP
NADP
ADP
ATP
Nicotinammide
riboside
Figura 8 Schema generale della biosintesi del NAD nei batteri : via de novo (precursori in
giallo) e principali vie di recupero (precursori i n rosa). In verde sono indicati i geni che
codificano per gli enzimi coinvolti nelle reazioni.
1.3.1
Biosintesi de novo
Studi in vivo hanno dimostrato che molti batteri sono in grado di
sintetizzare il NAD de novo a partire dall’ L-aspartato indipendentemente dalla
presenza o meno di fonti di niacina nel terreno di coltura. La sintesi de novo,
inizialmente descritta in Salmonella enterica e quindi in E. coli e in altre specie
batteriche, può essere suddivisa in due parti: nella prima l’acido aspartic o
viene convertito a NaMN attraverso una via denominata “via dell’ L-aspartatodiidrossiacetone fosfato”; nella seconda l’ NaMN viene trasformato a NAD(P). La
“via dell’ L-aspartato-diidrossiacetone fosfato” è esclusiva della sintesi de novo
e i tre geni coinvolti (nadB, nadA, nadC) non risultano essenziali se nel terreno
di crescita sono presenti la nicotinammide o l’acido nicotinico. Al contrario, la
trasformazione dell’ NaMN a NAD è comune sia alla sintesi de novo che alle
14
1- Introduzione
vie di recupero del dinucleotide e i tre geni coinvolti (nadD, nadE, nadF)
risultano essenziali qualunque siano le condizioni di crescita (Mehl et al.,
2000; Kawai et al., 2001). La suddivisione è giustificata anche da una
differente distribuzione filogenetica: il pathway che ha origine dall’ NaMN è
ampiamente conservato sia negli eucarioti che nei procarioti, mentre la via a
monte è soggetta ad estrema variabilità. L’ultima reazione di questa via, ovvero
la conversione del chinolinato a NaMN, è comune ad una via metabolica
aerobica (la via delle chinurenine) che vede la graduale ossidazione del
triptofano a chinolinato (Figura 8). Questa via, descritta ancor prima della “via
dell’
L-aspartato-diidrossiacetone
fosfato”,
è
sempre
stata
considerata
esclusiva degli eucarioti, fino a quando non ne è stata scoperta l’esistenza in
diverse specie batteriche (Streptomyces antibioticus, Cyanidium caldarium,
Karlingia rosea, Xanthomonas pruni) (Kurnasov
et al., 2003; Wilson &
Henderson, 1963; Lingens & Vollprecht, 1964). I sei geni della biosintesi de
novo del NAD sono localizzati in loci separati sul cromosoma di E. coli e di altre
specie appartenenti alla famiglia degli Enterobatteri; tuttavia nadB e nadA
sono co-regolati dal repressore trascrizionale NAD-dipendente NadR. Spesso i
tre geni della “via dell’L-aspartato-diidrossiacetonefosfato” tendono a formare
clusters cromosomici conservati (operoni), come ad esempio in Bacillus subtilis
e in altri batteri Gram-positivi, in cui l’espressione dell’operone nadBAC è
controllata dal repressore YrxA, recentemente rinominato NiaR, sensibile ai
livelli di acido nicotinico (Rossolillo et al., 2005; Rodionov et al., 2008).
Da L-aspartato a NaMN
La trasformazione dell’ L-aspartato a NaMN avviene in tre reazioni
consecutive:
A)
Ossidazione dell’ L-aspartato ad un intermedio instabile, l’immino
aspartato (IA), catalizzata dall’ L-aspartato ossidasi (NadB) (Figura 9 A);
B)
Condensazione dell’immino aspartato con il diidrossiacetone fosfato
(DHAP), un intermedio della glicolisi, a formare acido chinolinico (Qa),
catalizzata dalla chinolinato sintetasi (NadA) (Figura 9 B);
C)
Fosforibosilazione
del chinolinato ad opera dell’enzima
chinolinato
fosforibosiltrasferasi (NadC) che si avvale come secondo substrato del
15
1- Introduzione
fosforibosilpirofosfato (PRPP) derivante dalla via dei pentoso fosfati (Figura 9
C).
A
NadB
L-Asp
IA
o succinato
o fumarato
B
NadA
C
NadC
Figura 9 Biosintesi de novo del NAD: reazioni di conversione dell’ L-asp a NaMN.
I tre geni coinvolti in queste reazioni sono conservati in tutte le specie
batteriche in cui sono presenti. È interessante notare come il gene nadB, e in
alcuni casi sia nadB che nadA, risulti mutato o inattivato in ceppi virulenti di
Shigella, auxotrofi per l’acido nicotinico (Ahmed et al., 1988; Prunier et al.,
2007a). Questa osservazione ha suggerito l’ipotesi che la sintesi del Qa
costituisca uno dei fattori di anti-virulenza (AVL) soggetti a eliminazione
16
1- Introduzione
selettiva nel corso dell’evoluzione adattativa dei patogeni dai rispettivi
precursori commensali (Prunier et al., 2007b).
Da NaMN a NADP
Tutte le reazioni enzimatiche che costituiscono questa via, ampiamente
conservata nella maggior parte delle specie viventi, sono ATP-dipendenti. Tutti
i prodotti e gli intermedi della via sono infatti fosforilati, il che ne rende
impossibile l’uptake dal terreno di crescita, fornendo pertanto un fondamento
logico al fatto che i geni degli enzimi che catalizzano queste reazioni siano
essenziali.
La trasformazione dell’intermedio NaMN a NAD si realizza in due reazioni:
D)
Adenilazione dell’ NaMN a NaAD catalizzata dalla NaMN adeniltrasferasi
della famiglia NadD (Figura 10 D);
E)
Amidazione del NaAD a NAD catalizzata dall’enzima NAD sintetasi
(NadE) (Figura 10 E).
Il NAD sintetizzato è utilizzato come cofattore in una varietà di reazioni di
ossidoriduzione e va incontro a una molteplicità di reazioni non redox, tra cui
la sua fosforilazione a NADP da parte di una chinasi (NadF) ATP-dipendente
(Figura 10 F). Anche il NADP come il NAD è un cofattore indispensabile nelle
reazioni redox, utilizzato prevalentemente nei processi anabolici. I tre enzimi
coinvolti in questa via sono presenti nella quasi totalità delle specie batteriche,
comprese quelle che mancano della via de novo e producono NaMN attraverso
il recupero della niacina. Alcune eccezioni sono tuttavia rappresentate da
patogeni intracellulari come ad esempio parassiti appartenenti alle specie
Rickettsia e Chlamydia e da varie specie della famiglia delle Pasteurellaceae.
Questi organismi possiedono unicamente il gene nadF e hanno acquisito la
capacità di assumere e riciclare il NAD integro dalle cellule dell’organismo
ospite (Gerdes et al., 2002;
Haferkamp et al., 2004;
Osterman & Begley,
2007).
17
1- Introduzione
D
NadD
ATP
E
NadE
F
NadF
Figura 10 Biosintesi del NAD: reazioni di conversione dell’ NaMN a NADP.
1.3.2 Vie di recupero
Oltre alla sintesi de novo, la maggior parte degli organismi possiede vie
che consentono di generare il NAD dalla vitamina B3 assunta attraverso fonti
esogene
(dieta,
mezzo di
crescita)
o ottenuta
metabolicamente
dalla
degradazione intracellulare del dinucleotide stesso. In ogni caso, attraverso le
vie di recupero vengono generati gli intermedi mononucleotidici NaMN e NMN.
L’ insieme delle trasformazioni biochimiche che consentono alla cellula di
utilizzare l’anello piridinico pre -formato e altri sottoprodotti derivanti dalla
degradazione del NAD presenti all’interno della cellula o nel mezzo di coltura
va sotto il nome di ciclo dei nucleotidi piridinici (PNC) (Foster & Moat, 1980).
In
E.
coli
e
in
molti
altri
procarioti,
l’enzima
nicotinato
fosforibosiltrasferasi (PncB), insieme alla nicotinammide deamidasi (PncA),
18
1- Introduzione
catalizza le reazioni che costituiscono il principale pathway di recupero
dell’anello piridinico del NAD a partire dai precursori in forma deamidata (Na)
o ammidica (Nm) (Figura 8). L’insieme delle reazioni che permettono il riciclo
dell’ Na costituisce il primo PNC identificato, denominato Preiss-Handler
pathway (Preiss & Handler, 1958a; Preiss & Handler, 1958b) (Figura 11).
Na
PRPP
pncB
PPi
NaMN
nadD
ATP
PPi
NaAD
Gln
nadE
Glu
ATP
ADP+Pi
NAD
Figura 11 Preiss-Handl er pathway: l’enzima PncB catalizza la conversione dell’ Na a NaMN il
quale viene poi convertito a NAD attraverso l’azione degli enzimi NadD e NadE .
I batteri hanno generalmente accesso ad un sostanziale pool di niacina
come nutriente nei loro rispettivi habitats, e le vie di recupero della Nm/Na
sembrano giocare un ruolo importante nella loro vita, avendo la precedenza
sulla via de novo ogni volta che questi precursori sono disponibili nel terreno
di crescita. Nella maggior parte dei batteri patogeni (soprattutto Gram-positivi),
il riciclo della Nm attraverso la via mediata dagli enzimi PncB-PncA
rappresenta l’unico ed essenziale processo per generare l’ NaMN per la sintesi
del NAD (Osterman & Begley, 2007). Un aspetto particolare ed ancora
inspiegabile del recupero della Nm è che ha inizio con la deamidazione dell’
anello piridinico, che va poi incontro ad una reazione endoergonica di
amidazione nell’ ultimo step della sintesi del NAD.
Alternativamente la Nm può essere convertita a NMN attraverso l’attività
della nicotinammide fosforibosiltrasferasi (NadV) (Figura 12 C). Questa
reazione, inizialmente identificata in H. ducreyi (Martin et al., 2001), è presente
in un limitato numero di specie batteriche, tra cui alcuni cianobatteri e γ proteobatteri. Nell’uomo, l’ortologo di NadV è l’enzima NmPRT, inizialmente
19
1- Introduzione
descritto come fattore citochinico stimolante la maturazione dei linfociti B
(PBEF) (Gerdes et al., 2006; Rongvaux et al., 2002).
A
pncA
B
pncB
C
NadV
PRPP
PPi
Figura 12 Recupero dell’anello piridinico: deamidazione della Nm ad opera della Nm
deamidasi (PncA) (A) seguita dalla conversione del Na a NaMN per mezzo della NaPRT (PncB) (B);
conversione alternativa, non deamidante, della Nm a NMN attraverso la NmPRT (NadV) ( C).
Più recentemente è stata scoperta in H. influenzae, dove peraltro
costituisce l’unico meccanismo di biosintesi del NAD, una via di recupero
estremamente conveniente per la cellula, che prevede l’assorbimento della
NmR esogena (la forma defosforilata dell’NMN) attraverso il trasportatore di
membrana PnuC, seguito da due reazioni (fosforilazione e adenilazione) che
convertono NmR a NMN e NAD (Kurnasov et al., 2002; Merdanovic et al.,
2005). La nicotinammide riboside chinasi è infatti in grado di agire sulla RNm
generando l’ NMN, che viene convertito a NAD in un solo passaggio, grazie
20
1- Introduzione
all’azione della NMN adeniltrasferasi della famiglia NadM, bypassando così la
reazione catalizzata dalla NAD sintetasi (Kurnasov et al., 2002) (Figura 13A).
Sia l’attività RNm chinasica sia quella NMN adenililtrasferasica risiedono nella
stessa catena polipeptidica e costituiscono la proteina multifunzionale NadR.
Gli ortologhi dei geni coinvolti in questa via (pnuC e nadR) sono conservati in
E. coli, nella maggior parte degli enterobatteri e più in generale nell’intero
gruppo dei γ-proteobatteri. Tuttavia in questi batteri, solo l’attività RNm
chinasica sembra essere fisiologicamente rilevante, risultando essenziale per il
recupero della RNm che, una volta assorbita tramite il trasportatore PnuC,
verrebbe convertita a NMN (Grose et al., 2005a; Kurnasov et al., 2002). Sembra
probabile che il successivo utilizzo dell’ NMN proceda attraverso la sua
deamidazione a NaMN, piuttosto che attraverso la sua diretta adenilazione a
NAD ad opera del NadR. Ciò perché l’attività NMN adeniltrasferasica del NadR
in questi organismi è molto bassa e la Km per l’NMN ha un valore di
concentrazione millimolare. L’importanza della via di recupero della RNm è
stata recentemente riconosciuta anche nei sistemi eucariotici (Bieganowski &
Brenner, 2004; Belenky et al., 2007; Tempel et al., 2007).
In un elevato numero di specie appartenente alla famiglia dei γ proteobatteri, una notevole quantità di Nm potrebbe derivare dalla reazione
catalizzata dalla RNm fosforilasi che consiste nell’addizione
di fosfato
inorganico allo zucchero del nucleoside con conseguente formazione di Nm e
riboso-fosfato (RP) (Figura 13 C). L’esistenza di tale attività, descritta per la
prima volta negli eucarioti (Belenky et al., 2007; Belenky et al., 2009) e
ipotizzata in queste specie batteriche attraverso analisi di omologia di
sequenza, è sostenuta anche dal fatto che il gene predetto come responsabile
dell’attività RNm fosforilasica (rnmP) si trova spesso in cluster sul cromosoma
con il gene trasportatore pnuC.
Infine, una fonte di Nm libera endogena, disponibile per il riciclo, è fornita
da quegli enzimi che consumano il NAD, come le ADP ribosiltrasferasi e/o
deacetilasi proteiche NAD-dipendenti della famiglia SIR2 (CobB in E. coli),
ampiamente conservate in molti batteri.
21
1- Introduzione
A
NadR_K
B
NMNAT (NadR_A)
NadR_A)
C
RnmP
Pi
RP
Figura 13 Recupero del nucleoside piridinico: fosforilazione della RNm a NMN (A) e
successiva adenilazione dell’ NMN a NAD (B); Conversione della RNm a Nm per idrolisi del
legame N-glicosidico attraverso la RNm fosforilasi (RnmP) (C).
Oggi è possibile la ricostruzione in silico delle varie vie metaboliche nelle
diverse specie batteriche grazie alla disponibilità di molti mezzi bioinformatici
che, mediante analisi di genomica comparata, sono in grado di assegnare ruoli
funzionali a geni ancora non annotati e quindi di ricostruire interi pathways
metabolici. Ad esempio, utilizzando la banca-dati “The SEED” è possibile
ricostruire in silico il pathway biosintetico della vitamina B3 in tutte le specie
batteriche il cui genoma è stato completamente sequenziato. Dall’analisi
22
1- Introduzione
bioinformatica emerge che nei batteri sono operative diverse combinazioni
delle varie vie di recupero descritte. In particolare, tali vie sono sogget te ad
una significativa variazione anche nell’ambito di specie batteriche molto simili
tra loro.
1.4 M etabolismo dei mononucleotidi piridinici nei batteri
Nel capitolo precedente sono stati descritti gli enzimi in grado di
sintetizzare NMN e NaMN dalle basi e dai nucleosidi piridinici, e le
adeniltrasferasi che utilizzano i mononucleotidi per produrre NAD. Mentre non
si conoscono vie per la sintesi dell’NaMN oltre a quelle descritte, è noto che
l’NMN intracellulare deriva anche dall’attività della DNA l igasi batterica.
Essendo l’NMN un potente inibitore della stessa DNA ligasi, è chiaro che i suoi
livelli devono essere sottoposti ad uno stretto controllo. Non tutte le specie
batteriche hanno una NMN adenililtrasferasi della famiglia NadM, in grado di
adenilare l’NMN a NAD e non è quindi noto come la cellula possa rimuovere
l’NMN in eccesso. Studi fisiologici e biochimici condotti in Salmonella hanno
dimostrato l’esistenza di una NMN deamidasi destinata all’utilizzo dell’ NMN
endogeno per la sintesi del NAD via NaMN (Cheng & Roth, 1995; Grose et al.,
2005b).
1.5 NM N deamidasi
I primi studi sperimentali sull’esistenza di un enzima batterico dotato di
attività NMN deamidasica risalgono ai primi anni ’70 (Friedmann & Garstky,
1973; Kinney et al.,1979; Forster & Brestel 1982). Questi studi hanno
dimostrato il coinvolgimento dell’enzima nel riciclo dell’NMN a NAD e ne hanno
ipotizzato un ruolo nella regolazione dei livelli intracellulari di NMN. In effetti i
livelli del mononucleotide devono essere sottosposti ad un accurato controllo
in quanto l’NMN è un forte inibitore della DNA ligasi batterica NADdipendente.
Catalizzando la
conversione
dell’NMN a
NaMN e
quindi
indirizzando il mononucleotide verso la sintesi del NAD, l’NMN deamidasi
previene l’inibizione della ligasi e allo stesso tempo le assicura continuo
rifornimento del substrato (Park, et al. 1989).
23
1- Introduzione
Studi fisiologici in S. thyphymurium hanno suggerito un ruolo chiave
dell’NMN deamidasi anche nel recupero dell’ NmR; il nucleoside infatti, una
volta entrato nella cellula, verrebbe convertito a NMN dall’attività NmR
chinasica del NadR. L’NMN quindi piuttosto che essere adenilato direttamente
a NAD dall’attività NMN adeniltrasferasica del NadR, verrebbe deamidato a
NaMN ad opera dell’NMN deamidasi e quindi convertito a NAD attraverso la via
di Preiss-Handler.
Infine, il prodotto della reazione catalizzata dall’NMN deamidasi, l’NaMN,
è
usato
come
donatore
del
gruppo
fosforibosile
dall’enzima
dimetil-
benzamidazolo fosforibosiltrasferasi (CobT), che catalizza l’ultimo step nella
biosintesi dell’adenosilbobalamina (Maggio-Hall & Escalante -Semerena 2003).
Ciò conferisce all’NMN deamidasi un ruolo nella regolazione della sintesi della
vitamina B12 .
Il gene codificante l’NMN deamidasi è stato recentemente identifi cato per
la prima volta nel laboratorio dove ho svolto la presente tesi (Galeazzi et al.,
2011). A tale scopo è stato impiegato un classico approccio biochimico, che è
consistito nella i) purificazione ad omogeneità della proteina nativa dal γ proteobatterio Shewanella oneidensis; ii) sequenziamento all’ N-terminale della
proteina mediante degradazione dei Edman; iii) identificazione del gene per
traduzione della sequenza aminoacidica nella corrispondente nucleotidica e
ricerca nel genoma del batterio. Il batterio S. oneidensis è stato scelto perché
in questo organismo l’NMN deamidasi è indispensabile per il recupero della
Nam, caratteristica che lo rende un buon modello per studi funzionali in vivo.
L’NMN deamidasi da S. oneidensis presenta la massima attività catalitica in un
ampio intervallo di pH compreso tra 5,5 e 8,5; la temperatura ottimale è
compresa nell’intervallo tra 30°C e 42°C. L’enzima non è metallo-dipendente
ed è significativamente inattivato da Hg +, Cd2+ e Cu2+. Si tratta di un enzima
allosterico, con una marcata cooperatività positiva nei confronti dell’ NMN, per
il quale ha anche una marcata affinità (S 0,5 20 μM). E’ fortemente specifico per
l’NMN, non essendo in grado di deamidare né la Nm, né la NmR.
L’enzima è stato denominato PncC, dall’acronimo utilizzato per la prima
volta dagli autori che avevano descritto l’attività catalitica in Salmonella
typhimurium (Foster et al, 1979).
24
1- Introduzione
Lo scopo di questa tesi è stato quello di verificare il significato fisiologico
dell’enzima
identificato,
e
cioè
di
confermarne
il
coinvolgimento nel
metabolismo della vitamina B3.
25
2- Materiali e metodi
Capitolo 2
MATERIALI E METODI
2.1 Determinazione dell’attività NMN deamidasica
2.1.1 Saggio in HPLC
2.1.1.1 Saggio accoppiato
La determinazione dell’attività NMN deamidasica mediante saggio in
HPLC è stata effettuata allestendo una miscela di reazione (150 µL finali)
costituita da un’opportuna quantità di campione, tampone fosfato di potassio
100 mM pH 8.0, NaF 10 mM, MgCl 2 11 mM, ATP 1 mM, DTT 2mM, NMN 1mM,
10 mU di enzima NadD ricombinante che trasforma l’NaMN in NaAD. L’enzima
NadD è stato preparato come descritto a pagina 37. Le µmoli di NaAD che
vengono prodotte, sottratte di quelle determinate in una miscela di controllo
priva di NMN, sono equivalenti alle µmoli di NaMN formate dall’ attività NMN
deamidasica.
Le miscele di reazione sono state incubate a 37°C per 30 minuti e
addizionate di 75 µl di HClO 4 1,2 M; successivamente, le miscele sono state
lasciate 5 minuti in ghiaccio, centrifugate a 13000 rpm per allontanare le
proteine
precipitate, e
infine
neutralizzate con K2CO3 0,8 M fino al
raggiungimento di un pH pari a 6,0. Un’ ulteriore centrifugazione a 13000 rpm
per un minuto serve a separare i precipitati salini dai sovranatanti che sono
stati poi sottoposti a cromatografia in HPLC.
Per la separazione cromatografica è stata utilizzata una colonna
contenente la resina Supelcosil LC-18-S (25cm x 4mm), equilibrata in
tampone A (fosfato di potassio 0,1 M pH 6,0). L’eluizione è stata effettuata
applicando un gradiente discontinuo di metanolo nel tampone A. Il gradiente
ha una durata di 35 minuti e il flusso viene mantenuto a 1,3 ml/min. La
temperatura alla quale sono state effettuate le corse è 18°C. Il sistema HPLC
utilizzato è dotato di un rilevatore diode-array che consente l’analisi del
26
2- Material i e metodi
campione nell’ intervallo di lunghezze d’onda compreso tra 200 e 350 nm. Le
caratteristiche del gradiente, realizzato mescolando in proporzioni diverse il
tampone A con il tampone B (tampone A contenente il 20% di metanolo) sono
riportate in Tabella I:
Tempo (min.)
%A
%B
Durata (min.)
0,0
100
0
-
9,0
88
12
6,0
15,0
55
45
2,5
17,5
0
100
2,5
25,5
100
0
5,0
35,0
END
Tabella I Caratteristiche del gradiente utilizzato per l’analisi in HPLC. Per durata si
intende l’intervallo di tempo che il sistema impiega a raggiungere la composizione della fase
mobile indicata nella seconda e terza colonna, a partire dal tempo della corsa cromatografica
indicato nella prima colonna.
Confrontando l’area del picco dell’ NaAD del campione con l’area del
dinucleotide a concentrazione nota (standard), è possibile risalire alle µmoli di
NaAD formate nella miscela di reazione. Tenendo conto delle diluizioni a cui
viene sottoposta la miscela durante i passaggi di deproteinizzazione e
neutralizzazione, si risale all’attività enzimatica espressa in U/mg utilizzando
la seguente formula:
Ae (U/mg) = N ∙ D / mg proteine ∙ T
Dove:
N = µmoli di NaAD iniettate
D = fattore di diluizione della miscela di reazione
T = tempo d’incubazione della miscela di reazione, espresso in minuti
mgprot = quantità di proteine presenti nel campione, espresse in mg.
27
2- Material i e metodi
Una Unità enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza la
formazione di 1 µmol di NaMN al minuto a 37°C.
2.1.1.2 Saggio diretto
In alternativa a quello descritto sopra, è stato usato un saggio di
determinazione dell’attività NMN deamidasica in HPLC che consente la
misurazione diretta della quantità di NaMN prodotta nella miscela di reazione.
Questo metodo prevede l’allestimento di una miscela di reazione costituita da
un’opportuna quantità di campione, tampone fosfato di potassio 100 mM pH
8.0, NaF 10 mM, DTT 2mM, NMN 1mM. La miscela, dopo un’incubazione di 20
minuti a 37°C, viene acidificata e neutralizzata come descritto a pagina 26. Per
la separazione cromatografica è stata utilizzata una colonna contenente la
resina Supelcosil LC-18-S (25cm x 4mm), equilibrata in tampone A (fosfato di
potassio 0,1 M pH 6,0, addizionato di tetrabutilammonioidrogenosolfato 8
mM). L’eluizione è stata effettuata applicando un gradiente discontinuo di
metanolo nel tampone A. Il gradiente ha una durata di 55 minuti e il flusso
viene mantenuto a 1 ml/min. La temperatura alla quale sono state effettuate
le corse è 8°C. Le caratteristiche del gradiente, realizzato mescolando in
proporzioni diverse il tampone A con il tampone B (tampone A contenente il
30% di metanolo) sono riportate in Tabella II:
Tempo (min.)
%A
%B
Durata (min.)
0,0
100
0
-
4,0
85
15
12,5
16,5
10
90
23,5
47,0
100
0
2,0
55,0
END
Tabella II Caratteristiche del gradiente utilizzato per l’analisi in HPLC. Per durata si
intende l’intervallo di tempo che il sistema impiega a raggiungere la composizione della fase
mobile indicata nella seconda e terza colonna, a partire dal tempo della corsa cromatografica
indicato nella prima colonna della riga precedente.
Confrontando l’ area dell’ NaMN ottenuta iniettando in colonna il
campione con l’area del mononucleotide a concentrazione nota (standard), è
28
2- Material i e metodi
possibile risalire alle µmoli di NaMN iniettate. Tenendo conto delle diluizi oni a
cui viene sottoposta la miscela durante i passaggi di deproteinizzazione e
neutralizzazione, si risale all’attività enzimatica espressa in U/mL utilizzando
la seguente formula:
Ae (U/mL) = N ∙ D ∙ 1000 / Venz ∙ T
Dove:
N = µmoli di NaMN iniettate;
D = fattore di diluizione della miscela di reazione;
T = tempo d’incubazione della miscela di reazione, espresso in minuti;
Venz = volume di preparazione enzimatica aggiunto alla miscela di reazione,
espresso in µL.
Una Unità enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza la
formazione di 1 µmol di NaMN al minuto a 37°C.
2.1.2 Saggio spettrofotometrico
2.1.2.1 Saggio continuo
La
determinazione
dell’attività
enzimatica
attraverso
il
saggio
spettrofotometrico continuo contempla una miscela di reazione in cui sono
presenti sia il campione di cui si vuole saggiare l’attività NMN deamidasica, sia
tutti gli enzimi coinvolti nella formazione del NADH a partire dal NaMN (Figura
14).
Per la determinazione dell’attività, un’opportuna di campione viene
aggiunto ad una miscela costituita da Hepes 56 mM pH 7.5, etanolo assoluto
0,5% v/v, semicarbazide 14 mM, MgCl 2 11 mM, NH4Cl 4,5 mM, ATP 2,4 mM,
NMN 0,1 mM, alcol deidrogenasi (ADH) 0,03 mg/mL, BSA 0,56 mg/mL, NadD
(45 µg di proteine di un estratto grezzo di E. coli BL21 che iperesprimono
29
2- Material i e metodi
l’enzima ricombinante NadD), NadE (45 µg di proteine di un estratto grezzo di
E. coli BL21 che iperesprimono l’enzima ricombinante NadE).
La velocità di formazione del NaMN, direttamente proporzionale alla
velocità di formazione del NADH, viene determinata andando a misurare nel
tempo l’aumento di assorbanza a 340 nm, alla temperatura di 37°C.
L’attività enzimatica (U/mL) è calcolata sulla base dell’aumento lineare di
assorbanza a 340 nm della miscela nel tempo (ΔE/Δt) rispetto ad un bianco
preparato con la miscela di saggio sopra descritta nella quale al posto del
campione viene aggiunto un identico volume di acqua. Infatti, nel calcolo
dell’attività enzimatica è necessario tenere in considerazione l’aumento di
assorbanza causato dall’attività NMN deamidasica endogena, presente negli
estratti ricombinanti di E. coli (Figura 15).
NMN
NMN
deamidasi
Nad D
NH3
NaMN
NaAD
ATP
PPi
Nad E
ADH
NAD
ATP
ADP + Pi
NADH
Etanolo
Acetaldeide
Figura 14 Il NADH viene sintetizzato a partire dall’NaMN prodotto nella miscela di reazione in
seguito ad una serie di re azioni ancillari catalizzate dagli enzimi NadD, NadE e alcol
deidrogenasi.
30
2- Material i e metodi
Abs
340 nm
NMN
tempo
Figura 15 Saggio spettrofotometrico continuo. La formazione di NADH si osserva dopo
aggiunta di NMN sia nel campione (linea rossa), sia nel controll o (linea blu) preparato
sostituendo il campione di cui si vuole saggiare l’attività NMN deamidasica con acqua.
L’attività enzimatica, espressa in U/mL, viene calcolata con la seguente
formula:
Ae (U/mL) = (ΔE/Δt) ∙ Vmix ∙ 1000/ ε ∙ Venz
Dove:
ΔE = aumento dell’assorbanza a 340 nm nell’intervallo di tempo Δt
Δt = intervallo di tempo nel quale avviene l’incremento lineare di assorbanza
ΔE.
V mix = volume totale della miscela di saggio, espressa in mL.
ε = coefficiente di estinzione millimolare del NADH (6,2 mM-1 ∙ cm-1)
V enz = volume di preparazione enzimatica nella miscela di saggio, espresso in
µL.
31
2- Material i e metodi
2.1.2.2. Saggio discontinuo
La
determinazione
dell’attività
NMN deamidasica mediante
saggio
spettrofotometrico discontinuo prevede la preparazione del la miscela di
reazione, la precipitazione delle proteine e la neutralizzazione del campione
come già descritto per il saggio diretto in HPLC a pagina 26.
La quantità di NaMN formata viene quindi determinata misurando allo
spettrofotometro la formazione di NADH in seguito a una serie di reazioni
ancillari che prevedono l’utilizzo degli enzimi NadD, NadE e ADH (Figura 16). A
tale scopo il campione neutralizzato viene aggiunto alla seguente miscela:
Hepes 56mM, pH 7,5, etanolo assoluto 0,5% (v/v), semicarbazide 14 mM,
MgCl 2 11 mM, NH4Cl 4,5 mM, ATP 2,4 mM, ADH 0,03 mg/mL, BSA 0,56
mg/mL, NadD (45 µg di proteine di un estratto grezzo di E.coli BL21 che
iperesprimono l’enzima ricombinante NadD), NadE (45 µg di proteine di un
estratto grezzo di E. coli BL21 che iperesprimono l’enzima ricombinante NadE).
NMN
NMN
deamidasi
Nad D
NH3
NaMN
NaAD
ATP
PPi
Nad E
ADH
NAD
ATP
ADP + Pi
NADH
Etanolo
Acetaldeide
Figura 16 Il NADH viene sintetizzato a partire dall’NaMN prodotto nella miscela di reazione in
seguito ad una serie di reazioni ancillari catalizzate dagli enzimi NadD, NadE e alcol
deidrogenasi.
32
2- Material i e metodi
La formazione del NADH viene determinata spettrofotometricamente in base
all’incremento dell’assorbanza a 340 nm, a 37°C (Figura 17).
Abs
340nm
NMN deamidasi
ATP
tempo
Figura 17 Saggio spettrofotometrico discontinuo. La formazione di NADH si osserva dopo
aggiunta di ATP sia nel campione (linea rossa), sia nel controllo (linea blu) preparato sostituendo
il campione di cui si vuole saggiare l’attività NMN deamidasica con acqua.
La quantità massima di NADH rilevata è equivalente alla quantità di
NaMN sintetizzata nel tempo della reazione. Pertanto l’attività enzimatica è
calcolata in base alla differenza di assorbanza che si misura tra la fine e l’inizio
del saggio ancillare. Dato che la curva relativa al controllo (Figura 17-linea blu)
mostra una leggera pendenza per la presenza negli estratti ricombinanti di E.
coli di un’attività NMN deamidasica endogena, al valore ottenuto bisogna
sottrarre la differenza di assorbanza relativa al controllo. Tenendo conto delle
diluizioni a cui viene sottoposta la miscela di reazione durante i passaggi di
deproteinizzazione e neutralizzazione, l’attività enzimatica espressa in U/mL
viene calcolata con la seguente formula:
Ae (U/mL) = (ΔE - ΔEcon) ∙ Vmix ∙ D ∙ 1000 / ε ∙ T ∙ V enz
Dove:
ΔE = differenza di assorbanza tra la fine e l’inizio del saggio ancillare;
33
2- Material i e metodi
ΔEcon= differenza di assorbanza tra la fine e l’inizio del saggio ancillare di
controllo;
T = tempo d’incubazione della reazione di interesse, espresso in minuti;
Vmix = volume totale della miscela di saggio ancillare, espresso in mL;
D = fattore di diluizione della miscela di reazione;
ε = coefficiente di estinzione millimolare del NADH (6,2 mM-1 ∙ cm-1);
Venz = volume di preparazione enzimatica aggiunto alla miscela di reazione,
espresso in µL.
2.2 Preparazione degli estratti di S.oneidensis
Glicerinati di cellule di S. oneidensis (Wild Type e ΔpncC), preparati da
singole colonie cresciute in terreno LB fino a una OD600 pari a 4,0 e conservati
a -80°C, sono stati inoculati in 5 mL di terreno LB e lasciati in agitazione a
30°C over night, per la preparazione della precoltura. La precoltura è stata a
sua volta inoculata in 10 mL di terreno LB (OD 600 di partenza pari a 0.05)
mantenuto a 30°C in agitazione. Durante l’incubazione, è stato effettuato un
prelievo da 1 mL sia in piena fase di crescita esponenziale (OD600 pari a 2.0),
sia in fase di crescita stazionaria (OD 600 pari a 4.0). I prelievi effettuati sono
stati centrifugati a 10000g per 10 minuti; i pellet cellulari sono stati pesati e
congelati a -20°C. Dai pellet sono stati preparati i rispettivi estratti grezzi,
risospendendoli in tampone di lisi (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, PMSF 1mM,
DTT 1mM e 2 μg/ml di ciascuno dei seguenti inibitori di proteasi:
chimostatina, antipaina, leupeptina, pepstatina) in un volume pari a 1/10 del
volume originale della coltura. Dopo rottura delle cellule mediante l’uso di
palline di vetro, le sospensioni cellulari sono state centrifugate a 10000 g per
10 minuti. I sovranatanti rappresentano gli estratti grezzi. Dopo aver
determinato la concentrazione
proteica
attraverso il
metodo Bradford
(paragrafo 2.3), sugli estratti grezzi è stata determinata l’attività enzimatica
mediante il saggio accoppiato in HPLC.
34
2- Material i e metodi
2.3 Determinazione della concentrazione proteica
La concentrazione proteica è stata misurata con il metodo Bradford
(Bradford, 1979), utilizzato in quanto non subisce interferenze da parte di altre
sostanze non proteiche eventualmente presenti nel campione da analizzare. Il
reattivo è costituito da Blu Brillante di Coomassie G-250 allo 0,001% in
etanolo al 4,7% ed acido fosforico all’8,5%. Il colorante, in seguito al legame
con il materiale proteico, sposta il suo massimo assorbimento da 465 nm a
595 nm. La densità ottica (OD) a 595 nm del complesso proteina-reattivo è
direttamente proporzionale alla quantità della proteina nell’intervallo 2-10 µg.
Costruendo una retta di taratura con una proteina standard, la siero
albumina bovina, è
possibile risalire
alla concentrazione
proteica del
campione, tenendo conto della sua OD a 595 nm e del volume usato nel
saggio.
2.4 Determinazione dei livelli di NM N e NaM N
2.4.1 Estrazione acida dei nucleotidi
I pellet cellulari provenienti da una coltura in fase esponenziale e ottenuti
come descritto a pagina 34 sono stati risospesi in 700 μL di HClO4 0,4 M.
Dopo rottura delle cellule per sonicazione (3 cicli da 20 secondi con pause di
20 secondi), la sospensione cellulare è stata centrifugata a 13000 rpm per 10
minuti e il sovranatante è stato neutralizzato con K2CO3 0,8 M fino al
raggiungimento di un pH pari a 6,0. Un’ulteriore centrifugazione a 13000 rpm
per un minuto serve poi a separare il precipitato salino dal sovranatante.
2.4.2 Estrazione con etanolo dei nucleotidi
I pellet cellulari provenienti da una coltura in fase esponenziale e ottenuti
come descritto a pagina 34 sono stati risospesi in 700 μL di un tampone
etanolo bollente (75% etanolo e 25% Hepes 10 mM portato a pH 7,1 con
idrossido d’ammonio) e poi mantenuti a 100°C per 3 minuti. Dopo
35
2- Material i e metodi
centrifugazione a 13000 rpm per 5 minuti, i campioni sono stati portati a
secco tramite la Speed-Vac e risospesi in 700 μL di acqua (Evans et al., 2010).
2.4.3 Rilevazione e quantificazione dei mononucleotidi
I livelli intracellulari dei due mononucleotidi sono stati determinati
mediante la loro conversione a NaAD, sfruttando l’attività degli enzimi NMN
deamidasi (PncC) e NaMN adeniltrasferasi (NadD): il primo è responsabile della
trasformazione di NMN a NaMN, il secondo della conversione di NaMN a NaAD.
A tale scopo 100 μl degli estratti nucleotidici preparati sia con l’estrazione
acida (paragrafo 2.4.1), sia con etanolo (paragrafo 2.4.2) sono stati addizionati
alla miscela di reazione mix 1 contenente in 150 μl finali tampone fosfato di
potassio 100 mM pH 8,0, NaF 10 mM, MgCl 2 11 mM, ATP 1 mM, 10 mU di
PncC e 10 mU di NadD ricombinanti purificati (la preparazione degli enzimi
ricombinanti è descritta nei paragrafi 2.5 e 2.6). La quantità di NaAD prodotta
nella mix 1 sarà uguale alla somma delle quantità di NMN e NaMN. In
parallelo vengono allestite due miscele di controllo: una mix 2 in cui non
vengono aggiunti gli enzimi PncC e NadD, che permetterà di valutare la
quantità di NaAD endogeno, e una mix 3 in cui viene aggiunto solo NadD e
non PncC, che permetterà di determinare la concentrazione di NaMN
endogeno. La concentrazione di NaMN endogeno infatti sarà pari alla
concentrazione di NaAD determinata nella mix 3 sottratta del NaAD presente
nella mix 2. La concentrazione di NMN sarà uguale a quella del NaAD
determinata nella mix 1 sottratta della quantità di NaAD nelle mix 2 e 3.
Dopo 20 minuti di incubazione a 37°C, le reazioni vengono bloccate
aggiungendo un volume di HClO 4 1,2 M pari a ½ della miscela di reazione
(concentrazione finale HClO 4 0,4 M). Dopo 10 minuti in ghiaccio, le miscele
acidificate vengono centrifugate per 5 minuti a 13000 rpm (per allontanare le
proteine precipitate) e neutralizzate con K 2CO3 0,8 M fino al raggiungimento di
un pH pari a 6,0. Un’ulteriore centrifugazione a 13000 rpm per un minuto
serve poi a separare i precipitati salini dai sovranatanti che sono stati
direttamente sottoposti a cromatografia in HPLC.
Per la separazione cromatografica sono state utilizzate le condizioni
descritte a pagina 26.
36
2- Material i e metodi
Confrontando l’area del picco del NaAD, ottenuta iniettando in colonna le
varie miscele di reazione, con l’area del nucleotide a concentrazione nota
(standard), è possibile risalire alle nmoli di NaAD iniettate.
Tenendo conto delle diluizioni a cui viene sottoposta la miscela durante i
passaggi di deproteinizzazione e neutralizzazione, si risale alle nmoli di
NaAD/g pellet utilizzando la seguente formula:
nmoli NaAD/g pellet = N ∙ D / P
Dove:
N = nmoli di NaAD iniettate
D = fattore di diluizione della miscela di reazione
P = peso del pellet in grammi
2.5 Purificazione dell’ NaM N adeniltrasferasi (nadD)
Cellule di E.coli BL21, trasformate col plasmide pOD29 contenente il gene
per l’enzima NaMN adeniltrasferasi (NadD), sono state inoculate in terreno
liquido LB addizionato di ampicillina (concentrazione finale 0,1 mg/ml). Dopo
incubazione a 37°C in agitazione, fino al raggiungimento di una OD600 pari a
0,6, è stata indotta l’espressione della proteina aggiungendo alla coltura IPTG
(concentrazione finale 1 mM). La crescita dopo induzione è stata condotta per
12 ore a 25°C. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 5000 g
per 10 minuti e il pellet è stato risospeso in un tampone di lisi (Tris-HCl 20
mM, pH 8,0, MgCl 2 1 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 2 mM) in un volume pari a
1/20 del volume originale della coltura. Dopo rottura meccanica delle cellule
per sonicazione (3 cicli da 1 minuto con pause da 1 minuto), la sospensione
cellulare è stata centrifugata a 13000 rpm per 10 minuti. Il sovranatante
rappresenta l’estratto grezzo. Dopo aver determinato la concentrazione
proteica dell’estratto grezzo attraverso il metodo Bradford (Bradford, 1976), è
stata determinata l’attività enzimatica mediante il saggio spettrofotometrico
continuo.
37
2- Material i e metodi
L’estratto grezzo è stato caricato su una colonnina contenente la resina
Ni-NTA, collegata ad un sistema FPLC (AKTA, Biotech Pharmacia). Tale resina
viene utilizzata nella cromatografia per chelatura di metalli, che sfrutta la
capacità di certi ioni metallici, specialmente Ni 2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+ e Cd2+, di
legare proteine formando complessi di coordinazione con i gruppi imidazolici
dell’istidina, i gruppi indolici del triptofano o i gruppi tiolici di residui di
cisteina.
La resina Ni-NTA agarose utilizza lo ione Ni 2+ ed è composta da acido
nitrilacetico (NTA) immobilizzato su una matrice di SEPHAROSE CL-6B
(Figura 18). Il gruppo funzionale della resina è proprio l’NTA che grazie alle sue
proprietà di chelante dei metalli, occupa quattro siti di legame della sfera di
coordinazione dello ione Ni 2+ presente nella resina. I restanti due siti di
coordinazione restano quindi liberi per l’interazione con gli anelli imidazolici
dei residui istidinici presenti sulle proteine ricombinanti.
Figura 18 Cromatografia di affinità su resina Ni -NTA. E’ mostrata l’interazione tra l’His-tag di
una proteina ricombinante e lo ione Ni 2+ chelato dal gruppo funzionale della resina
cromatografica.
La resina è stata equilibrata in un tampone Tris-HCl
50 mM pH 7,5,
NaCl 0,15 M (tampone A), Imidazolo 10 mM, ad un flusso costante di 1
ml/min. Dopo un lavaggio con lo stesso tampone di equilibrazione (10 volumi
di colonna), l’eluizione è stata eseguita in 45 minuti applicando un gradiente
discontinuo di imidazolo da 10 mM a 350 mM, nel tampone A. Le
caratteristiche del gradiente sono riportate in Tabella III.
38
2- Material i e metodi
Tempo
% (A + Imidazolo
(min.)
10 mM)
0,0
% (A + Imidazolo 350 mM)
Durata (min.)
100
0
-
10,0
94
6
1,0
20,0
0
100
15,0
45,0
Fine
Tabella III Caratteristiche del gradiente utilizzato per la cromatografia in FPLC . Per durata
si intende l’intervallo di tempo che il sistema impiega a raggiungere la composizione della fase
mobile indicata nella seconda e terza colonna, a partire dal tempo della corsa cromatografica
indicato nella prima colonna.
L’eluato è stato raccolto in frazioni che sono state saggiate per verificare
la presenza dell’attività enzimatica (saggio spettrofotometrico continuo). Le
frazioni attive sono state riunite in un unico pool conservato a -20°C.
2.5.1 Determinazione dell’attività NaMN adeniltrasferasica (NadD)
La determinazione dell’attività enzimatica è stata eseguita con un saggio
spettrofotometrico che prevede l’allestimento di una miscela di reazione in cui
sono presenti sia il campione di cui si vuole saggiare l’attività NaMN
adeniltrasferasica, sia tutti gli enzimi coinvolti nella formazione del NADH a
partire dal NaAD (Figura 19).
Per la determinazione dell’attività, un’opportuna di campione viene
aggiunto ad una miscela costituita da Hepes 56 mM pH 7.5, etanolo assoluto
0,5% v/v, semicarbazide 14 mM, MgCl 2 11 mM, NH4Cl 4,5 mM, ATP 2,4 mM,
NMN 0,1 mM, ADH 0,03 mg/mL, BSA 0,56 mg/mL e NadE (45 µg di proteine
di un estratto grezzo di E. coli BL21 che iperesprimono l’enzima ricombinante
NadE).
La velocità di formazione del NaAD, direttamente proporzionale alla
velocità di formazione del NADH, viene determinata andando a misurare nel
tempo l’aumento di assorbanza a 340 nm, alla temperatura di 37°C.
L’attività enzimatica (U/mL) è calcolata sulla base dell’aumento lineare di
assorbanza a 340 nm della miscela nel tempo (ΔE/Δt) rispetto ad un bianco
preparato con la miscela di saggio sopra descritta nella quale al posto de l
39
MN
2- Material i e metodi
campione viene aggiunto un identico volume di acqua. Infatti, nel calcolo
dell’attività enzimatica è necessario tenere in considerazione l’aumento di
assorbanza causato dall’attività NaMN adeniltrasferasica endogena, presente
negli estratti ricombinanti di E. coli (Figura 20).
NMN
deamidasi
Nad D
NH3
NaMN
NaAD
ATP
PPi
Nad E
ADH
NAD
ATP
ADP + Pi
NADH
Etanolo
Acetaldeide
Figura 19 Schematizzazione delle reazioni enzimatiche a partire dall’NaMN Il NADH viene
sintetizzato a partire dall’NaAD prodotto nella miscela di reazione in seguito ad una serie di
reazioni ancillari catalizzate dagli enzimi NadE e alcol deidrogenasi.
Abs
340 nm
NaMN
tempo
Figura 20 Saggio spettrofotometrico continuo. La formazione di NADH si osserva dopo
aggiunta di NaMN sia nel campione (linea rossa), sia nel controllo (linea blu) preparato
sostituendo il campione di cui si vuole saggiare l’attività NaMN adeniltrasferasica con acqua.
40
2- Material i e metodi
L’attività enzimatica, espressa in U/mL, viene calcolata con la formula:
Ae (U/mL) = (ΔE/Δt) ∙ Vmix ∙ 1000/ ε ∙ Venz
Dove:
ΔE = aumento dell’assorbanza a 340 nm nell’intervallo di tempo Δt
Δt = intervallo di tempo nel quale avviene l’incremento lineare di assorbanza
ΔE.
V mix = volume totale della miscela di saggio, espressa in mL.
ε = coefficiente di estinzione millimolare del NADH (6,2 mM-1 ∙ cm-1)
V enz = volume di preparazione enzimatica nella miscela di saggio, espresso in
µL.
2.6 Espressione e purificazione delle proteine YgaD, YdeJ e YfaY
L’espressione delle proteine ricombinanti YgaD, YdeJ e YfaY è stata
ottenuta facendo crescere cloni di E. coli provenienti dalla libreria ASKA
(Kitagawa et al., 2005) iperesprimenti le proteine di interesse. Le cellule sono
state fatte crescere a 37°C in agitazione nel terreno Luria Bertani addizionat o
di Cloramfenicolo 34 μg/ml fino ad una OD 600 pari a 0,4, dopodiché le colture
sono state incubate a 20°C e addizionate di IPTG 1mM per indurre
l’espressione delle proteine. Dopo 12 ore dall’induzione, le cellule sono state
raccolte mediante centrifugazione a 5000 g per 10 minuti e i pellet congelati a
-20°C. Per la preparazione degli estratti grezzi, i pellet cellulari sono stati
opportunamente risospesi in tampone di lisi (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M,
PMSF 1mM, DTT 1mM e 2 μg/ml di ciascuno dei seguenti inibitori di proteasi:
chimostatina, antipaina, leupeptina, pepstatina) in un volume pari a 1/20 del
volume originale della coltura. Dopo rottura meccanica delle cellule per
sonicazione (3 cicli da 1 minuto con pause da 1 minuto), le sospensioni
cellulari sono state centrifugate a 13000 g per 10 minuti. I sovranatanti, che
rappresentano gli estratti grezzi, sono stati sottoposti ad analisi elettroforetica
per verificare l’avvenuta espressione delle proteine. Sui campioni, inoltre, è
stata determinata l’attività NMN deamidasica (saggio spettrofotometrico
41
2- Material i e metodi
continuo) e la concentrazione proteica (Bradford). Per la purificazione delle
proteine ricombinanti, gli estratti grezzi sono stati sottoposti a cromatografia di
affinità su resina Ni-NTA in FPLC, come descritto a pagina 38. Sulle frazioni
ottenute è stata saggiata l’attività NMN deamidasica tramite il saggio
spettrofotometrico continuo e le frazione attive sono state riunite in un unico
pool.
2.7 Analisi elettroforetica
L’analisi elettroforetica è stata condotta su gel di poliacrilammide in
condizioni denaturanti (SDS-PAGE) secondo il metodo Schagger (1987). Dopo
la corsa elettroforetica, il gel è stato colorato per 45 minuti in agitazione con la
soluzione costituita da Comassie Brilliant Blue R-250 0,1% (W/V), acido
acetico 10% (V/V) e metanolo 50% (V/V). La decolorazione è stata ottenuta
lavando il gel in agitazione in una soluzione contenente metanolo 50% (V/V) e
acido acetico 10% (V/V) fino ad ottenere l’ottimale visualizzazione delle bande
proteiche.
Confrontando la mobilità elettroforetica della banda corrispondente alla
proteina di interesse con quella di standard polipeptidici a peso molecolare
noto, fatti migrare nelle stesse condizioni, è stato possibile risalire al peso
molecolare dell’NMN deamidasi in condizioni denaturanti.
2.8 Determinazione del peso molecolare nativo dell’NM N deamidasi
Il peso molecolare dell’enzima NMN deamidasi è stato determinato
mediante gel filtrazione in FPLC, utilizzando la colonna Superose 12 HR 10/30
(Amersham) collegata al sistema FPLC (AKTA -Biotech Pharmachia) secondo il
metodo di Andrews (Andrews, 1965). Dopo aver equilibrato la colonna con il
tampone costituito da fosfato di potassio 10 mM pH 7,0, NaCl 0,3 M, DTT
1mM ad un flusso di 0,5 mL/min, è stata caricata la preparazione enzimatica
dializzata contro lo stesso tampone. La gel filtrazione è stata
effettuata a
temperatura ambiente e l’eluato è stato raccolto in frazioni da 0,5 mL che sono
42
2- Material i e metodi
state riposte immediatamente in ghiaccio e saggiate
per la presenza
dell’attività NMN deamidasica. Entro un certo intervallo di pesi molecolari
esiste una relazione lineare tra il logaritmo degli stessi e il rispettivo volume di
eluizione. Tale intervallo di linearità è definito dalla porosità della resina. Con
la Superose 12 la relazione lineare è in un intervallo di pesi molecolari
compreso tra 1 e 300 kDa ed il limite di esclusione della resina è pari a 2000
kDa. Il peso molecolare dell’enzima NMN deamidasi è stato calcolato per
confronto con una curva di taratura costruita con alcune proteine standard a
peso molecolare noto (-amilasi (200 kDa), monomero di albumina di siero
bovino (66 kDa) e anidrasi carbonica (31 kDa) che sono state sottoposte a gel
filtrazione nelle stesse condizioni dell’enzima NMN deamidasi.
2.9 Analisi bioinformatiche
Le annotazioni funzionali relative ai geni coinvolti nel metabolismo del
NAD e le corrispondenti vie metaboliche analizzate nei genomi batterici ad oggi
completamente sequenziati sono state consultate nel “subsystem” “NAD and
NADP
cofactor
biosynthesis”
presente
nel
database
SEED
(http://theseed.uchicago.edu/) (Overbeek et al., 2005). Attraverso l’utilizzo di
questo software bioinformatico è stato possibile ricostruire l’insieme delle vie
metaboliche che conducono alla formazione del NAD in S. oneidensis.
Gli allineamenti multipli di sequenza di proteine sono stati effettuati
tramite
MUSCLE (Edgar, 2004). L’albero filogenetico è stato costruito
attraverso il metodo di massima verosimiglianza attuato nel programma
PROML del pacchetto PHYLIP (Felsenstein, 1989). Il database Protein Families
(Pfam) (Finn et al., 2010) è stato usato per identificare domini funzionali
conservati.
2.10 Homology modelling e docking
Un modello iniziale della PncC da E.coli è stato creato usando il server ITASSER (Roy et al., 2010). La stabilità strutturale del modello è stata testata
43
2- Material i e metodi
mediante una simulazione di dinamiche molecolari attraverso l’utilizzo del
pacchetto GROMACS (Berendsen et al., 1995). La qualità finale del modello è
stata valutata usando il JCSG Structure Validation Server, che comprende il
PSQS (Protein Structure Quality Score) (http://www.jcsg.org/psqs/psqs.cgi). Il
docking automatico è stato effettuato mediante il programma Auto Dock 4.2.3
(Morris et al., 2008). La struttura cristallografica 2a9s è stata analizzata
tramite il server CASTp per identificare e misurare sia le tasche accessibili
interiori sia non accessibili (Dundas et al., 2006).
Tutte le manipolazioni e le visualizzazioni grafiche sono state effettuate
tramite il programma Chimera (Pettersen et al., 2004).
2.11 Costruzione dei mutanti di S. oneidensis
I singoli mutanti ed i doppi mutanti sono stati realizzati presso il Pacific
Northwest National Laboratory, Richland, Washington 99352, USA.
44
3- Risultati e discussione
Capitolo 3
RISULTATI E DISCUSSIONE
3.1 Conferma del ruolo fisiologico di PncC nel recupero/riciclo della
nicotinammide
In Figura 21 è illustrato il risultato della ricostruzione in silico della via
biosintetica del NAD in S. oneidensis, ottenuta utilizzando il programma THE
SEED (www.theseed.org).
Figura 21 Ricostruzione bioinformatica della biosintesi del NAD in S. oneidensis
Nel genoma di questa specie batterica si possono facilmente individuare
ortologhi dei geni nadA, nadB, nadC, coinvolti nella sintesi de novo del NAD e
dei geni nadD e nadE. E’ presente inoltre l’ortologo del gene nadV che codifica
per l’enzima nicotinammide fosforibosiltrasferasi, responsabile del recupero e
45
3- Risultati e discussione
del riciclo della nicotinammide e che è regolato a livello trascrizionale dalla
concentrazione intracellulare di ADP-ribosio.
La mancanza degli ortologhi dei geni pncA e pncB, codificanti per gli
enzimi responsabili della conversione della nicotinammide a nicotinato
mononucleotide tramite la formazione di acido nicotinico, indica che la via
deamidata non è operativa in S. oneidensis. Per confermare queste predizioni
bioinformatiche e il ruolo del gene pncC nella via amidata, sono stati costruiti
mutanti di S. oneidensis (ΔnadA, ΔpncC, ΔnadV, ΔnadA/ΔpncC, ΔnadA/ΔnadV)
e la crescita su terreno definito in presenza di diversi precursori del NAD è
stata paragonata a quella del ceppo Wild-Type nelle stesse condizioni (Tabella
IV e Figura 22).
Strains
Wild type
ΔnadA
ΔnadA/ΔpncC
ΔnadA/ΔnadV
DM
+
–
–
–
DM + Nm
+
+
–
–
Media
DM + Qa
+
+
+
+
DM + Na
+
–
n.r.
n.r.
Tabella IV Fenotipi di crescita del ceppo wild-type e dei mutanti knock-out di
S.oneidensis
Abbreviazioni: Nm=Nicotinammide,
Qa=acido
chinolinico,
Na=acido
nicotinico,
n.r.=non
rilevabile
46
3- Risultati e discussione
Figura 22 Crescita di S. oneidensis wild-type e dei mutanti, ΔnadV, Δpnc C, ΔnadA/ΔnadV,
ΔnadA/Δpnc C su vari terreni colturali. I terreni definiti sono stati addizionati con 200 μM di
ciascun composto indicato.
Si è osservato che i mutanti ΔpncC e ΔnadV possono crescere su terreno
definito come il ceppo wild-type, mentre il mutante ΔnadA non cresce,
indicando che nel batterio è funzionale la via di biosintesi de novo del NAD. Il
mutante ΔnadA può crescere solo se al terreno definito vengono aggiunti o Nm
o Qa; al contrario, l’ aggiunta di Na non è in grado di supportare la crescita del
mutante. Questi risultati confermano la capacità del batterio di utilizzare Nm e
Qa esogeni e l’assenza della via deamidata. Gli esperimenti condotti con i
47
3- Risultati e discussione
doppi mutanti ΔnadA/ΔpncC e ΔnadA/ΔnadV hanno permesso di confermare il
ruolo fisiologico dei geni nadV e pncC nella biosintesi del NAD. Infatti, come
atteso, entrambi i doppi mutanti perdono la capacità di crescere su terreno
definito
addizionato
di
Nm.
Questi
risultati
indicano chiaramente
il
coinvolgimento dei geni pncC e nadV nel recupero/riciclo della Nm tramite la
via amidata.
Al fine di confermare l’assenza dell’attività NMN deamidasica nel ceppo
ΔpncC, l’attività enzimatica è stata determinata negli estratti cellulari sia del
wild-type che del mutante (preparati come descritto a pagina 35) mediante il
saggio accoppiato in HPLC descritto nel paragrafo 2.1.1.1. I risultati hanno
confermato l’assenza di attività NMN deamidasica nel mutante ∆pncC, sia
durante la fase di crescita esponenziale, sia durante quella stazionaria. Per
quanto riguarda il wild-type, l’attività specifica è più alta in fase esponenziale
(5 mU/mg) rispetto alla fase stazionaria (3 mU/mg) (Figure 23-24). La
mancanza di attività NMN deamidasica nel mutante ΔpncC indica che in S.
oneidensis l’enzima codificato dal gene pncC è l’unica deamidasi in grado di
svolgere in vivo la funzione NMN deamidasica.
uV
175000
150000
125000
100000
75000
50000
25000
0
16.0
17.0
18.0
19.0
20.0
21.0
22.0
23.0
m in
Figura 23 Determinazione dell’attività NMN deamidasica nel wild -type (verde) e nel
mutante ∆pncC (rosso) in fase esponenziale. E’ mostrata parte del cromatogramma relativo
alla miscela di reazione. In blu è riportato il picco dell’NaAD standard.
48
3- Risultati e discussione
uV
200000
175000
150000
125000
100000
75000
50000
25000
0
16.0
17.0
18.0
19.0
20.0
21.0
22.0
23.0
24.0
m in
Figura 24 Determinazione dell’attività NMN deamidasica nel wild-type (verde) e nel
mutante ∆pnc C (rosso) in fase stazionaria. E’ mostrata parte del cromatogramma relativo alla
miscela di reazione. In blu è riportato il picco dell’NaAD standard.
3.2 Ruolo dell’ NMN deamidasi nel controllo dei livelli intracellulari
di NM N
Al fine di verificare se nel mutante ΔpncC ci fosse un accumulo di NMN e
una conseguente diminuzione di NaMN rispetto al ceppo Wild-Type, sono stati
determinati i livelli intracellulari di NMN e NaMN, come descritto a pagina 35.
La determinazione dei mononucleotidi è stata inizialmente condotta su estratti
nucleotidici ottenuti rompendo le cellule di S. oneidensis ed estraendo i
nucleotidi mediante HClO4 (paragrafo 2.4.1 Materiali e Metodi), tuttavia i
risultati ottenuti in campioni preparati in duplicato non erano affatto
riproducibili. E’ stato osservato che negli estratti erano presenti fosfatasi che,
non denaturate dal trattamento acido, esplicavano la loro attività catalitica
nelle miscele di reazione allestite per la determinazione dei nucleotidi. Infatti,
durante le reazioni, l’ATP addizionato alle miscele veniva parzialmente
degradato ad ADP, AMP e adenosina (Figura 25). Non si può escludere che tali
fosfatasi possano essere in grado di degradare anche l’NMN e l’NaMN e ciò
potrebbe giustificare la bassa riproducibilità dei risultati. E’ stato quindi
necessario mettere a punto un metodo alternativo per l’estrazione dei
nucleotidi che garantisse la denaturazione irreversibile delle fosfatasi. Il
metodo che prevede la bollitura delle cellule in etanolo al 70% (paragrafo 2.4.2)
49
3- Risultati e discussione
si è rivelato efficace, infatti durante le reazioni non si osserva più la formazione
dei prodotti di degradazione dell’ATP (figura 25) e i risultati sono riproducibili.
uV
225000
ATP
200000
175000
ADENOS INA
150000
ADP
125000
100000
AMP
75000
50000
25000
0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
m in
Figura 25 Confronto dei profili cromatografici di due miscele preparate con estratti acidi
(blu) e estratti in etanolo (rosso).
La determinazione dei livelli dei mononucleotidi è stata quindi condotta
su estratti preparati con l’etanolo. Nelle figure 26 e 27 sono mostrati i
cromatogrammi delle tre miscele di reazione allestite per la determinazione dei
nucleotidi rispettivamente nel wild-type e nel mutante ΔpncC. Nella tabella V
sono riportate le concentrazioni dei nucleotidi.
uV
22500
20000
17500
15000
12500
10000
7500
5000
2500
0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0m in
Figura 26 Determinazione delle concentrazioni di NMN e NaMN nel ceppo wild -type.
Cromatogramma della miscela 1 (verde, contenente NadD e PncC), della miscela 2 (blu, senza
enzimi) della miscela 3 (rosso, contenente l’enzima NadD)
50
3- Risultati e discussione
uV
22500
20000
17500
15000
12500
10000
7500
5000
2500
0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0 m in
Figura 27 Determinazione delle concentrazioni di NMN e NaMN nel mutante Δpnc C.
Cromatogramma della miscela 1 (verde, contenente NadD e PncC), della miscela 2 (blu, senza
enzimi) della miscela 3 (rosso, contenente l’enzima NadD).
Wild
Type
Δpnc C
nmoli NMN/g
nmoli NaMN/g
nmoli NaAD/g
pellet
pellet
pellet
36
15
2
29
Non rilevabile
Non rilevabile
Tabella V Livelli di NMN, NaMN e NaAD in S. oneidensis wild type e Δpnc C
Come si può vedere dalla tabella, contrariamente a quanto atteso, la
delezione del gene pncC non porta ad un accumulo di NMN nelle cellule del
batterio; probabilmente la cellula è in grado di azionare altri meccanismi che
regolano i livelli di NMN in modo che un suo aumento non inibisca la DNAligasi NAD-dipendente. Potrebbero ad esempio agire enzimi, quali fosfatasi
specifiche o aspecifiche, oppure l’ NMN glicoidrolasi, la cui attività è stata più
volte descritta, ma il corrispondente gene non è stato ancora identificato. Nel
mutante pncC si nota invece una significativa diminuzione del NaMN, i cui
livelli non sono addirittura rilevabili. Ciò suggerisce che la via biosintetica de
51
3- Risultati e discussione
novo, che nel mutante è l’unica via operativa per la sintesi di NAD e ha come
intermedio NaMN, sia particolarmente efficiente, e il nucleotide non si
accumuli in quanto immediatamente convertito a NAD.
3.3 Analisi della composizione in domini dell’NM N deamidasi di
S. oneidensis
La proteina PncC di S. oneidensis è
composta da 424 residui
amminoacidici ed è organizzata in due domini.
Il dominio N-terminale (residui 4-170) (dominio MocF) è un dominio
conservato, a funzione sconosciuta, che presenta un certo grado di omologia
con il dominio responsabile del legame alla molibdopterina (MPT) dell’enzima
MoeA, enzima coinvolto nell’ultimo step della biosintesi del cofattore a
molibdeno (Schwarz et al., 2009), un cofattore essenziale pe r l’attività degli
enzimi molibdeno-dipendenti. MoeA riconosce
come
substrato la
MPT
adenilata e catalizza l’idrolisi del legame pirofosforico tra MPT e AMP, legando
contemporaneamente il molibdeno alla MPT (Nichols and Rajagopalan, 2002;
2005) (Figura 28).
52
3- Risultati e discussione
Figura 28: Meccanismo della reazione catalizzata da Cnx1E, omologo vegetale dell’enzima
MoeA di E.c oli. In figura è mostrato l’ipotetico sito attivo di Cnx1E con il sito di legame per
MPT-AMP e per il molibdeno, il legame dei substrati (step 1), l’i drolisi di MPT-AMP (step 2), la
formazione di un intermedio di reazione (step 3) e il rilascio dei prodotti (step 4).
Il dominio C-terminale (dal residuo 252 al residuo 407), (dominio CinA) è
ampiamente conservato negli eubatteri ed è caratteristico di pr oteine annotate
come “competence inducible proteins” o proteine CinA. Tale annotazione deriva
dall’osservazione sperimentale che nel batterio Streptococcus pneumoniae la
proteina CinA è coinvolta nel meccanismo della competenza cellulare, cioè
nella capacità del batterio di trasferire DNA extracellulare al suo interno e di
integrarlo al genoma per ricombinazione omologa. Alcuni autori (Pearce et al.,
1995; Masure et al., 1998) hanno infatti dimostrato che mutazioni a carico del
gene cinA diminuiscono l’efficienza di trasformazione.
La nostra scoperta che CinA è l’NMN deamidasi potrebbe spiegare il
coinvolgimento della proteina nel processo di trasformazione. Durante gli
eventi di ricombinazione, infatti, l’incremento dell’attività DNA ligasica
53
3- Risultati e discussione
determinerebbe un aumento dei livelli di NMN, noto inibitore della ligasi stessa
(Park et al., 1989; Chen et al., 2002). L’ NMN deamidasi, con la sua attività
catalitica, non solo preverrebbe l’inibizione della ligasi ma le assicurerebbe un
continuo apporto di NAD, tramite la formazione del diretto precursore NaMN.
Pertanto, la riduzione dell’efficienza di trasformazione osservata nei ceppi con
mutazioni a carico del gene cinA potrebbe essere dovuta alla perdita
dell’attività NMN deamidasica.
3.4 Identificazione del dominio responsabile dell’attivita’ NM N
deamidasica
Ricerche di omologie di sequenza nel proteoma di E. coli utilizzando come
query PncC di S. oneidensis, hanno rilevato la presenza di tre proteine
significativamente omologhe:
YfaY, costituita da 400 amminoacidi, dove il dominio CinA è fuso con il
dominio MocF, come in S. oneidensis; e i paraloghi YgaD e YdeJ che
comprendono solo il dominio CinA (Figura 29).
Figura 29 Composizione e attività enzimatica delle proteine di S.oneidensis e di E.c oli
contenenti il dominio CinA
54
3- Risultati e discussione
L’allineamento tra YfaY e PncC da S.oneidensis evidenzia il 65% di
similarità e il 48% di identità tra le due proteine (Figura 30-A). La proteina
YgaD mostra il 61% di similarità e il 45% di identità con la proteina PncC
(Figura 30-B), mentre la proteina YdeJ il 55% di similarità e il 33% di identità
(Figura 30-C ).
A
YfaY
MLKVEMLSTGDEVLHGQIVDTNAAWLADFFFHQGLPLSRRNTVGDNLDDLVTILRERSQHADVLIVNGGLGPTSD
DLSALAAATAKGEGLVLHEAWLKEMERYFHERGRVMAP SNRKQAELPASAEFINNPVGTACGFAVQLNRCLMFFT
PGVPSEFKVMVEHEILPRLRERFSLPQPPVCLRLTT FGRSESDLAQSLDTLQLPPGVT MGYRSSMPIIELKLTGPASE
QQAMEKLWLDVKRVAGQSVIFEGTEGLPAQISRELQNRQFSLTLSEQFTGGLLALQLSRAGAPLLACEVVP SQEET
LAQTAHWIT ERRANHFAGLALAVSGFENEHLNFALATPDGTFALRVRFSTTRYSLAIRQEVCAMMALNMLRRWLNG
QDIASEHGWIEVVESMTLSV
Length = 400
Score = 265 bits (678), Expect = 3e-72
Identities = 138/285 (48%), P ositives = 186/285 (65%), Gaps = 1/285 (0%)
B
YgaD
MT DSELMQLSEQVGQALKARGATVTTAESCTGGWVAKVIT DIAGSSAWFERGFVTYSNEAKAQMIGVREETLAQH
GAVSEPVVVEMAIGALKAARADYAVSISGIAGPDGGSEEKPVGT VWFAFATARGEGITRRE CFSGDRDAVRRQATA
YALQTLWQQFLQNT
Length = 165
Score = 128 bits (321), Expect = 8e-31
Identities = 70/154 (45%), Positives = 94/154 (61%)
55
3- Risultati e discussione
C
YdeJ
MNINRDKIVQLVDTDT IENLTSALSQRLIADQLRLTTAESCTGGKLASALCAAEDTPKFYGAGFVTFTDQAKMKILSV
SQQSLERYSAVSEKVAAEMATGAIERADADVSIAITGYGGPEGGEDGTPAGTVWFAWHIKGQNYTAVMHFAGDCE
TVLALAVRFALAQLLQLLL
Length = 172
Score = 80,9 bits (198), Expect = 2e-16
Identities = 43/127 (33%), Positives = 71/127 (55%)
Figura 30 Sequenze amminoacidiche delle proteine YfaY (A), YgaD (B) e YdeJ (C) da
Esc heric hia c ol i e allineamenti con PncC da Shewanell a oneidensis.
Al fine di verificare quale dei due domini presenti nella NMN deamidasi da
S.oneidensis fosse responsabile dell’attività NMN deamidasica, le proteine
YfaY, YgaD e YdeJ sono state iperespre sse facendo crescere i cloni della
libreria ASKA (Kitagawa et al., 2005) trasformati col plasmide pCA24N
contenente il gene per la proteina di interesse (vedi pagina 41 di Materiali e
Metodi). Dopo aver verificato tramite SDS-PAGE la presenza delle proteine
ricombinanti negli estratti grezzi (dati non mostrati), negli stessi estratti è stata
misurata l’attività enzimatica come descritto a pagina 26.
56
3- Risultati e discussione
KDa
M
Y gaD YfaY YdeJ
200
150
120
100
70
50
40
30
20
15
10
Figura 31 Espressione delle proteine YgaD, YfaY e YdeJ da E.c oli. Analisi in SDS-PAGE
delle proteine ricombinanti YgaD, YfaY e YdeJ purificate da estratti di cellule iperesprimenti gli
enzimi. Linea M= proteine standard a peso molecolare noto.
Nelle cellule iperesprimenti YfaY e YdeJ l’attività NMN deamidasica è simile
a quella determinata prima dell’induzione (0.003 Unità/mg). Lo stesso valore
di attività specifica si riscontra nelle cellule iperesprimenti la proteina YgaD
prima dell’induzione; tuttavia, dopo induzione, l’attività aumenta di 100 volte
(0.26 Unità/mg).
La purificazione delle tre
proteine ricombinanti (Figura 31) e la
determinazione della attività NMN deamidasica nelle preparazioni purificate ha
confermato che solo YgaD è dotata di attività catalitica, con un’attività
specifica di circa 17.8 Unità/mg.
Questi risultati indicano che in E.coli l’unica PncC funzionale è YgaD e
permettono di concludere che nella NMN deamidasi di S. oneidensis il dominio
responsabile dell’attività NMN deamidasica è il dominio CinA, che abbiamo
quindi riannotato PncC.
57
3- Risultati e discussione
3.5 Caratterizzazione dell’NM N deamidasi di E. coli
3.5.1 Purificazione della proteina ricombinante
In Figura 32 è mostrato il risultato della cromatografia di affinità sulla
resina Ni-NTA che ha permesso di ottenere YgaD (PncC) in forma omogenea,
con attività specifica di 17.8 U/mg. La procedura della purificazione è
descritta in Materiali e Metodi.
Abs 280 (mAU)
YgaD
Tempo (min)
Figura 32 Purificazione NMN deamidasi da E. c oli. Cromatografia Ni-NTA in FPLC. La freccia
indica il picco corrispondente alla proteina YgaD.
La proteina purificata è stata utilizzata per la caratterizzazione molecolare
e cinetica, dopo aver allontanato l’imidazolo presente nel tampone di eluizione
della colonna, e quindi nella preparazione enzimatica, mediante dialisi
estensiva contro tampone Hepes 50 mM pH 7,5 NaCl 0,15 M.
58
3- Risultati e discussione
3.5.2 Proprietà molecolari
L’NMN deamidasi di E. coli è costituita da 187 residui amminoacidici e la
sua massa molecolare, determinata tramite SDS-PAGE, è stata stimata essere
di circa 20 kDa (Figura 31).
Il peso molecolare nativo della proteina è stato determinato tramite gel
filtrazione, come descritto in Materiali e metodi. In figura 33 è mostrata la
curva di taratura della colonna ottenuta correlando il tempo di eluizione di
ciascuna proteina standard con il logaritmo del rispettivo peso molecolare. Il
peso molecolare nativo dell’NMN deamidasi, ricavato per interpolazione della
retta, è risultato essere pari a 43 kDa, facendo ipotizzare un struttura
dimerica dell’enzima in soluzione. Lo stesso esperimento era stato effettuato
per l’ NMN deamidasi da S. oneidensis e il risultato aveva permesso di
ipotizzare anche per questa proteina una struttura dimerica.
5,2
-amilasi
5,1
log MW (kDa)
5
4,9
Bsa
4,8
4,7
YgaD
4,6
4,5
y = -0,0967x + 7,2929
Anidrasi-carbonica
4,4
20,5
21,5
22,5
23,5
24,5
25,5
26,5
27,5
28,5
29,5
Tempo di eluizione (min)
Figura 33 Retta di taratura della colonna di gel filtrazione, utilizzata per il calcolo del peso
molecolare dell’N MN deamidasi nativa
59
3- Risultati e discussione
3.5.3 Proprietà catalitiche
3.5.3.1 pH ottimale
Per la determinazione del pH ottimale, un’opportuna quantità di enzima è
stata incubata a 37°C per 15 minuti in presenza di NMN 0,1 mM nei tamponi
di seguito elencati: citrato di sodio 50 mM per i valori di pH 4,0- 4,5- 5,0 – 5,5
– 6,0; fosfato di sodio 50 mM per i valori 6,0 – 6,5 – 7,0 – 7,5 – 8,0; Tris-HCl 50
mM per i valori 8,0 e 8,5 e borato di sodio 50 mM per i valori 8,5 – 9,0- 9,5 –
9,8 – 10,5.
La miscela di reazione, dopo 15 minuti, è stata acidificata e neutralizzata,
e l’ NaMN prodotto è stato determinato spettrofotometricamente come descritto
a pagina 32. I dati ottenuti rivelano che
il pH ottimale è compreso in un
ampio intervallo di valori, da pH 4,0 a 9,8 (Figura 34).
Studi di pH ottimale effettuati per l’NMN deamidasi da S.oneidensis
avevano mostrato che anche questo enzima è attivo in un ampio intervallo di
valori di pH.
Attività enzimatica (mU/ml)
35
30
25
citrato
20
fosfato
15
tris
borato
10
5
0
2
4
6
8
10
12
pH
Figura 34 Effetto del pH sull’attività enzimatica di YgaD.
60
3- Risultati e discussione
3.5.3.2 Determinazione della Km
Per l’analisi cinetica, l’attività è stata determinata con il saggio
accoppiato in HPLC (pagina 26) variando la concentrazione del substrato NMN.
Sono state utilizzate le seguenti concentrazioni di substrato: 1 µM, 2 µM, 4
µM, 8 µM, 16 µM.
In figura 35 sono riportati il grafico della velocità della reazione in
funzione della concentrazione del substrato e il grafico dei doppi reciproci.
A
Attività enzimatica (mU/ml)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
[NMN] (uM)
61
3- Risultati e discussione
1/V (mU/ml) -1
B
-1
-0,5
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2 0
-0,4
-0,6
-0,8
0,5
1
1,5
2
1/[NMN] (uM) -1
35 A. Grafico lineare diretto di Eisental e Cornish-Bowden. B. Grafico di Lineweaver-Burk
Come si osserva in Figura 35A l’ NMN deamidasi segue la cinetica di
Michaelis-Menten; tale comportamento è confermato dal grafico dei doppi
reciproci, in cui i dati sperimentali danno origine ad una retta intersecante
l’asse delle ascisse (fig.35-B). Dai grafici è stata calcolata una K m per l’NMN di
6 μM e una Kcat pari a 3,3 s-1.
Anche se l’analisi cinetica ha dato risultati diversi da quelli ottenuti in
precedenza per l’NMN deamidasi da S. oneidensis, che segue una cinetica
allosterica, entrambi gli enzimi mostrano la stessa affinità per l’NMN e valori di
Kcat molto simili.
3.5.3.3 Specificità di substrato ed effetto di molecole correlate al metabolismo
del NAD
La specificità di substrato è stata valutata determinando l’attività
enzimatica in presenza di Nicotinammide, Nicotinammide riboside, NAD e NMN, alla concentrazione di 1 mM, tramite il saggio diretto in HPLC descritto a
pagina 28.
Nessuna delle molecole analizzate viene utilizzata quale substrato
dall’NMN deamidasi.
62
3- Risultati e discussione
L’ effetto sull’attività enzimatica
di
alcuni
composti
correlati
al
metabolismo del NAD è stato valutato determinando l’attività mediante il
saggio diretto in HPLC (pagina 28) in presenza di Acido nicotinico, Acido
Picolinico, Acido Chinolinico, NAD, NaAD, NADP e Nicotinammide,
alla
concentrazione di 1 mM.
Nessuno
dei
composti
analizzati
interferisce
con
l’attività
NMN
deamidasica.
3.6 Distribuzione filogenetica del dominio PncC
La ricerca
di proteine omologhe a
PncC di E. coli e S. oneidensis,
condotta in un gruppo di 100 genomi batterici rappresentativi, ha identificato
93 proteine contenenti il dominio PncC. Un allineamento multiplo delle
sequenze più divergenti (Figura 36)
Figura 36 Allineamento multiplo del dominio PncC di alcune proteine PncC selezionate
63
3- Risultati e discussione
ha mostrato che le proteine contenenti il dominio PncC possono essere divise
in quattro gruppi in base alla composizione dei loro domini e alla predizione
della loro attività enzimatica:

PncC: proteine omologhe alla PncC da E.coli, cioè con il solo dominio
PncC e dotate di attività NMN deamidasica.

MocF/PncC: proteine omologhe alla PncC da S.oneidensis, cioè
costituite dai due domini PncC e MocF e dotate di attività NMN
deamidasica.

YfaY: proteine omologhe a YfaY da E.coli, cioè costituite dai due
domini PncC e MocF, in cui però il dominio PncC non ha attività
NMN deamidasica.

YdeJ: proteine omologhe a YdeJ da E.coli, cioè contenenti solo il
dominio PncC cataliticamente inattivo.
Dall’allineamento delle varie sequenze, si può ipotizzare che la mancanza
dell’attività enzimatica nel gruppo YfaY sia dovuta alla presenza di delezioni
multiple e mutazioni nel dominio PncC. D’altra parte, questa osservazione non
è valida per spiegare la mancanza di attività delle proteine del gruppo YdeJ,
dove il dominio PncC sembra essere conservato. In quest’ultimo caso, si
potrebbe presumere che mutazioni singole e cruciali a livello del sito attivo
possano aver causato la perdita dell’attività enzimatica. Effettivamente l’analisi
strutturale descritta nel capitolo successivo sembra supportare questa ipotesi.
Le proteine contenenti il dominio PncC sono largamente presenti negli
Eubatteri e sono assenti negli Eucarioti e negli Archeabatteri. L’albero
filogenetico costruito per 93 proteine contenenti il dominio PncC è mostrato in
figura 37.
64
3- Risultati e discussione
Figura 37 Albero filogenetico costruito per le proteine contenenti il dominio PncC. In
verde: enzima funzionale a singolo dominio; in giallo: enzima funzionale a due domini; in grigio:
enzima non funzionale a due domini; in nero: enzima non funzio nale a singolo dominio. Le stelle
rosse indicano le proteine caratterizzate sperimentalmente. Le abbreviazioni dei genomi sono
elencate in figura 38.
Il dominio PncC funzionale è fuso col dominio MocF in 40 proteine
appartenenti a diversi gruppi tassonomici come i Firmicuti, gli Actinobatteri, i
Cianobatteri, Thermotoga e i Bacteroidi. Al contrario, la maggior parte dei
Proteobatteri contengono le proteine a singolo dominio del gruppo PncC. In
qualche gruppo tassonomico dei Proteobatteri (come gli Enterobatteri e i
Vibrionales) sono state rilevate sia proteine del gruppo PncC (funzionali, a
singolo dominio), sia proteine del gruppo YfaY (non funzionali, a due domini).
Inoltre, qualche Enterobatteriacea, compreso E.coli e le specie di Salmonella,
hanno anche proteine del gruppo YdeJ (non funzionali, a singolo dominio).
L’enzima è assente in tutte le specie batteriche mancanti dell’enzima
NadD, così come nei piccoli genomi di patogeni obbligati e simbionti (figura
38). Inaspettatamente, l’enzima è assente o presente come proteina non
65
3- Risultati e discussione
funzionale in alcune specie, come Staphylococcus aureus e Deinococcus
radiodurans, dove è operativa la via deamidata per la biosintesi del NAD e
quindi è presente NadD.
66
3- Risultati e discussione
Figura 38 Distribuzione dell’ NMN deamidasi e di altri enzimi della biosintesi del NAD
67
3- Risultati e discussione
3.7 Analisi strutturale dell’ NM N deamidasi
L’analisi strutturale è stata possibile grazie alla disponibilità della
struttura
tridimensionale
ad
alta
risoluzione
(1,75
Å)
di
PncC
da
Agrobacterium tumefaciens (codice PDB: 2A9S), ottenuta al Midwest Center for
Structural Genomics (http://www.mcsg.anl.gov/).
L’attribuzione della funzione NMN deamidasica a questa proteina è basata
sulla significativa omologia di sequenza con la PncC da E.coli (47% identità,
63%
similarità). La struttura, che
mostra
un’organizzazione
dimerica,
rappresenta una variante unica e caratteristica del ripiegamento dell’
“anticodon-binding domain” delle tRNA sintetasi di classe II (Arnez et al.,
1995). Effettivamente, nel database SCOP, la struttura è annotata come
l’unica rappresentante della superfamiglia denominata CinA. Si tratta quindi
di un “fold” nuovo, diverso da quello tipico delle amidoidrolasi ad oggi
caratterizzate. In accordo con questo risultato è la mancanza di omologia tra la
sequenza dell’NMN deamidasi e quella delle amidoidrolasi conosciute.
La struttura è stata usata come templato per la predizione della struttura
tridimensionale della PncC da E.coli attraverso studi di homology modelling.
Come previsto sulla base della marcata omologia di struttura primaria, il
modello ottenuto è essenzialmente identico alla struttura di PncC da A.
tumefaciens (Figura 39-A). I valori di deviazione quadratica media, calcolati
sovrapponendo lo scheletro del modello dell’enzima da E.coli con quello da A.
tumefaciens, risultano essere di circa 1 Å.
Al fine di predire la localizzazione del sito attivo, sulla proteina di A.
tumefaciens è stata effettuata un’analisi di carica di superficie in seguito alla
quale è stata rilevata la presenza di una piccola tasca con un area di 283,3 Å 2
e un volume di 381,1 Å3 che potrebbe rappresentare il sito attivo (Figura 39B/C).
68
3- Risultati e discussione
Figura 39 Analisi strutturale dell’NMN deamidasi a) Rappresentazione a nastro della PncC da
E.coli (azzurro) sovrapposta al monomero della PncC da A.tumefaciens (codice PDB: 2A9S;
arancione) b) Superficie elettrostatica del dimero della PncC da A. tumefaciens; in blu sono
rappresentate le cariche positive, in rosso quelle negative c) Rappresentazione a nastro del
dimero della PncC da A. tumefac iens in complesso con l’NMN d) Visione dettagliata delle
interazioni tra la PncC da A. tumefac iens e l’NMN; i legami idrogeno sono rappresentati con le
linee rosse
Effettivamente, in questa regione della struttura ci sono alcuni amminoacidi
(Gly46 e Ser48 della catena A e Ser31, Gly34, Tyr58, Gly106, Ile107, Ala108,
Gly109 e Arg145 della catena B) che sono altamente conservati in tutte le NMN
deamidasi batteriche (Figura 36) avvalorando la predizione della localizzazione
del sito attivo.
Ulteriori studi computazionali hanno permesso di modellare la molecola
dell’ NMN nell’ ipotetico sito attivo e
di
predire i
residui coinvolti
nell’interazione con il nucleotide (Figura 39-B/D). I residui ipoteticamente
coinvolti nella stabilizzazione dell’NMN sono strettamente conservati in tutte le
proteine funzionalmente attive appartenenti ai gruppi PncC e MocF/PncC
(Figura 36). Inoltre, la Ser31, la Thr105 e la Gly106 che interagiscono col
gruppo ammidico dell’NMN, così come la Ser48 legata tramite legame idrogeno
69
3- Risultati e discussione
al gruppo fosfato, sono tutti assenti nel gruppo YfaY, in accordo con la
mancanza di attività enzimatica in questo gruppo di proteine.
Infine, le proteine del gruppo YdeJ, anch’esse predette essere inattive,
mancano della Ser48 e dell’Arg145, entrambe coinvolte nella stabilizzazione
del gruppo fosfato dell’ NMN.
70
4- Conclusioni
Capitolo 4
CONCLUSIONI
L’obiettivo di questa tesi è stato quello di verificare il ruolo fisiologico
dell’enzima precedentemente identificato come NMN deamidasi mediante studi
biochimici. A tale scopo sono stati condotti studi genetici in vivo che hanno
permesso di confermare il coinvolgimento dell’enzima nel metabolismo della
vitamina B3. Gli esperimenti sono stati condotti sul batterio Shewanella
oneidensis, scelto come modello sperimentale perché in questo batterio l’ NMN
deamidasi è predetto essere essenziale per il recupero della nicotinammide; in
effetti i risultati hanno dimostrato che in assenza dell’enzima il batterio non è
più in grado di utilizzare la nicotinammide come fonte esogena di NAD.
L’osservazione che la mancanza dell’ NMN deamidasi non comporta l’
accumulo di NMN suggerisce che nella cellula sono attivi altri enzimi in grado
di impedire l’aumento del nucleotide e prevenire così l’inibizione della DNA
ligasi.
L’NMN deamidasi da S. oneidensis è costituita da due domini e al fine di
identificare quale dei due fosse responsabile dell’attività NMN deamidasica,
sono state funzionalmente caratterizzate le proteine da E. coli omologhe al
dominio N-terminale (YfaY) e a quello C-terminale (YgaD e YdeJ). I risultati
hanno dimostrato che YgaD è l’NMN deamidasi da E.coli, e che quindi il
dominio
responsabile
dell’attività
NMN
deamidasica
nell’enzima
da
S.oneidensis è quello C-terminale. La funzione del dominio N-terminale deve
essere ancora determinata, così come il suo possibile coinvolgimento nel
comportamento cinetico di tipo allosterico che
differenzia l’enzima di
S.oneidensis da quello di E.coli, che invece segue una cinetica lineare. E’
comunque
certo che la diversa organizzazione in domini non incide
sull’efficienza catalitica dell’enzima dato che sia l’NMN deamidasi a due domini
di S.oneidensis che l’enzima a singolo dominio di E.coli mostrano gli stessi
valori di Kcat. L’enzima ha un’ affinità per l’ NMN molto alta, e ciò indica che la
reazione di deamidazione è efficiente anche a concentrazioni di NMN molto
73
4- Conclusioni
basse. Questa osservazione è in accordo con il ruolo proposto per l’enzima
nella regolazione dei livelli intracellulari di NMN.
L’NMN deamidasi è altamente conservato e presente nella maggior parte
delle specie batteriche. Come atteso, e’ assente in quei batteri che mancano
dell’enzima NadD, in grado di adenilare l’NaMN a NAD. Non è presente negli
archea, né negli eucarioti.
L’ NMN deamidasi è distinta sia filogeneticamente che strutturalmente
dalle
amidoidrolasi ad oggi caratterizzate. La struttura cristallografica
depositata in banca-dati della proteina da Agrobacterium tumefaciens, omologa
all’ NMN deamidasi da E. coli, indica che si tratta di un nuovo “fold”, e quindi
di una nuova famiglia di amidoidrolasi. Il modellamento di una molecola di
NMN nell’ipotetico sito attivo della struttura dell’enzima e l’individuazione di
residui altamente conservati che interagiscono con il nucleotide fanno
ipotizzare che l’enzima sia un’ amidoidrolasi a serina.
L’ identificazione del gene codificante per l’NMN deamidasi e la stretta
specificità dell’enzima per il substrato NMN, hanno permesso di utilizzare l’
enzima ricombinante per sviluppare un saggio enzimatico utile per la
determinazione dei livelli cellulari delle due forme mononucleotidiche della
vitamina B3, l’ NMN e l’ NaMN. Tale saggio può essere utilizzato sia su cellule
batteriche che su cellule eucariotiche e può costituire una valida alternativa ai
saggi che prevedono l’ uso della spettrometria di massa (Yamada et al., 2006;
Evans et al., 2010) o ai saggi fluorimetrici (Formentini et al., 2009).
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