GIDM
Lavoro originale
21, 9-15, 2001
ELEVAZIONE DELLE CONCENTRAZIONI PLASMATICHE
DI OMOCISTEINA IN PAZIENTI CON DIABETE DI TIPO 1
E COMPLICANZE MICROVASCOLARI
V. CUOMO, M. SACCO, A.F. PERNA*, C. IOVINE, M. MASULLI, D. INGROSSO*, O. VACCARO
riassunto
Introduzione. Se l’iperomocisteinemia contribuisca allo sviluppo della microangiopatia diabetica è una problematica tuttora dibattuta che presenta implicazioni scientifiche e di pratica clinica, dal momento che l’iperomocisteinemia può essere corretta attraverso interventi nutrizionali.
Obiettivi. Gli scopi dello studio sono: 1) valutare i livelli plasmatici di omocisteina e alcuni dei loro maggiori
determinanti in pazienti con diabete mellito di tipo 1 e controlli non diabetici; 2) chiarire le basi di tale associazione studiando la relazione tra omocisteinemia, stato vitaminico e complicanze microvascolari del diabete.
Materiale e metodi. Abbiamo studiato 66 pazienti affetti da diabete mellito tipo 1, con durata del diabete
superiore a 10 anni, con normale creatininemia (<1,3 mg/dL) e privi di malattie cardiovascolari clinicamente
evidenti. Abbiamo inoltre studiato un gruppo di 44 controlli non diabetici. Per tutti i partecipanti sono state
determinate le concentrazioni plasmatiche di omocisteina, folato e vitamina B12. La microalbuminuria è stata
valutata come rapporto albumina/creatinina sulle urine del mattino; la retina è stata studiata mediante la fotografia del fondo oculare.
Risultati. I livelli plasmatici di omocisteina sono molto simili nei pazienti diabetici e nei controlli normoglicemici. I pazienti con microalbuminuria o retinopatia proliferante avevano livelli di omocisteina plasmatica significativamente più alti rispetto a quelli senza tali complicanze (rispettivamente 9,4 ± 3,1 vs 7,4 ± 2,8 mmol/L,
p < 0,02 e 9,5 ± 2,6 vs 7,3 ± 3,0 mmol/L, p < 0,05). Tali risultati non possono essere attribuiti a fattori confondenti quali età, sesso o fumo di sigaretta, né a differenze nelle concentrazioni plasmatiche di folato e vitamina B12.
Conclusioni. Il diabete mellito di tipo 1 di per sé non si associa a elevati livelli plasmatici di omocisteina. I
pazienti con microalbuminuria e/o retinopatia proliferante mostrano valori di omocisteinemia significativamente più alti rispetto a quelli privi di tali complicanze. Quest’associazione non è mediata dai fattori confondenti esplorati nello studio né da differenze nel bilancio vitaminico.
Parole chiave. Omocisteina, microalbuminuria, retinopatia, acido folico, vitamina B12.
summary
Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentazione, Facoltà di Medicina, Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli;
*Istituto di Biochimica delle Macromolecole, Facoltà di Medicina, Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli
Microvascular complications of diabetes and plasma homocysteine in type 1 diabetic patients.
Background. Whether homocysteine contributes to the development of diabetic microangiopathy is still a debated
issue with important scientific and clinical practice implications, since hyperhomocysteinemia is susceptible to correction by nutritional means.
Objectives. 1) To evaluate the association between fasting plasma homocysteine, type 1 diabetes and the microvascular complications of diabetes; 2) to elucidate the basis of this association by investigating some of the major determinants of plasma homocysteine in relation to diabetic microangiopathy.
Methods. We studied sixty-six consecutive patients with type 1 diabetes mellitus of >10 years duration, with normal
serum creatinine (1.3 mg/dL) and free from clinically detectable cardiovascular diseases. Forty-four non diabetic controls were also studied. Plasma concentrations of homocysteine, folate and vitamin B12 were investigated. Renal and
retinal diabetic complications were evaluated as albumin/creatinine ratio on early morning urine spot collection and
fundus photographs.
Results. Fasting plasma homocysteine levels were very similar in diabetic patients and normoglycemic controls
(8.0 ± 2.9 vs 9.3 ± 3.6 mmol/L). Patients with microalbuminuria or proliferative retinopathy had significantly higher
plasma homocysteine than those without - respectively 9.4 ± 3.1 vs 7.4 ± 2.8 mmol/L, p < 0.02 and 9.5 ± 2.6 vs
7.3 ± 3.0 mmol/L, p < 0.05.The finding is not explained by confounders, such as age, sex and smoking, nor by differences in plasma concentrations of folate and vitamin B12.
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Conclusions. Type 1 diabetes is not associated with increased plasma homocysteine levels. Patients with microalbuminuria and/or proliferative retinopathy show significantly higher plasma homocysteine values as compared to
those free from these conditions. This association is not mediated by obvious confounders, nor by differences in vitamin status. On these basis it is plausible to hypothesize that plasma homocysteine contributes, together with other
diabetes related noxae to the development of nephropathy and the progression of retinopathy.
Key words. Homocysteine, microalbuminuria, retinopathy, folic acid, vitamin B12.
Introduzione
Le evidenze più recenti della letteratura indicano che
un moderato aumento dell’omocisteina plasmatica
rappresenta un fattore di rischio indipendente per
accidenti cardiovascolari (1-5). Alcune osservazioni,
inclusi studi in vitro e su animali, indicano l’esistenza di
plausibili meccanismi biologici che mettono in relazione l’iperomocisteinemia con gli eventi cardiovascolari: ad esempio l’omocisteina causa danno endoteliale, agisce come agente trombogenico e stimola la proliferazione delle cellule muscolari lisce (5-10). Tutti i
meccanismi descritti non solo giocano un ruolo nell’aterogenesi ma sembrano anche essere implicati nella
patogenesi delle lesioni microvascolari del diabete.
Se il diabete si associa a elevati livelli di omocisteina e
se questi contribuiscono allo sviluppo delle sue complicanze vascolari (sia microvascolari che macrovascolari) non è stato ancora chiarito (11-19). Una relazione tra un aumentata escrezione urinaria di albumina e iperomocisteinemia è stata riportata in pazienti
sia di tipo 1 che di tipo 2, tuttavia le basi di quest’associazione rimangono poco chiare. Inoltre la relazione tra livelli plasmatici di omocisteina e retinopatia (la
più specifica tra le complicanze del diabete) è stata
finora poco studiata.
La relazione tra l’omocisteinemia e le complicanze
vascolari del diabete rappresenta una problematica di
rilievo nella pratica clinica, dal momento che l’iperomocisteinemia è suscettibile di correzione tramite
interventi nutrizionali. È infatti risaputo che condizioni
relativamente frequenti, quali un basso apporto di vitamina B12 e di acido folico, possono determinare moderati aumenti dei livelli di omocisteina, in quanto tali
vitamine sono importanti cofattori nelle tappe del
catabolismo dell’omocisteina (2, 8, 20). L’obiettivo di
questo studio è duplice: 1) valutare i livelli di omocisteina e alcuni dei suoi maggiori determinanti in
pazienti con diabete mellito di tipo 1 rispetto a controlli non diabetici; 2) studiare la relazione tra omocisteina, stato vitaminico e complicanze microvascolari
del diabete.
Materiale e metodi
Abbiamo studiato 66 pazienti consecutivi affetti da
diabete mellito di tipo 1 con durata della malattia
superiore ai 10 anni. Il deficit di insulina è stato definito come storia documentata di chetoacidosi e/o
concentrazione a digiuno di peptide C < 0,2 nmol/L.
Abbiamo inoltre studiato un gruppo di controllo di
44 soggetti non diabetici paragonabili per sesso ed
età, reclutato fra i coniugi dei pazienti.
I criteri di esclusione sono stati: la presenza di macroproteinuria dimostrata dall’Albustix; riscontro di una
creatininemia ≥ 1,3 mg/dL; uso di farmaci antipertensivi; presenza di malattie cardiovascolari clinicamente
evidenti diagnosticate con il questionario della OMS
su infarto, angina e claudicatio (21), con l’ECG standard e con l’indice di Winsor. Sia i partecipanti diabetici che quelli non diabetici sono stati informati sugli
obiettivi e le modalità dello studio e hanno dato il loro
consenso a partecipare. L’approvazione per lo studio è
stata data dalla commissione etica della struttura.
La retinopatia è stata studiata mediante fotografia del
fondo oculare eseguita e valutata secondo un protocollo standard (22). I partecipanti sono stati classificati in tre gruppi: assenza di retinopatia (< 2 microaneurismi), retinopatia non proliferante (2 o più
microaneurismi, o emorragie retiniche, o essudati
duri o morbidi, o edema maculare), retinopatia proliferante (neovascolarizzazione o emorragie del vitreo
o glaucoma emorragico o proliferazione fibrovascolare o distacco di retina, pregressa fotocoagulazione
panretinica) (22-23). L’esame del fondo oculare non
è disponibile per due pazienti.
Per la determinazione dell’omocisteina, il sangue è
stato prelevato a digiuno in provette con EDTA immediatamente centrifugate a 4 °C per separare il plasma
dalle cellule. I campioni sono stati poi congelati a –80
°C per successive misurazioni. L’omocisteinemia è
stata misurata con la cromatografia liquida ad alta
risoluzione secondo il metodo di Ubbink, modificato
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Risultati
I partecipanti diabetici avevano una durata media del
diabete di 17 ± 7 anni, ed erano in uno stato di discreto controllo glicemico come dimostrato dai livelli
di emoglobina glicata (8,0 ± 1,2%). Per effetto dei criteri di selezione adottati l’età e la distribuzione dei due
sessi erano simili nei pazienti diabetici e nei controlli
(tab. I). L’indice di massa corporea era significativamente più alto nei pazienti non diabetici, mentre i
livelli plasmatici di omocisteina a digiuno erano molto
simili nei partecipanti con o senza diabete (tab. I).
I livelli plasmatici di folato e vitamina B12 erano in un
range normale sia nei pazienti diabetici che nei soggetti non diabetici; ma i valori erano significativamente più alti nei diabetici (tab. I).
I livelli plasmatici di omocisteina erano significativamente e inversamente correlati con i livelli plasmatici
di folato e vitamina B12 sia nei partecipanti diabetici
che nei non diabetici, mentre nel gruppo dei diabetici nessuna correlazione significativa era osservata con
variabili associate al diabete, quali la durata della
malattia e l’emoglobina glicata (tab. II).
TAB. I. Caratteristiche generali, livelli plasmatici
di omocisteina acido folico e vitamina B12
nei pazienti con diabete mellito tipo 1
e nei controlli normoglicemici
Pazienti diabetici
(n = 66)
Controlli normoglicemici
(n = 44)
43,3 ± 6,8
44,1 ± 6,5
Maschi (%)
50
55
IMC (kg/m2)
25,1 ± 2,9
26,9 ± 3,7*
Omocisteinemia (mmol/L)
8,0 ± 2,9
9,3 ± 3,6
Folati (nmol/L)
15,2 ± 4,9
10,2 ± 5,9**
417, ± 115,0
303,0 ± 116,1**
17,0 ± 7,0
-
Età (anni)
B12 (pmol/L)
Durata del diabete (anni)
* p < 0,05; ** p < 0,02
I pazienti con microalbuminuria (fig. 1) avevano livelli significativamente più alti di omocisteina plasmatica rispetto a quelli senza microalbuminuria (9,4 ± 3,1
vs 7,4 ± 2,8 mmol/L, rispettivamente). Questa differenza non è spiegata da variazioni nella concentrazione di acido folico o di vitamina B12, i cui valori non
erano significativamente differenti fra i due gruppi
con o senza microalbuminuria (fig. 2); né da differenze nella creatinina sierica (0,9 ± 0,2 e 0,86 ± 0,1
14
Omocisteinemia (µmol/L)
da Perna (24, 25), valutando l’omocisteina totale. Le
concentrazioni plasmatiche di vitamina B12 e folato
sono state misurate contemporaneamente sul siero
usando un kit presente in commercio (Simultrac SNB
B12 57Co/folate 125I radioassay solid phase no-boil Kit;
ICN Biomedicals).
La microalbuminuria è stata misurata con metodo
radioimmunologico sulle urine del mattino; valori compresi tra 30 e 300 µg/mg di creatinina sono stati definiti
come microalbuminuria (26). La clearance della creatinina è stata calcolata tramite la formula di Cockroft (27).
Tutti gli esami clinici e laboratoristici sono stati eseguiti in cieco da operatori che non erano a conoscenza né della diagnosi di diabete né dello stato delle
complicanze.
Analisi statistica: i risultati sono espressi come media
± deviazione standard o in percentuali. La relazione
tra l’omocisteinemia e lo stato vitaminico o le altre
variabili è stata studiata con la correlazione di
Pearson. I confronti tra i gruppi per le variabili continue sono stati eseguiti attraverso un test t di
Student per dati non appaiati o con analisi della
varianza con il post hoc Duncan test. È stata necessaria la trasformazione logaritmica dei valori di
omocisteina per rendere valida l’assunzione della
normalità della sua distribuzione. L’analisi è stata
condotta con i dati in forma logaritmica; i risultati
sono stati espressi nella scala originale.
12
*
10
8
6
4
2
0
* p < 0,03
Microalbuminuria
No
Sì
Fig. 1. Livelli di omocisteinemia nei pazienti diabetici di tipo 1 con
o senza microalbuminuria.
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TAB. II Correlazione semplice (r) fra i livelli
plasmatici di omocisteina e alcuni suoi
determinanti, nei pazienti con o
senza diabete mellito tipo 1
Pazienti diabetici
(n = 66)
Controlli normoglicemici
(n = 44)
r
p
r
p
Età (anni)
0,20
0,26
0,15
0,32
Folati (nmol/L)
–0,46
0,001
–0,55
0,001
B12 (pmol/L)
–0,41
0,001
–0,51
0,001
Durata del
diabete (anni)
0,2
0,9
-
-
Emoglobina
glicosilata (%)
–0,15
0,3
-
-
mg/dL rispettivamente) o nella clearance della creatinina (96,8 ± 18,2 e 99,4 ± 18,3 mL/m rispettivamente). I livelli plasmatici di omocisteina aumentavano
progressivamente, con un trend lineare significativo
(p < 0,03), con il grado di compromissione retinica
(7,3 ± 3,0 vs 8,2 ± 2,6 vs 9,5 ± 2,6 mmol/L, rispettivamente nei pazienti senza retinopatia, con retinopatia non proliferante e con retinopatia proliferante). Il
Post hoc Duncan test indicava livelli significativamente (p < 0,05) più alti di omocisteina plasmatica a
digiuno nei pazienti con retinopatia proliferante
rispetto a quelli senza alcun segno di retinopatia
(fig. 3). Ancora una volta le concentrazioni di folato e
di vitamina B12 (fig. 4) non erano significativamente
differenti nei tre gruppi. Analogamente non si osservavano differenze nei tre gruppi per la creatininemia
(0,8 ± 0,1, 0,9 ± 0,1, 0,9 ± 0,2 mg/dL rispettivamente) e la clearance della creatinina (97,8 ± 16,2, 105,6
± 21,7, 90,6 ± 11,9 mg/min rispettivamente).
Le condizioni di retinopatia proliferante e di microalbuminuria erano largamente sovrapposte (in questo
studio il 50% dei pazienti con retinopatia proliferante
avevano anche microalbuminuria).
Nel tentativo di valutare la relazione dell’omocisteinemia con ognuna di queste condizioni separatamente, i livelli plasmatici di omocisteina sono stati
confrontati fra quei pazienti con microalbuminuria
ma senza retinopatia proliferante (n = 9) e quelli con
retinopatia proliferante ma senza microalbuminuria
(n = 5), i valori erano simili (8,9 ± 2,7 vs 8,8 ± 2,6
mmol/L) e per entrambi sostanzialmente più alti di
quelli dei pazienti privi di ogni segno di retinopatia o
microalbuminuria (6,9 ± 3,1 mmol/L). È anche interessante sottolineare che, sebbene il gruppo totale di
pazienti diabetici mostri livelli plasmatici di omocisteina a digiuno simili a quelli dei pazienti non diabetici, i pazienti diabetici non microalbuminurici e senza
retinopatia (né proliferativa né background) hanno
l’omocisteina plasmatica a digiuno significativamente più bassa dei controlli normoglicemici (6,9 ± 3,1 vs
9,3 ± 3,6 mol/L, p < 0,03).
Discussione
Questo studio esplora la relazione dei livelli plasmatici di omocisteina, e alcuni dei loro maggiori determi-
25
25
600
20
20
Folato
(nmol/L)
Folato
(nmol/L)
500
B12 (pmol/L)
400
300
200
100
15
15
10
10
5
5
0
0
0
Microalbuminuria
Sì
No
Fig. 2. Livelli di vitamina B12 e folato in pazienti diabetici di tipo 1 con o senza microalbuminuria.
12
Microalbuminuria
Microalbuminuria
Sì
No
Sì
No
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Omocisteinemia (µmol/L)
14
12
*
p < 0,03 per il trend
10
8
6
4
2
0
Assente
Non proliferante
Proliferante
* p < 0,05 vs retinopatia assente, Post hoc Duncan Test
Fig. 3. Livelli di omocisteinemia nei pazienti con diabete di tipo 1
in relazione al grado di retinopatia.
nanti, con il diabete di tipo 1 e le sue complicanze
microvascolari. Studi precedenti hanno prodotto
risultati discordanti riportando che i pazienti diabetici, sia di tipo 1 che di tipo 2, possono avere valori di
omocisteina più alti, più bassi o sovrapponibili rispetto a quelli dei soggetti non diabetici (11-17, 28).
Differenze nella funzione renale e nella presenza di
patologie concomitanti (per es. malattie cardiovascolari) nei vari campioni studiati possono in parte spiegare queste discrepanze. Diversamente da molti precedenti lavori, questo studio è stato condotto su di un
campione estremamente ben caratterizzato di
pazienti con diabete di tipo 1, così da permettere di
stabilire con chiarezza che questo tipo di diabete di
per sé non è associato a elevati livelli plasmatici di
omocisteina; un aumento delle concentrazioni di
omocisteina si osserva infatti solo in presenza di complicanze microvascolari (retinopatia e microalbuminuria), mentre i pazienti senza queste complicanze
hanno valori di omocisteina più bassi rispetto ai controlli non diabetici.
Un elegante lavoro dimostra una relazione diretta tra
filtrato glomerulare e livelli di omocisteina plasmatici
anche nel range normale di filtrazione glomerulare, e
suggerisce che i bassi livelli di omocisteina nei pazienti diabetici possono essere spiegati da una iperfiltrazione spesso presente nel diabete (29). Questa non
sembra una spiegazione plausibile nel nostro studio,
giacché i pazienti con microalbuminuria o retinopatia
proliferante non presentano livelli di filtrato glomerulare significamente diversi. Tuttavia occorre sottolineare che la filtrazione glomerulare nel nostro studio
è stata calcolata mediante la formula di Cockroft e
non misurata direttamente. Inoltre, in accordo con
altri lavori condotti in soggetti non diabetici (2, 8, 3032), i nostri risultati indicano che lo stato vitaminico ha
un ruolo importante come determinante della omocisteinemia anche nei diabetici. La dieta abitualmente
prescritta ai nostri pazienti copre abbondantemente il
fabbisogno giornaliero di acido folico e vitamina B12;
infatti i pazienti partecipanti allo studio hanno livelli
significativamente più alti di B12 e folato rispetto ai
controlli non diabetici, e ciò può a sua volta contribuire a regolare i livelli plasmatici dell’omocisteina.
Per quanto riguarda l’associazione dell’omocisteina
plasmatica con le complicanze microvascolari del diabete, la relazione microalbuminuria-iperomocisteinemia è stata riportata in molti, anche se non in tutti i
precedenti lavori, mentre la relazione con la retinopatia è molto meno studiata ed è più controversa (1118). A ogni modo i possibili meccanismi di queste
associazioni restano poco chiari. Questo studio stabilisce chiaramente una associazione della omocisteinemia sia con la microalbuminuria sia con la retinopatia, inoltre studia alcuni dei meccanismi più plausibili di quest’associazione. L’aumento dei livelli plasmatici di omocisteina osservati nei pazienti diabetici
con microalbuminuria o retinopatia diabetica proliferante non può essere spiegato dalla contemporanea
presenza di malattie cardiovascolari o insufficienza
renale – condizioni di per sé associate con un aumento dell’omocisteina plasmatica. Anche altri possibili
fattori confondenti quali età, sesso, fumo di sigaretta
sono stati esclusi, così come differenze nelle concentrazioni plasmatiche di vitamina B12, acido folico e
creatinina sierica; anche se non possiamo escludere
l’esistenza di lievi differenze nella filtrazione glomerulare non evidenziabili con l’uso della formula di
Cockroft. L’iperomocisteinemia è costantemente presente nei pazienti con insufficienza renale clinicamente evidente. Allo stadio di microalbuminuria non
c’è traccia di danno renale e la filtrazione glomerulare è spesso sopra la norma, nondimeno sono già presenti alterazioni morfologiche nel rene (33). Inoltre
un recente lavoro ha chiaramente stabilito una relazione tra il tasso di filtrazione glomerulare e l’omocisteina plasmatica in soggetti con normale funzione
renale (29). In contrasto con questi dati, l’esistenza di
un ruolo centrale del rene nel metabolismo e/o escrezione dell’omocisteina, basata essenzialmente sui
risultati di studi condotti su animali, è stata seriamente messa in discussione nell’uomo da uno studio
recente che non ha evidenziato nessuna differenza
tra la concentrazione di omocisteina nell’arteria e
nella vena renale in soggetti con normale funzione
renale (34). Quindi la relazione tra omocisteina e funzione renale è ancora estremamente poco chiara, e
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600
25
500
20
Folati (nmol/L)
B12 (pmol/L)
400
300
200
100
0
Assente
Non proliferante
15
10
5
0
Proliferante
Assente
Non proliferante
Proliferante
Fig. 4. Livelli di vitamina B12 e folati nei pazienti con diabete di tipo 1 in relazione al grado di retinopatia.
allo stato attuale delle conoscenze è verosimile ipotizzare che l’omocisteina giochi un ruolo come determinante delle lesioni vascolari del diabete, piuttosto che
essere secondaria alla microalbuminuria. Questa ipotesi è supportata da esperimenti in vitro che dimostrano come l’omocisteina danneggi selettivamente
cellule endoteliali in precedenza esposte a prodotti
avanzati della glicazione, suggerendo così un effetto
sinergico dell’iperglicemia e dell’omocisteina sull’endotelio vascolare (16).
Data l’impostazione trasversale dello studio, tuttavia
l’ipotesi alternativa che l’aumento dell’omocisteina plasmatica possa rappresentare una conseguenza, piuttosto che un determinante del danno tissutale, come
recentemente suggerito (35), non può essere trascurata.
I limiti di questo studio derivano principalmente dalle
piccole dimensioni del campione e dalla definizione
di microalbuminuria basata su un’unica misurazione,
entrambe queste condizioni possono mascherare
l’associazione e viziare l’interpretazione verso conclusioni negative piuttosto che positive. In ogni caso le
nostre osservazioni meritano ulteriori approfondimenti in quanto hanno importanti implicazioni nella
pratica clinica; infatti i livelli di omocisteina plasmatica possono essere controllati attraverso adeguati
interventi nutrizionali o supplementi di acido folico
(31). Quindi, i risultati di questo studio forniscono un
forte incentivo per trials d’intervento mirati a testare
se la riduzione dell’omocisteinemia contribuisca a
prevenire sia la micro- che la macroangiopatia nel
diabete di tipo 1.
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Corrispondenza a: Dott. Vincenzo Cuomo, Dipartimento di
Medicina Clinica e Sperimentale, Policlinico dell'Università di
Napoli Federico II, Via S. Pansini 5, 80131 Napoli
Pervenuto in Redazione il 15/09/2000 - Accettato per la pubblicazione il 30/10/2000
A questo lavoro è stato attribuito il 3° Premio Nazionale Roche
Giornale Italiano di Diabetologia e Metabolismo “Diabete, obesità e patologie metaboliche: dalla ricerca alla clinica”
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