“Il manuale WHO 2010 per l’esame del liquido seminale:luci e ombre”
Bologna 29 gennaio 2011
Tecniche di preparazione degli spermatozoi
Nilla Calza
U.O.Ginecologia e Fisiopatologia della Riproduzione Umana.
Azienda Ospedaliero Universitaria S.Orsola Malpighi di Bologna
Nella quinta edizione del manuale WHO la sezione dedicata alla preparazione spermatica è
stata espansa rispetto alla precedente e sono state descritti:
-tutti i metodi comunemente impiegati per preparare gli spermatozoi da eiaculato
-le modalità per maneggiare i campioni di seme infetti da HIV
-il trattamento degli spermatozoi ottenuti dal testicolo e dall’epididimo
-metodologie necessarie per raccogliere gli spermatozoi da pazienti con eiaculazione
retrograda
Le tecniche di preparazione degli spermatozoi possono essere finalizzate :
a test diagnostici di funzionalità
al recupero terapeutico per la tecniche di fecondazione assistita
Nello sperma umano si distingue:
COMPONENTE CELLULARE:
precursori della linea germinale, sottopopolazioni di spermatozoi vivi e apoptotici, detriti
cellulari, leucociti, cellule epiteliali
COMPONENTE LIQUIDA:
Plasma seminale costituito da proteine ,lipidi, prostaglandine, ormoni, ioni, acido citrico,
fruttosio, una grande varietà di enzimi tra cui anche enzimi proteolitici,, zinco, carnitina,
bicarbonati, muco
Le tecniche di trattamento dello sperma umano per la fecondazione assistita hanno lo scopo di:
1) Isolare il maggior numero di spermatozoi vivi, dotati di buona motilità progressiva e
morfologia , minimizzando lo stess ossidativo
2) Indurre in vitro la CAPACITAZIONE. Si tratta della fase finale di maturazione dello
spermatozoo che così: acquista la capacità di interagire con il complesso cumulo-ovocita,
subisce la reazione acrosomiale e diventa potenzialmente in grado di fecondare gli ovociti.
3) Separare gli spermatozoi dal plasma seminale perché:
- dopo l’eiaculazione diviene citotossico per un rapido aumento della osmolarità (Aitken et al.,
1996)
- contiene fattori decapacitanti (Yanagimachi,1994)
- contiene fattori la cui prolungata esposizione ha avversi effetti sulla funzionalità spermatica
quali la penetrazione
del muco cervicale (Kremer,1968) , la reazione acrosomiale in vitro e il
processo di fecondazione (Roger, 1983; Mortimer 1992 e 1998)
.
L’ideale tecnica di separazione spermatica dovrebbe :
-Essere facile, veloce e con costi contenuti;
-Isolare il più alto numero di spermatozoi mobili possibili;
-Non causare danno o alterazione fisiologica agli spermatozoi separati;
-Eliminare spermatozoi non vitali, leucociti e batteri;
-Permettere di processare il più grande volume di eiaculato
Nessun metodo disponibile soddisfa tutte queste esigenze, quindi la scelta della tecnica di
preparazione del seme è dettata dalla qualità del campione (Canale et al.1994)
INDICAZIONI GENERALI AL TRATTAMENTO
- La raccolta del campione e l’operatività devono avvenire in condizioni sterili.
- Medium di coltura impiegato deve contenere: soluzione salina addizionata con proteine
(albumina altamente purificata ) e un appropriato tampone per mantenere costanti le
condizioni di pH in cui gli spermatozoi sono processati
•Se l’incubatore contiene solo aria atmosferica alla temperatura di 37°C il medium è
tamponato con Hepes e il tappo del contenitore deve essere ben chiuso
•Se l’incubatore contiene 5% (v/v) di CO2 in aria ad una temperatura di 37°C il
medium deve essere tamponato con bicarbonato di sodio e il tappo del tubo
mantenuto semiaperto per garantire scambio di gas
- Come regola generale le tecniche di preparazione spermatica non possono essere
considerate valide per una totale eliminazione degli agenti infettivi quindi è indispensabile
trattare sempre il campione come potenzialmente infetto!!
L’efficienza della tecnica di separazione spermatica (WHO 2010) è espressa come:
- numero assoluto di spermatozoi
- numero totale di spermatozoi mobili
- recupero di spermatozoi mobili con morfologia normale.
FLUIDIFICAZIONE DEL CAMPIONE
Il campione subito dopo la raccolta viene lasciato fluidificare in vitro per 30 minuti a
temperatura ambiente o a 37°C in lenta agitazione.
Se non liquefa si procede con un ulteriore incubazione di 30 minuti nelle medesime
condizioni
Quando la viscosità del campione è persistente si può intervenire:
-miscelando il seme con ugual volume di terreno di coltura
-forzare il liquido viscoso attraverso un ago dal diametro interno di 0.84mm prima e di
0.69 mm poi, collegato ad una siringa.
-trattare con enzimi proteolitici. Il manuale propone di preparare una
soluzione 10 IU/ml di Bromelina in tampone fosfato “Dulbecco" da diluire 1:2 con il liquido
seminale e di incubare per 10 minuti a 37°C.
Altri enzimi descritti dalla letteratura sono: -amilasi -chimotripsima, lisozima, ialuronidasi, tripsina, (Figenschau et al., 1998).
E’ importante rimuovere gli enzimi con lavaggi non appena ottenuta la fluidificazione per evitare
danneggiamento degli spermatozoi
Si distinguono 4
approcci basici per la preparazione degli spermatozoi:
- lavaggio e diluizione
- migrazione: requisito fondamentale è il movimento autonomo degli spermatozoi (swim-up,
migrazione-sedimentazione)
- centrifugazione in gradiente di densità: sfrutta l’alta densità degli spermatozoi da separare e
l’azione di filtro esercitata dagli strati di particelle silice colloidale modificata impiegata per la
separazione
- metodi di aderenza: si basa sull’aderenza dei detriti cellulari e dei leucociti da eliminare ad una
matrice di filtrazione (fibre di lana di vetro, colonne di Sephadex, membrana, biglie di vetro).
DILUIZIONE e LAVAGGIO
Consiste nella diluizione del seme con il terreno di coltura e successiva centrifugazione; il
manuale WHO ne indica l’impiego per trattare campioni normospermici destinati alla
inseminazioni intrauterine (IUI).
Procedura:
-aggiungere all’intero campione un uguale volume di medium per la diluizione del plasma
seminale
-trasferire in tubi da centrifuga (non più di 3 ml per tubo)
-centrifugare a 300-500g per 5-10 minuti
-aspirare ed eliminare il surnatante
-risospendere con 1 ml di medium e pipettare gentilmente
-centrifugare ancora a 300-500g per 3-5 minuti
-aspirare ed eliminare il surnatante
-risospendere il pellet, pipettando gentilmente in un volume di medium appropriato per il
finale utilizzo e determinare motilità e concentrazione
SWIM-UP
Il manuale WHO ne consiglia l’impiego per il trattamento del seme di pazienti normospermici
Il campione non deve essere diluito e centrifugato.
Si procede direttamente con lo swim-up diretto degli spermatozoi dal seme dopo
fluidificazione in vitro
Procedura:
-Miscelare e suddividere il campione in tubi da centrifuga da 15 ml, ponendo circa 1 ml per
tubo.
-Stratificare delicatamente 1,2 ml di medium sopra il campione
-Inclinare il campione con un angolo di 45° e incubare per 1 ora a 37°C
-Rimuovere 1 ml di medium dalla superficie (contiene gli spermatozoi più mobili)
-Diluire con 1,5-2 ml di medium
-Centrifugare a 300-500g per 5 minuti ed eliminare il surnatante
-Risospendere il pellet in 0.5 ml di medium per valutare concentrazione,motilità, morfologia
Esempio di trattamento del seme con
Swim-up
Conta
Motilità
Morfologia
Conta
Motilità
Morfologia
Produzione del
campione
t
60 min
a 37°C
a 45
gradi
5 min
300 g-500g
s
S = seme
t = terreno
Aggiunta
di terreno
Raccolta dal
sovranatante
ICSI
FIVET
IUI
SWIM-UP
Vantaggi:
- Facile da eseguire
- Poco costoso
Svantaggi:
- Produce una resa in percentuale di spermatozoi mobili più bassa rispetto alla centrifugazione
in gradiente di densità ( Ng et al.,1992)
-Ristretto a campioni con alta conta e motilità;
-I numerosi strati di cellule impediscono agli spermatozoi mobili situati più in profondità di
raggiungere l’interfaccia con il medium di coltura;
-Significativo decremento della percentuale di spermatozoi con cromatina normalmente
condensata.
CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’ (CGD)
Il manuale WHO propone tale tecnica per i casi di oligozoospermia, astenozoospermia
o teratozoospermia, poiché si recupera un maggior numero di spermatozoi mobili destinati
alla FIVET o alla ICSI
Questo metodo consiste nel centrifugare il campione posto al di sopra di un gradiente di densità
discontinuo o continuo preparato impiegando silice colloidale legate covalentemente a silano.
Gli spermatozoi si separano in base alla loro densità e alla motilità di quella porzione che
raggiunge il fondo del tubo.
E’ importante standardizzare la metodica
I risultati delle preparazioni spermatiche variano in relazione alle condizioni della separazione:
- volume iniziale di seme,
- velocità e tempo di centrifugazione,
- numero di strati del gradiente
Procedura:
-Preparare il gradiente di densità sovrapponendo 1 ml di medium con densità al 40% (v/v) ad 1
ml di medium al 80% (v/v).
- Aggiungere 1 ml di seme miscelato sopra il gradiente di densità e centrifugare a 300-400g
per 15-30 minuti. Preparare più di un tubo se necessario.
-Rimuovere la parte superiore del pellet che si è stratificato sul fondo
-Risospendere il pellet in 5 ml di medium e centrifugare a 200g per 4-10 minuti
-Ripetere la procedura di lavaggio
-Risospendere il pellet finale in 1 ml di medium per determinare concentrazione e motilità
Esempio di trattamento del seme con
gradienti
Conta
Motilità
Morfologia
Produzione del
campione
S
40
80
Gradienti
15-30
min
300g
2
lavaggi
Conta
Motilità
Morfologia
ICSI
FIVET
IUI
Raccolta
dal 80%
Mantenere in
incubatore
CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’ (CGD)
Vantaggi:
-Isolamento di una frazione pulita e abbondante di spermatozoi mobili;
-Possono essere isolati spermatozoi mobili da eiaculati con bassa densità spermatica;
-Buona eliminazione dei leucociti;
-Produzione di ROS significativamente ridotta.
Svantaggi:
-La creazione di una buona interfase tra i differenti strati richiede tempo,
-Più costoso dello swim-up;
FILTRAZIONE CON FIBRE DI LANA DI VETRO
La separazione è principalmente dovuta all’adesione dei detriti cellulari e degli spermatozoi
immobili alla superficie di fibre di lana di vetro. (Engel et al., 2001)
Filtrazione condotta a 37°C
Richiede 5-10 minuti per filtrare 400-800l di campione
6 mm
(Engel et al., 2001):
L’efficienza di filtrazione è legata alle caratteristiche del filtro come ad esempio:
- Natura chimica della lana di vetro (borati, silicati, quarzo)
- Struttura superficiale e carica
- Spessore delle fibre e diametro dei pori
Da queste caratteristiche dipende anche il possibile rischio di danneggiare gli spermatozoi!!
Vantaggi:
- Semplicità
- Alta resa in spermatozoi mobili, analoga a quella ottenuta dalla CGD, anche applicata nei
casi di oligo ed astenozoospermia (Rhemrev et al., 1989; Johnson et al., 1996)
- Riduzione del danno ossidativo
- Eliminazione dei leucociti al 90% (Sanchez et al., 1997)
- Selezione di spermatozoi con normale condensazione della cromatina
Svantaggi:
- Costoso
- Filtrato può contenere detriti cellulari residui
- Processo abbastanza lento (favorita la resa!) e che richiede suddivisione del campione
Tecniche di preparazione di più recente introduzione per selezionare gli
spermatozoi ad alta qualità per la fecondazione assistita
-Selezione in base alla carica elettrica
-Selezione degli spermatozoi con tecniche di binding:
• Annessina
• Acido ialuronico
METODO ELETTROFORETICO
Si tratta di una filtrazione elettroforetica su membrana che rapidamente e efficacemente
isola spermatozoi umani con minimo danno al DNA (Ainsworth et al., 2005).
Principio: spermatozoi di migliore qualità nell’eiaculato possiedono la maggiore carica netta
negativa (Kirchoff and Schroter, 2001; Giuliani et al., 2004; Ainsworth et al. 2005) e possono
essere separati dalle altre particelle ugualmente cariche come leucociti e gameti immaturi in
virtù del loro piccole dimensioni della testa.
Dimostrato che gli spermatozoi così isolati sono ugualmente in grado di fecondare ovociti
senza il sostegno della ICSI quindi l’esposizione al campo elettrico non altera la loro
funzionalità. La % di clivaggio degli zigoti e la qualità degli embrioni sono analoghi a quelli dove
gli spermatozoi sono ottenuti da CGD (Fleming et al., 2008)
Prototipo sviluppato per questa tecnica: CELL-SORTER 10 (CS-10).
Catodo (-)
Campione
Tampone
Camera di iniezione del campione
Camera di raccolta del campione
(Ainsworth et al., 2005)
Anodo (+)
L’unità di separazione del CS-10 consiste in due camere da 400l separate da un filtro di
policarbonato di 5 m di spessore che appoggia su una membrana di poliacrilammide che
permette il libero transito degli elettroliti.
Spermatozoi separati dal plasma seminale a 25°C per 5 min applicando una corrente costante di
75mA e un voltaggio variabile da 18 a 21 V
Buffer elettroforetico: 10mM Hepes; 30mM NaCl; 0.2M saccarosio; pH 7.4; Osmolarità 310mOsm/Kg.
MACS (magnetic activated cell sorting)
Metodo di separazione che elimina gli spermatozoi apoptotici
Principio:
Le cellule apoptotiche espongono dei markers specifici. Uno di questi è il fosfolipide
fosfatidilserina (PS) che si ridistribuisce dal lato citosolico al lato esterno della membra
plasmatica
Si impiegano poi biglie magnetiche coniugate con annessina V che ha una forte affinità per
la fosfatidilserina esposta dalle cellule apoptotiche con integrità della membrana
compromessa. Il complesso biglia-cellula apoptotica è trattenuto grazie all’ausilio di un
magnete.
L’impiego di MACS in combinazione con centrifugazione in gradiente di densità (CGD) per
preparare spermatozoi umani è risultato essere superiore in termini di motilità, vitalità e resa
di spermatozoi non apoptotici rispetto ad altri metodi di preparazione (Said et al., 2005)
MACS
Biglie magnetiche
Spermatozoi apoptotici
Spermatozoi non apoptotici
(Said TM et al., 2008)
-Incubazione delle microbiglie coniugate ad annessina V con gli spermatozoi a RT per 15 minuti
- Far scorrere la miscela attraverso una colonna posta su un supporto magnetico.
La frazione di spematozoi che espone PS è ritenute nella colonna mentre gli spermatozoi con
membrana plasmatica intatta sono eluiti dalla colonna e raccolti come non apoptotici
PRESENZA DI RECETTORI PER L’ACIDO IALURONICO (HA)
L’acido ialuronico (HA) è un polisaccaride lineare presente nella matrice extracellulare del
cumulo ooforo attorno all’ovocita, con un importante ruolo nella fecondazione umana normale.
Principio di questo test : spermatozoo maturo ha subito un rimodellamento della membrana
plasmatica, responsabile della formazione dei recettori per la zona pellucida dell’ovocita e per
i recettori dell’HA
Spermatozoi maturi che esprimono recettori HA sono vitali e privi di inclusioni
citoplasmatiche,frammentazione del DNA, markers apoptotici come caspasi 3 (Cayli S. et al.,
2003, Huszar et al., 2003) e presentano una normale frequenza di aneuploidie cromosomiche
(Jakab et al. 2005).
(Petersen et al. 2010)
Incubazione di 2 µl di una preparazione di 2x106 spermatozoi per 10 minuti a RT
Per individuare gli spermatozoi maturi si sfrutta la loro selettiva capacità di legare HA che
aderisce sul fondo di una piastra di coltura.
Gli spermatozoi vengono poi raccolti con una pipetta da ICSI e trasferiti in una soluzione di
polivinlpirrolidone per eseguire la inseminazione intracitoplasmatica.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI DI SEME INFETTI DA HIV
I recettori virali (CD4, CCR5, CXCR4) sono espressi solo da cellule non spermatiche: il manuale
WHO propone una combinazione di centrifugazione in gradiente di densità e di swim-up per
prevenire l’infezione nelle coppie HIV sierodiscordanti dove solo il partner maschile è HIV
positivo (Gilling-Smith et al. 2006; Savasi et al 2007)
Per minimizzare il rischio di cross-contaminazione con i campioni HIV-free, i semi infetti
devono essere trattati separatamente nel tempo e nello spazio (Gilling-Smith et al. 2005)
Indispensabile la validazione virale mediante RT-PCR del seme processato.
Non ci sono ancora sufficienti evidenze di eliminazione del rischio di contagio attraverso la
preparazione spermatica!!!
TRATTAMENTO DEL CAMPIONE PROVENIENTE DA EIACULAZIONE
RETROGRADA
L’ eiaculazione retrograda si verifica quando il liquido seminale, durante l’eiaculazione, passa
nella vescica invece che nell’uretra.
Si tenta di recuperare lo sperma da un campione di urina post-eiaculatorio.
L’urina però induce rapidamente effetti deleteri sugli spermatozoi, con una riduzione della
motilità legata alla diminuzione di pH e ancor più, alla riduzione della osmolarità (Crich and
Jequier, 1978)
Per l’aggiustamento dei parametri urinari e il recupero di spermatozoi mobili è raccomandato
ingerire agenti alcalinizzanti come NaHCO3 (Urry, 1986) o una soluzione di NaCl e di
NaHCO3 (Aust et al., 2008).
Tuttavia non esiste un metodo ottimale per ottenere il controllo del pH ed dell’osmolarità
La procedura prevede di chiedere al paziente:
- di non svuotare completamente la vescica;
- tentare di produrre l’eiaculato e raccogliere l’eventuale prodotto in un primo contenitore
sterile;
- urinare nuovamente e raccogliere l’urina in un secondo contenitore con terreno di coltura
(per alcalinizzare ulteriormente il campione).
•
•
suddividere il campione e sottoporlo a centrifugazione per 8 minuti a 500g
risospendere il pellet in 3-4-ml di medium fresco
Sia l’eiaculato, se prodotto, che il campione di urina devono essere analizzati
Entrambe i campioni vengono processati con centrifugazione in gradiente di densità
(CGD)
Pazienti con disturbi eiaculatori che devono essere sottoposti ad una elettro-stimolazione
rettale della prostata, producono spermatozoi con scarsa motilità e quindi si trattano con la
CGD
EFFETTI DELLE SPECIE REATTIVE ALL’OSSIGENO (ROS)
Leucociti del plasma seminale(Aikten and West 1999 )
Produzione dei ROS
Forze associate con la centrifugazione durante il
trattamento del seme (Aitken and Clarkson 1988)
Nelle procedure di trattamento
anche finalizzato alla
crioconservazione, proposto di
non eliminare il plasma seminale
Trattamento del seme : perdita degli antiossidanti naturali presenti nel plasma
seminale (vitamina C ed E , superossido dismutasi (SOD), ac,urico, glutatione)
Spermatozoi vulnerabili
allo stress ossidativo
Danno
1) NO citoplasma = NO meccanismi di riparo del DNA danneggiato
2) Molti acidi grassi polinsaturi = suscettibilità ai ROS
Integrità del DNA compromessa (Aitken and Clarkson 1988)
Integrità delle membrane plasmatiche compromessa
Per limitare i danni ossidativi, proposto trattamento sia in vivo che in vitro
con differenti antiossidanti
Glutatione (-L-glutamil-L-cistenilglicina): agente ad effetto riducente dove il ruolo nella
difesa antiossidante è legato al gruppo sulfidrilico. Dimostrato il suo ruolo nel ridurre la
produzione di ROS e nel proteggere gli spermatozoi dal danno indotto al DNA da H2O2
(Donnelly,2000).
N-acetil-L-cisteina (NAC) è un N acetil derivato dell’aminoacido cisteina, che promuove la
produzione endogena di glutatione. Ha un effetto dose e tempo dipendente sulla riduzione
nella produzione dei ROS (Oeda 1997). E’ stata dimostrata è la sua azione benefica sui
parametri seminali e nel migliorare la capacità totale antiossidante del siero dopo
somministrazione orale in pazienti infertili (Ciftci H et al. 2009).
Ascorbato (vitamina C) e Alfa Tocoferolo (vitamina E): separatamente hanno benefici effetti
sulla integrità del DNA alterata dal processo di preparazione dello sperma con gradiente
(Hughes 1998). Non visto miglioramento nella motilità spermatica né con ascorbato né con
vitamina E ma solo una significativa riduzione nella produzione dei ROS. Rilevato invece danno
al DNA indotto dal simultaneo impiego delle due vitamine durante il trattamento del
campione(Donnelly,1999).
TRATTAMENTI DEGLI SPERMATOZOI IN VITRO PER MIGLIORARE LA
MOTILITA’
- Metilxantina caffeina : è un inibitore delle fosfodiesterasi che aumenta i livelli di cAMP. La
motilità di spermatozoi freschi e scongelati aumenta per stimolazione del metabolismo glucidico
(Homonnai et al.,1976; Rees et al.,1990).
- Pentossifillina: è un metilxantina derivato, inibitore non specifico delle fosfodiesterasi con
effetto stimolatorio sulla motilità attribuibile all’aumento di cAMP. cAMP stimola una chinasi
cAMP dipendente che induce la fosforilazione di proteine della coda degli spermatozoi (Nassar et
al.,1999).
Effetti benefici sulla motilità di spermatozoi freschi (Yovich et al.,1990;Tesarik et al.,1992; Paul
et al.,1995) e crioconservati (Stanic et al.,2002).
Risultati contrastanti perche riportati anche effetti tossici sugli spermatozoi (Centola et
al.,1995) e una possibile embriotossicità sull’embrione di topo (Tournaye et al., 1993)
- 2-Deossiadenosina (2-DA)
- Callicreina
- Bicarbonato
- Metallo Chelatori
-Platelet-Activating Factor (PAF)