Programma Triennale di Ricerca Agricola, Agroambientale,
Agroalimentare ed Agroindustriale della Regione Lazio
PRAL 2003-2005
U.O.: Dipartimento di Produzioni Animali
Università degli Studi della Tuscia
Relazione tecnico-scientifica
Programma di ricerca 2003/25
SVILUPPO DI LEGUMINOSE DA GRANELLA PER ALIMENTAZIONE
ZOOTECNICA DA INSERIRE IN AVVICENDAMENTI COLTURALI
ECOSOSTENIBILI NELL'ITALIA CENTRALE
Area tematica 8.1: Qualità della vita e gestione delle risorse del vivente
Azione chiave : 8.1 b Agricoltura sostenibile, pesca, foreste e sviluppo integrato delle
aree rurali, incluse aree di montagna
Responsabile dell’U.O.
Prof. Bruno Ronchi
I
INDICE
LISTA DELLE ABBREVIAZIONI ............................................................................................................................ III
1.
INTRODUZIONE E OBIETTIVI DELLA SPERIMENTAZIONE ....................................................... 1
1.1.
GENERALITÀ E CARATTERI NUTRIZIONALI DI DUE LEGUMINOSE TRADIZIONALI .................................... 3
1.1.1. Il cece (Cicer arietinum L.) ............................................................................................................. 3
1.1.2. Il lupino azzurro (Lupinus angustifolius L.) .................................................................................... 4
1.2.
PRINCIPALI FATTORI ANTINUTRIZIONALI E METODICHE ANALITICHE .................................................... 5
1.3.
OBIETTIVI DELLA SPERIMENTAZIONE .................................................................................................... 7
2.
MATERIALE E METODI.......................................................................................................................... 8
2.1.
2.2.
PRETRATTAMENTO DEI CAMPIONI DI CECE E LUPINO ............................................................................. 8
METODICHE ANALITICHE PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DEI COSTITUENTI CHIMICI DEGLI
ALIMENTI ............................................................................................................................................................. 9
2.3.
METODICA ANALITICA PER LA DETERMINAZIONE DEL PROFILO AMINOACIDICO .................................... 9
2.4.
METODICHE ANALITICHE PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DEI FATTORI ANTINUTRIZIONALI 13
2.5.
METODICA ANALITICA IN VITRO PER LA VALUTAZIONE DELLA FERMENTESCIBILITÀ .......................... 19
2.6.
ANALISI STATISTICA ........................................................................................................................... 19
3.
RISULTATI ............................................................................................................................................... 20
3.1 CECE ........................................................................................................................................................ 20
3.1.1
Costituzione chimica centesimale .................................................................................................. 20
3.1.2
Composizione aminoacidica delle proteine ................................................................................... 24
3.1.3
Contenuto in fattori antinutrizionali .............................................................................................. 26
3.1.4
Fermentescibilità ........................................................................................................................... 32
3.2 LUPINO AZZURRO..................................................................................................................................... 37
3.2.1
Costituzione chimica centesimale .................................................................................................. 37
3.2.2
Composizione aminoacidica delle proteine ................................................................................... 41
3.2.3
Contenuto in fattori antinutrizionali .............................................................................................. 43
3.2.4
Fermentescibilità ........................................................................................................................... 45
4
CONSIDERAZIONI FINALI E CONCLUSIONI .................................................................................. 50
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................................. 55
II
Lista delle abbreviazioni
ADF
Fibra al detergente acido/Acid Detergent Fiber
ADL
CEN/ASH
Lignina al detergente acido/Acid Detergent Lignin
Fibra al detergente neutro saggiata con amilasi e espressa sulle ceneri reside/Neutral detergent fibre assayed with a heat stable amylase and expressed exclusive of residual ash
Ceneri/Ash
dSO/OMd
Digeribilità della Sostanza Organica/Organic Matter Digestibility
EE
Estratto Etereo/Ether Extract
EI/NFE
Estrattivi inazotati/Nitrogen Free Extract
EL/GE
Energia Lorda/Gross Energy
EM/ME
Energia Metabolizzabile/Metabolizable Energy
FG/CF
Fibra Grezza/Crude Fiber
LOD
Limit of Detection
LOQ
Limit of Quantification
NDF
Fibra al detergente neutro/Neutral Detergent Fiber
PDI
Proteine digeribili intestinali/Intestinal digestible protein
PDIA
PG/CP
Proteine digeribili intestinali della dieta/Intestinal Digestible Protein of Dietary
PDIA+PDI della proteina microbica provenienti dalla sostanza organica fermentata/PDIA+PDI supplied by microbial protein from rumen-fermented organic matter
PDIA+PDI fornite dalle proteine microbiche dovute all’N degradato nel rumine/PDIA+PDI supplied by microbial protein from rumen-degraded protein
Proteina Grezza/Crude Protein
RDP
Proteine rumine degradabili/Rumen Degradable Protein
SS/DM
Sostanza Secca/Dry Matter
UDP
Proteine rumine indegradabili/Undegradable Rumen Protein
UFL
Unità Foraggera Latte/Feed Unit of Lactation
UFV
Unità Foraggera Carne/Feed Unit of Maintenance and Meat Production
aNDFom
PDIE
PDIN
III
1. INTRODUZIONE E OBIETTIVI DELLA SPERIMENTAZIONE
La nutrizione proteica degli animali di interesse zootecnico risulta di fondamentale importanza, non solo per il miglioramento della produttività e della redditività ma anche per limitare l’impatto
ambientale degli allevamenti.
I concentrati più frequentemente utilizzati in zootecnia, quali apportatori di proteina nella razione, sono i semi e i sottoprodotti di piante prevalentemente appartenenti alla Famiglia delle leguminose (soia, pisello e altre leguminose minori) e semi interi o sottoprodotti degli stessi di altre specie
botaniche. Tra i più usati cotone, girasole, lino, colza e derivati proteici di cereali, quali i vari tipi di
glutine.
L`impiego di diverse materie prime a livello di razione, avviene in funzione principalmente
dei seguenti parametri:
-
livello produttivo dell`animale;
-
fabbisogni proteici degli animali in funzione dello stato fisiologico;
-
quantità di proteina contenuta nei singoli alimenti;
-
quantità massima utilizzabile all`interno della razione di ogni singolo alimento;
-
valore biologico, ovvero qualità nutrizionale della proteina apportata dai singoli alimenti;
-
costo delle varie materie prime;
-
disponibilità aziendale delle varie materie prime;
-
facilità di reperimento, stoccaggio e conservabilità dei singoli alimenti.
Alla luce di quanto sopra esposto, le scelte attuabili a livello aziendale sono diverse e funzione
di una molteplicità di circostanze, per le quali è difficile indicare una soluzione univoca ottimale per
un corretto razionamento.
Prendendo, a titolo esemplificativo, i fabbisogni medi della bovina da latte durante la lattazione, generalmente riassumibili in un tenore in proteina greggia tra il 16 e il 18% della sostanza secca
della razione, sembra che l’assunzione di azoto (quindi di proteina) da parte dell’animale non sia generalmente influenzata dalla fonte delle proteine stesse. L`uso di fonti diverse o alternative non dovrebbe
pertanto generare problemi in allevamento (salvo inconvenienti dovuti alla presenza di fattori antinutrizionali o di sostanze indesiderate contenute negli stessi alimenti).
Un aumento del tenore proteico della razione sino a valori del 22% in proteina greggia, produce un incremento della produzione di latte (NRC, 2001). Va inoltre detto che la capacità d’ingestione
degli animali tende ad aumentare in dipendenza del tenore in proteine.
A queste considerazioni vanno contrapposte quelle di carattere economico legate al costo della
proteina e all’inquinamento ambientale, dovuto alla maggiore escrezione azotata. In aggiunta è stato
dimostrato come in diete correttamente bilanciate con buone capacità d’ingestione degli animali ed elevati standard qualitativi degli alimenti utilizzati, non si notano effetti negativi sulle produzioni di lat-
1
te con razioni anche a moderato (per non dire basso) contenuto in proteine (15% di PG nella razione)
(Groff e Wu, 2005). Nelle stesse il bilanciamento aminoacidico risulta importante.
Un`ulteriore considerazione va formulata rispetto alla degradabilità ruminale delle proteine;
essa è una caratteristica di ogni alimento e dipende dall’ammontare delle singole frazioni proteiche.
Processi tecnologici, quali l`applicazione di calore, tendono a aumentare la quota di proteina by-pass1
a livello ruminale, ma anche a rendere meno disponibili aminoacidi essenziali come la lisina, fenomeno indesiderato che determina un minor valore biologico della proteina metabolizzabile.
Per quanto concerne le proteaginose, la soia resta tutt’oggi la principale fonte di approvvigionamento nella forma di farina d`estrazione. Il profilo aminoacidico della soia è notoriamente ad elevato valore biologico, almeno rispetto a quello di altre fonti proteiche vegetali.
Sfruttando le capacità detossificanti del rumine, nei contronti dei fattori antinutrizionali, diversamente che per i monogastrici, sussiste la possibilità di impiego del seme non trattato termicamente.
In questo modo si viene a fornire anche una quota d`energia sotto forma di lipidi.
Altre forme in cui si può utilizzare la soia sono i fiocchi che, per il modesto trattamento termico subito, possiedono una buona quantità di proteina degradabile e la soia estrusa il cui trattamento
termico più intenso produce una maggiore quota di proteina by-pass.
In entrambi i casi occorre porre attenzione alla conservabilità, soprattutto in ordine alla frazione lipidica, che potrebbe essere suscettibile di fenomeni di irrancidimento. Questa problematica è invece molto più modesta a carico della farina d`estrazione che contiene un bassissimo tenore di lipidi.
Tra le altre proteaginose una buona fonte di proteina by-pass e di energia è indubbiamente il
cotone-seme. Possono anche essere utilizzati panelli o farine d`estrazione di lino, colza, girasole rispetto ai quali, trattandosi di semi frantumati sensibili all`ossidazione, occorre sempre porre grande
attenzione alla qualità della materia prima. Rispetto al tenore proteico, grandi differenze si notano prevalentemente in funzione dell`intensità del trattamento termico, che determina variazioni della degradabilità ruminale e della disponibilità di aminoacidi essenziali.
L’impiego di altre proteaginose (favino, pisello proteico, lenticchia, cicerchia, cece, lupino,
ecc.) nel razionamento animale, pur se oggetto di diverse trattazioni scientifiche e tecniche che ne dimostrano l’importanza, valutandone parametri nutrizionali, modalità di somministrazione e percentuali
di inclusione nella dieta per le diverse specie animali, ha trovato difficoltà di sviluppo principalmente
per la mancanza di quantitativi idonei ad una espansione di massa.
La necessità di reperimento di fonti proteiche alternative sorte per effetto della BSE e del timore di effetti non definiti dei prodotti transgenici (tra cui la soia, principale fonte di proteine per
l’industria mangimistica), ha tuttavia riattivato l’interesse per queste colture.
Tra le prospettive di rilancio delle leguminose da granella in Italia, si può annoverare, quindi,
la crescente richiesta da parte dei consumatori di carni biologiche, provenienti da allevamenti zootecnici condotti secondo precise prescrizioni tecniche. In tale nuovo contesto, l’alimentazione del bestia1
Proteine che passano intatte dalla distruzione microbica del rumine ed arrivano integre all’intestino, dove sono
assorbite ed utilizzate tali e quali dall’animale e non utilizzati dai batteri.
2
me assume importanza strategica, in quanto la normativa che regola il settore, a partire dal Regolamento CE 1804/1999 ed i successivi Decreti e Leggi di recepimento, prevedono l’utilizzo esclusivo di
erbe, mangimi e foraggi di provenienza aziendale o extraziendale ottenuti con le metodologie
dell’agricoltura biologica, vietando, parallelamente, il ricorso a fonti alimentari di origine animale.
Le leguminose, e le proteaginose da granella in particolare, sono quindi una importante fonte
di energia ed aminoacidi nelle diete utilizzate nell’alimentazione animale, in particolar modo per i
monogastrici (James et al., 2005). Tali alimenti sono caratterizzati, come ampiamente riportato nei capitoli successivi, da un notevole contenuto di proteine ma, parallelamente, la loro inclusione nella dieta può essere limitata dalla presenza di fattori antinutrizionali endogeni del seme, potenzialmente in
grado di produrre effetti biologici negativi negli animali.
Tuttavia alcuni lavori scientifici recenti dimostrano l’effetto positivo di alcune sostanze, considerate storicamente con antinutrizionali, sulla produttività degli animali di interesse zootecnico. È il
caso, ad esempio, dei tannini condensati (proantocianidine), metaboliti secondari dei vegetali, che per
la loro capacità di legare le proteine e renderle indisponibili per la nutrizione erano considerati per lo
più deleteri per le performances degli animali. Negli ultimi anni l’incremento delle conoscenze sui
processi digestivi dei ruminanti, ha permesso di considerare questi composti come benefici, soprattutto
nelle diete e/o pascoli ad elevato contenuto proteico e povere in fibra, sia per la loro azione di attenuazione della degradabilità delle proteine, sia per l’azione contro i parassiti gastro-intestinali e, non da
ultimo, la riduzione delle emissioni di metano dovuto alle fermentazioni ruminali (Waghorn, 2008).
1.1.
Generalità e caratteri nutrizionali di due leguminose tradizionali
1.1.1. Il cece (Cicer arietinum L.)
Note nutrizionali
Il cece è utilizzato in quasi tutte le parti del mondo sia per l’alimentazione umana sia animale;
il suo discreto valore nutrizionale è dovuto essenzialmente alla cospicua presenza di proteine (22%
circa) di vitamine del gruppo B (tiamina, riboflavina e niacina), amminoacidi essenziali (lisina in particolar modo – 1,32%) (Piccioni, 1979) e sali minerali (ferro, zinco e calcio) (Carnovale et al., 1987)
Assume un ruolo primario nella dieta alimentare di molti paesi in via di sviluppo rappresentando un valido sostituto della carne tanto da assumere, come altre leguminose, l’appellativo di “carne
dei poveri”. In generale si può affermare che il cece, insieme ad altri legumi, ha un’importante funzione di regolazione del metabolismo lipidico e glucidico, oltre che dell’attività gastro-intestinale, in funzione della presenza di carboidrati complessi (amido e fibra) oltre che di costituenti minori (Jenkins et
al., 1980; Crapo, 1985).
3
Interessante è il contenuto di lipidi, notevolmente più elevato di quello di altri legumi (fava,
pisello, fagiolo) nei quali si aggira intorno all’1-2 %, responsabili del caratteristico sapore e di alcune
sue caratteristiche tecnologiche (Carnovale et al., 1987).
Per quanto riguarda i carboidrati solubili, essi comprendono il saccarosio ed il glucosio, nonché gli zuccheri responsabili della flautolenza (raffinosio, stachiosio e verbascosio).
Il profilo aminoacidico è simile a quello caratteristico dei legumi, con un alto contenuto in lisina ed un basso contenuto in amminoacidi solforati, particolarmente adatto alla complementazione
con i cereali.
L’impiego del cece per l’alimentazione animale può assumere il ruolo di sostituto parziale degli altri alimenti proteici di origine vegetale (prima fra tutti la soia) (Hadjipanayiotou, 2002; Salgado et
al., 2001), sia per la sua importanza nutrizionale che per il basso costo di produzione (Clemente et al.,
1998). A fronte di un alto valore nutritivo dovuto all’elevata presenza di proteine, la digeribilità della
fibra e dell’amido del cece può risultare ridotta, in particolar modo nei monogastrici (Bengala-Freire et
al., 1991); la presenza inoltre di fattori antinutrizionali quali tannini, inibitori di proteasi, lectine, glicosidi cianogenici, saponine, ecc., può alterare/ridurre l’assorbimento di molti elementi nutritivi e/o
cagionare danni fisiologici diretti e indiretti agli animali. Questo argomento verrà affrontato in modo
più approfondito nei capitoli successivi.
Differenze abbastanza evidenti nella composizione chimica e nel valore nutrizionale, sono state rilevate tra le due principali linee (Desi e Kabuli) coltivate (Salgado et al., 2001).
1.1.2. Il lupino azzurro (Lupinus angustifolius L.)
Specie di lupino selvatico e parzialmente addomesticato vennero coltivate migliaia di anni fa,
sia nell’area del Mediterraneo, come testimoniano i ritrovamenti dei semi nelle tombe dei Faraoni, che
nelle zone andine del Sud America, prima del Regno Inca. La coltivazione del lupino fu praticata anche da Greci e Romani, come testimoniano le opere degli antichi scrittori, tra cui il poeta Virgilio (7019 DC) e Plinio il Vecchio (c. 23-79 AC). L’etimologia del nome si fa risalire al greco “sapore amaro”, in allusione al sapore dei semi, dovuto alla presenza di alcaloidi acri, sgradevoli e tossici, che venivano rimossi bollendo e mettendo a bagno ripetutamente i semi prima del loro consumo.
Fu non prima del 1900 che le originarie specie di lupino vennero sostituite da specie “dolci” a
basso contenuto di alcaloidi, grazie agli studi condotti da Reinhold von Sengbusch (1898-1986) che
mise a punto un metodo semplice e rapido per la selezione di vaste popolazioni di piante, sulla base
del contenuto di alcaloidi. Egli selezionò le prime cultivars di lupino giallo e azzurro a basso contenuto di alcaloidi fin dal 1928, partendo da mutanti delle specie amare. Fino ad allora il lupino amaro era
diffuso nell’Europa meridionale e nel Nord Africa; venne introdotto nell’Europa settentrionale nel
1781 quando Federico il Grande di Prussia inviò semi di lupino dall’Italia nel Nord della Germania,
4
per migliorarne la fertilità del suolo. Il lupino giallo venne ampiamente coltivato sul suolo sabbioso e
acido delle pianure costiere dei Balcani, dopo il 1860, e divenne importante anche nell’industria Sassone della lana Merinos, finché un avvelenamento da lupinosi (malattia causata dal fungo Phomopsis
leptostromiformis che attacca le parti verdi della pianta) causò la morte di numerose pecore.
Note nutrizionali
Il lupino, utilizzato principalmente come farina di semi, è anch’esso apprezzato per l’elevato
contenuto proteico (30 % di P.G.) e risulta in crescente espansione in Europa. Il problema principale
per l’alimentazione animale è l’alto contenuto in alcaloidi tossici (lupanina, sparteina, lupinina, isolupanina, angustifolina, L-17-idrossilupanina) (fino a 20 g/kg in alcune varietà amare) e il rivestimento
eccessivamente fibroso del seme che ha effetti negativi sulla digeribilità, specialmente nei monogastrici. La farina può avere un contenuto in EM di 11,5 MJ/kg s.s. per i polli e di 13,2 MJ/Kg s.s. per i ruminanti; il contenuto in energia digeribile per i suini risulta pari a 17,3 MJ/Kg di s.s. (McDonald et al.,
1992). Il contenuto in aminoacidi non è molto equilibrato e le diete che contengono notevoli quantità
di queste farine possono essere carenti in metionina, che ne rappresenta il primo aminoacido limitante,
seguita da cistina, valina e triptofano. La massima quantità di inclusione nella dieta per ruminanti è di
15 kg per 100 kg di razione, mentre nei mangimi per polli e suini la farina di lupini può essere impiegata in ragione di 10 kg/100 kg di razione e di 50 kg /100 kg di razione per i giovani suinetti ed i broilers. Inoltre a causa della rapida ossidazione dei grassi che contengono, le farine devono essere utilizzate immediatamente o protette da antiossidanti (McDonald et al, 1992).
1.2. Principali fattori antinutrizionali e metodiche analitiche
Decisivo, per la qualità nutrizionale dei legumi, risulta il contenuto in fattori antinutrizionali,
sostanze che così come tali o attraverso loro metaboliti, interferiscono con l'utilizzazione degli alimenti, influenzando la salute e, nel settore zootecnico, la produzione animale. Una prima distinzione può
permettere di suddividere i fattori antinutrizionali in intrinseci all'alimento ed in acquisiti. I primi si
riferiscono a molecole naturalmente presenti negli alimenti e sotto controllo genetico; i secondi sono
acquisiti dall'alimento dall'ambiente, sia pure più o meno favoriti da una naturale predisposizione. Gli
antinutrizionali possono essere classificati in quattro gruppi (De Lange et al., 2000):
-
fattori che influenzano l'utilizzazione e la digestione delle proteine: tannini, inibitori
delle proteasi, lectine e saponine;
-
fattori hanno effetti negativi sulla digestione dei carboidrati (inibitori dell’amilosio,
composti polifenolici, fattori responsabili della flautolenza);
-
fattori che influenzano l'utilizzazione dei minerali: fitati, ossalati, glucosinolati;
-
antivitaminici;
-
fattori che stimolano la risposta immunitaria (proteine antigeniche)
5
-
fattori con attività varia: micotossine, mimosine, cianogeni, nitrati, alcaloidi, agenti
fotosensibilizzanti, fitoestrogeni.
Come rilevato da diversi studiosi la presenza di fattori antinutrizionali nei diversi alimenti è
estremamente varia, anche all’interno di una stessa varietà (Huisman e Tolman, 1992; Jansman, 1993;
Bell, 1993). La tabella seguente (Tab. 1) riassume i principali effetti sui monogastrici dei fattori antinutrizionali elencati in precedenza, con una panoramica generale sugli altri antinutrizionali che possono creare problemi alla produzione animale (De Lange et al., 2000).
Tab. 1 - Principali effetti dei fattori antinutrizionali sui monogastrici in vivo
Fattore antinutrizionale
Effetto (in vivo)
- Precipitazione di minerali e proteine
Acido Fitico
- Riduzione dell’assorbimento di minerali
- Ipocalcemia
Acido Ossalico
- Gastroenteriti
- Danni renali
- Disturbi neurologici
Alcaloidi
- Riduzione dell’appetibilità
Fattori della flautolenza
- Disagio gastrointestinale
- Alterazione dell’attività tiroidea (gozzo e cretinismo)
Glicosidi cianogenici
- Interazione con il ciclo del selenio
- Gozzo, soppressione della produzione di T3 e T4
Glucosinolati
- Lesioni nel fegato e nei reni
- Anemia dovuta alla precipitazione del Ferro
Gossipolo
- Riduzione del peso delle uova
- Precipitazione con l’amilasi dei secreti salivari e pancreatici
Inibitori dell’alfa-amilasi
- Riduzione della disponibilità di amido
- Riduzione dell’attività della (chimo-) tripsina
Inibitori delle proteasi (tripsina e chimo- Ipertrofia del pancreas
tripsina)
- Decremento della digestione
- Danneggiamento della parete intestinale
- Reazioni immunologiche
Lectine
- Alterazione dell’assorbimento dei nutrienti
- Incremento della sintesi delle proteine delle mucose
- Tossicità metabolica
- Danneggiamento della parete intestinale
Proteine antigeniche
- Risposta immunitaria
- Emolisi
Saponine
- Permeabilità intestinale
Sinapine
- Odore di pesce nelle uova
- Precipitazione con enzimi e proteine alimentari
Tannini e composti polifenolici
- Riduzione della digeribilità proteica
- Anemia emolitica
Vicina/Convicina
- Interferenza con la fertilità e covabilità delle uova
6
1.3. Obiettivi della sperimentazione
Con il presente studio sono stati sottoposti a prove e valutazioni di laboratorio due varietà di
cece e un qualificato gruppo di genotipi di lupino azzurro identificati dalle altre UU.OO., determinandone la composizione chimica centesimale, il profilo aminoacidico delle proteine ed i principali fattori
antinutrizionali eventualmente presenti nelle relative granelle.
Tale studio aveva la finalità di fornire indicazioni per selezionare le linee genetiche più meritevoli di maggiori approfondimenti in ambito agronomico e zootecnico, nonché al fine di determinare
l’optimum di inclusione nella dieta dei ruminanti.
A questo proposito è utile notare che lo stato delle conoscenze sulle proprietà nutrizionali di
queste proteaginose, soprattutto in ambito zootecnico, appaiono frammentarie, soprattutto se messe in
relazione con il possibile effetto antinutrizionale di alcuni composti presenti nei semi. Ancor più lacunose appaiono le metodiche analitiche messe a punto per la loro determinazione, soprattutto per quel
che riguarda tannini e lectine (De Lange et al., 2000).
Il presente studio si propone quali obiettivi:
a) la determinazione della composizione chimica centesimale (umidità, sostanza secca,
proteina grezza, estratto etereo, fibra grezza, frazioni della fibra secondo Van Soest NDF, ADF, ADL e ceneri);
b) la valutazione della composizione aminoacidica delle proteine;
c) la determinazione dei principali fattori antinutrizionali (glicosidi cianogenici, inibitori
della tripsina, tannini totali e condensati). Inoltre sono stati determinati fitati e αgalattosidi, non previsti dal programma di ricerca finanziato.
d) prove in vitro per la valutazione della fermentescibilità ruminale.
I dati analitici ottenuti sono stati confrontati mediante test statistici per individuare differenze
tra le specie/linee genetiche, epoche e densità di semina, al fine di discriminare le condizioni ottimali
di coltivazione.
7
2. MATERIALE E METODI
La sperimentazione, condotta in collaborazione con le altre U.O. coinvolte nel progetto, ha riguardato la quantificazione delle componenti nutrizionali ed antinutrizionali di granelle di due varietà
di cece e alcune linee genetiche di lupino azzurro derivanti dalla sperimentazione condotta dall’U.O. 1
(Dipartimento Biotecnologie, Agroindustria e Protezione della Salute – ENEA C.R. Casaccia) e
dall’U.O. 2 (Dipartimento di Produzione Vegetale, Università degli Studi della Tuscia – Viterbo),
nonché la valutazione della degradabilità, della digeribilità e della fermentescibilità tramite prove in
vitro.
Le prove agronomiche, meglio descritte nella relazione del’U.O. 2, hanno previsto 3 epoche
nel 2007 e nel 2008 (Dicembre, Gennaio e Marzo, rispettivamente denominate di seguito E1, E2 ed
E3) e 4 densità di semina nel 2008 (40 piante/m2, 55 piante/m2, 70 piante/m2 e 85 piante/m2, rispettivamente denominate di seguito D1, D2, D3 e D4). Per eventi meteorici avversi il raccolto dell’epoca
di semina E2 del 2008 è andato perduto.
In una prima fase di screening e messa a punto delle metodiche sono stati utilizzati semi di due
varietà di cece (Pascià e Sultano) fornite dall’U.O. 2 (Dipartimento di Produzione Vegetale – Università degli Studi della Tuscia) e semi di 12 accessioni di lupino (20A, 18, 12A, 17B, 26A, 30A, 32A,
43A, 48A, 4A, 65-3, 50A) fornite dall’U.O. 1 (Dipartimento Biotecnologie, Agroindustria e Protezione della Salute – ENEA C.R. Casaccia) frutto di un precedente programma di miglioramento genetico
diretto dall’ENEA (Bozzini, 1997), con l'obiettivo di introgressione di caratteri di domesticazione (fiore bianco, portamento determinato e indeterminato, semi dolci, precocità, resa elevata, indeiscenza del
baccello e ridotto contenuto di alcaloidi) provenienti da varietà non autoctone in popolazione autoctone del Centro Italia.
Nella successiva fase sono stati analizzati semi di cece e lupino provenienti dalle coltivazione
delle annate agrarie 2006-2007 e 2007-2008.
2.1. Pretrattamento dei campioni di cece e lupino
Ai campioni è stata assegnata una codifica alfanumerica progressiva corrispondente alle differenti specie, varietà e condizioni di prova colturale.
Una parte del campione (150 g) è stato essiccato in stufa ventilata alla temperatura di 65° C fino a peso costante e successivamente macinato utilizzando un mulino a ciclone Cyclotec 1093 Sample
Mill (TECATOR; Hoganas, Sweden), equipaggiato con griglia da 1 mm, avendo cura di pulire accuratamente l’apparecchiatura dopo ogni macinazione al fine di minimizzare eventuale contaminazioni tra
i campioni (AOAC 950.02, 2000)
La restante aliquota non è stata né essiccata né macinata in quanto alcune metodiche analitiche
prevedono la macinazione in umido o poco prima della processazione.
8
2.2. Metodiche analitiche per la determinazione quantitativa dei
costituenti chimici degli alimenti
Sui singoli campioni sono state eseguite le analisi chimiche secondo quanto previsto dalle metodiche ASPA (Martillotti, 1987), adottando lo schema classico “Weende” per le determinazioni analitiche secondo cui la composizione chimica di un alimento è riconducibile a quella descritta nella tabella che segue (Tab. 2):
Tab. 2: Schema Weende per la determinazione quantitativa dei costituenti chimici degli alimenti
Tipo analisi
Componenti chimici (significato)
Umidità
Acqua, eventuali composti volatili
Sostanza Secca
(gravimetria)
Residuo dopo essiccazione a 65° fino a p.c.
Proteina Grezza
(Metodo Kijeldal)
Proteine, aminoacidi, ammine, ammidi glicosidi azotati, alcune vitamine
del complesso B, acidi nucleici, urea, sali d’ammonio
Estratto Etereo
(Soxlet)
Grassi, oli, cere, pigmenti vegetali, steroidi, vitamine liposolubili
Fibra Grezza
(Metodo Weende)
Frazioni della fibra
secondo Van Soest
(NDF, ADF, ADL)
Ceneri (combustione)
Cellulosa, emicellulose, lignina
Parte della cellulosa, delle emicellulose, della lignina, zuccheri semplici,
amidi, pectine, acidi inorganici, resine, tannini, alcune vitamine idrosolubili
Sali ed ossidi di elementi inorganici
2.3. Metodica analitica per la determinazione del profilo aminoacidico
Il metodo adottato si basa sul processo di derivatizzazione degli aminoacidi liberi mediante il
carbamato eterociclico AQC2 proposto da Cohen & Michaud (1993). L’agente derivatizzante AQC è
in grado di convertire sia gli aminoacidi primari che secondari in derivati ureici stabili ed altamente
fluorescenti a 395 nm. La reazione di derivatizzazione porta alla presenza di 6-aminoquinoline che,
tuttavia, non crea significative interferenze con l’eluizione dei derivati in HPLC.
Il metodo ha trovato interessanti applicazioni per l’analisi degli alimenti in grani (Cohen & De
Antonis, 1994) ed in alimenti complessi ad uso zootecnico (Liu et al., 1995). Al fine di ottenere condizioni standard di analisi a beneficio della ripetibilità e/o riproducibilità delle determinazioni, si preferisce impiegare i reagenti e la colonna HPLC resi disponibili in kit da Waters (Waters Corporation,
USA).
2
6-aminoquinolyl-N-hydrossisuccinimidyl carbamate
9
La procedura di derivatizzazione pre-colonna con ACQ, prevede che il campione sia completamente idrolizzato così da consentire l’attacco dell’agente derivatizzante direttamente sui residui aminoacidici liberi. Per tale motivo il primo passaggio di trattamento del campione consiste nella macinazione fine (blending a secco per 5 min’ oppure mediante mulino a martelli attrezzato con griglia da
1 mm) e successivamente viene trattato per idrolisi acida. Nel dettaglio, a 100 ± 5 mg di campione
macinato posti in un tubo pirex della capacità di 10 ml precedentemente pirolizzato a 400°C per 4 h,
sono aggiunti 5 ml di HCl 6N. Dal tubo viene evacuata l’aria previo flussaggio con azoto puro (Rivoira, Italy) per 60 secondi, velocemente sigillato mediante tappo a vite con guarnizione in teflon e quindi
posto in stufa termostata a 112 – 116 °C per 24 ore. Dopo il trattamento termico, i campioni idrolizzati
vengono lasciati raffreddare a temperatura ambiente. Il digerito viene centrifugato a 1500 g ed
un’aliquota del surnatante viene diluita con acqua ultrapura3 nel rapporto 1:50.
La reazione di derivatizzazione viene condotta in ambiente basico. Le prove effettuate da Cohen & Michaud (1993) indicano che le condizioni ottimali si ottengono impiegando un tampone borato
a pH 8,8 mantenendo un rapporto volumico tampone/campione pari a 4:1. Nella fattispecie il rapporto
è stato ulteriormente alzato aggiungendo a 70 µl di tampone borato 10 µl di campione diluito.
Quindi vengono aggiunti alla reazione 20 μl del derivatizzante (10 mM ACQ in MetCN equivalenti a ca. 3,0 mgACQ/ml in MetCN anidro). Per velocizzare la derivatizzazione della Tyr è necessario riscaldare a 55°C in bagnetto termostatato. Dopo un tempo d’incubazione di 10 min’ 10 µl di
campione sono iniettati nel sistema HPLC descritto nel seguito.
Il sistema HPLC impiegato per l’analisi aminoacidica, è stato così composto e settato:

Degasatore: Thermo Finnigan Vacuum Degaser

Pompa: ThermoFinnigan Spectrasystem P4000, quaternaria per la formazione di gradienti

Colonna separativa: Waters AccQ●Tag Amino Acid Analysis Column, C18 Silica Based, 150
mm (L) x 3,9 mm (ID), 4 μm4

Solventi: H2O, MetCN e Tampone “A”5 diluito 1:6.

Detector UV: ThermoFinnigan Spectrasystem UV6000, λ=254 nm

Autocampionatore e settaggi tray/forno: ThermoFinnigan Spectrasystem AS3000, Ttray = 0°C;
Toven = 37°C

Software di gestione e calcolo: ChromQuest 3.0

Filtro precolonna: 0,2 μm

Loop di caricamento da 20 μl
3
ASTM Type I, resistività specifica pari a 18,2 Mcm
Cod WAT052885 - Waters Corporation, MA, USA
5
Kit Waters, cod. WAR052890
4
10

Programmazione del gradiente:
Tempo (min)
0
0,5
18
19
28
35
38
47
H2O% MetCN%
0
0
0
1
0
5
0
9
0
17
40
60
0
0
0
0
Tampone A%
100
99
95
91
83
0
100
100
Flusso (ml/min’)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Tipo grad.
Step finale
Lineare
Lineare
Lineare
Step finale
Step finale
-
Per l’identificazione univoca dei diversi aminoacidi presenti nei campioni di leguminose pretrattati, si ricorre all’impiego di Stock Solution per singolo amminoacido in purezza (>99%) (Sigma,
USA) alla concentrazione nominale di 100 μmol/ml in HCl 0,1 M. Nella sottostante Tabella 3 si riportano i quantitativi dei singoli aminoacidi da pesare al decimo di mg con bilancia analitica Mettler AE200 (Mettler-Toledo, Italy) e risospendere in HCl 0,1 M per ottenere la concentrazione standardizzata a 100 μmol/ml.
Tab. 3 – Tabella riepilogativa della preparazione degli standard aminoacidici in purezza
(Stock Solution)
AMINOACIDO
Alanine
Arginine
Asparagine
Aspartic acid
Cysteine
Glutamic acid
Glutamine
Glycine
Histidine
Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine
Phenilalanine
Proline
Serine
Threonine
Tryptophan
Tyrosine
Valine
SIGLA COD MW
ALA
ARG
ASN
ASP
CYS
GLU
GLN
GLY
HIS
ILE
LEU
LYS
MET
PHE
PRO
SER
THR
TRP
TYR
VAL
A
R
N
D
C
E
Q
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
89
174
132
133
121
147
146
75
155
131
131
146
149
165
115
105
119
204
181
117
CONC μmol/ml
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
V ml M (mg)
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
89,0
174,0
132,0
133,0
121,0
147,0
146,0
75,0
155,0
131,0
131,0
146,0
149,0
165,0
115,0
105,0
119,0
204,0
181,0
117,0
Nelle Figg. 1 e 2 si riportano, a titolo d’esempio, i cromatogrammi relativi alla miscela standard di amminoacidi e cece con identificazione dei picchi cromatografici.
11
8,3
6,3
32,8
3292567
30,1
3146133
4,2
30,9
5,3
31,5
5146617
5,0
PHE
ILE
mAU
114656
44,2
28959
84111
38,5
TRP
0,2
38,9
8485 39,4
0,1
0,0
36,9
37,7
728998
384269
8,4
26,3
0,2
0,0
TYR
5219503
0,0
0,6
1,2
0,0
LYS
VAL
2611689
MET
3012745
CYS
3939484
27,4
3451942
PRO
ALA
0,4
LEU
26,0
5,2
23,3
5,6
5,7
21,2
3262353
3,4
21,9
3541908
3511305
20,6
ARG 2134787
THR
1,4
0,6
18,3
1,2
NH3
GLU
0,8
889009
HYS
SER
747501
1733807
1595406
ASP
2,6
136772211,4
0,2
AMQ
1626990
mAU
0,4
12,8
3108749 2,2
0,6
17,3
14,3
5,0
14,8
3358878
2,6
15,6 4310119
2,8 16,1
5,4
16,6
GLY
6,9
0,8
5,5
P4000 - Solvent: MetCN
4,8 27,9
UV6000-254nm
Name
Area
Retention Time
Area Percent
-0,2
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
22,5
-0,2
25,0
27,5
30,0
32,5
35,0
37,5
40,0
42,5
45,0
Minutes
Fig. 1 – Cromatogramma di una miscela standard di aminoacidi (V inj. 5 μl)
UV6000-254nm
5
10
30,1
632191
4,5
m AU
PH E
359585
32,8
31,0
328735
0,4
0,3
M ET
27,9
21217
0,00
29,2
26,1
26697
4,6
504521
326604
0,7 TYR 1,6
27,4
26,3
C YS
115374
ILE
31,5 5,0
VA L
LEU
4,6
7,1
PR O
23,3
517221
8,2
NH3
RG
A402662
7,2
TH R
4,3
21,9
318422
A LA
306352
20,7
21,2
47683
0,02
-0,02
14,8
-0,04
0,04
945956
12,8
676331
AMQ
-0,02
A SP 13,3
9,5
0,00
44090
21,5
0,6
21618
22,7
0,3
16,6
(H YS)
9,3
(SER )
17479
0,02
0,08
0,06
151176
0,2
m AU
0,04
18,3
14,3
383283
404698
0,06
16,1
GLU
5,4
GLY
2,1 583068
5,7
5,6
Retention Time
Area
Name
Area Percent
LYS
8,9
1a.dat
0,08
-0,04
15
20
25
30
35
40
45
Minutes
Fig. 2 – Cromatogramma di una campione idrolizzato si seme di cece
La risposta strumentale per singolo componente è dedotta dall’analisi di mix standard commerciali (miscela amminoacidi 100 pmol/µl per ognuno eccetto cisteina a 50 pmol/µl in HCl 0,1 M;
Waters Corporation, USA). Per ogni aminoacido rivelato dal detector durante la corsa cromatografica,
la concentrazione viene stimata confrontando l’area del picco con apposite curve di calibrazione nel
range 10-100 pmol/μl (eccetto cisteina: 5-50 pmol/μl).
12
2.4. Metodiche analitiche per la determinazione quantitativa dei fattori antinutrizionali
2.4.1
Glicosidi cianogenici
Per la determinazione del contenuto in glicosidi cianogenici sono state utilizzate alcune delle
metodiche analitiche più diffuse; una metodica semi-quantitativa che permette un primo screening del
contenuto di cianogeni (Aikman et al, 1996) una che prevede l’idrolisi acida (Bradbury et al., 1991;
Egan et al., 1998; Haque e Bradbury, 2002), una l’idrolisi enzimatica (Nambisan e Sundaresan, 1984;
Kobaisy et al., 1996), e l’idrolisi alcalina (Onwuka G. I., 2006; AOAC, 1990).
Screening del contenuto di cianogeni
Al fine di testare in via preventiva i campioni di cece e lupino per la presenza di glicosidi cianogenici e del relativo enzima endogeno è stata utilizzata la metodica di Aikman et al. (1996), già elaborata da Feigl e Anger (1966), e utilizzata da Tantisewie et al. (1969) e da Brinker e Seigler (1989),
che permette una determinazione semiquantitativa per via colorimetrica. La metodica originale è stata
adattata alle condizioni operative di laboratorio e prevede l’uso di uno standard esterno come controllo, l’amigdalina6, glicoside contenuto nei semi di diverse Rosacee ed in quelli di mandorle amare in
grado di liberare acido cianidrico in presenza dell’enzima β-glucosidasi o di acido solforico.
Il protocollo operativo prevede la preparazione di dischi di carta da filtro (Whatman n° 1) di 1
cm di diametro imbibiti con una soluzione di 10 mg di Copper ethylacetoacetate7 e 4-4’methylenebis(N,N’-dimethylaniline)8 in 4 ml di tricloroetano (cloroformio)9 e di uno standard esterno
di controllo costituito da 10 mg/g di amigdalina (0,02 g amigdalina + 1,98 mg campione).
In 4 provette da 3 ml è posto 1 g di campione finemente macinato diluito 0, 2, 4, e 6 volte con
una farina in cui sono certamente assenti glicosidi cianogenici. In altre 4 provette lo standard diluito
10, 20, 40 e 80 volte (1, 0,5, 0,25, 0,125 mg/g). Si inumidisce con 1,5 ml di acqua distillata e 1 goccia
di antibiotico.
Al tutto, si pone immediatamente sopra il disco di carta da filtro imbibita facendo attenzione a
non toccare il campione, si sigilla con parafilm e si introduce in stufa termostatata a 20°C per 24 ore.
La lettura del colore blu della carta da filtro è effettuata tramite un programma di image tool
(UTHSCSA) che analizza l’intensità di colore, previa scansione dei dischetti (Fig. 3)
6
Amygdalin, BioChemika, ≥97.0% (HPLC) (Fluka)
Ethyl acetoacetate, copper derivative (Aldrich)
8
4,4′-Methylenebis(N,N-dimethylaniline), 98% (Aldrich)
9
Chloroform , ≥99%, contains amylenes as sTabilizer (Sigma-Aldrich)
7
13
Fig. 3: scansione dei discetti colorati dopo la reazione. A sinistra due campioni di lupino e a destra lo standard esterno (amigdalina)
Dalla comparazione dei dischetti relativi ai campioni con quelli dello standard è stato possibile
definire aemi-quantitativamente il contentuto di cianogeni nei semi di lupino azzurro e cece.
Metodo dell’idrolisi acida
Tale metodica prevede una fase di estrazione, una fase di digestione in ambiente acido ed una
fase di lettura spettrofotometrica (Bradbury et al., 1991; Egan et al., 1998; Haque e Bradbury, 2002)
Operativamente, 2 g di campione macinato sono estratti per shaking con 6 ml di H3PO410 0,1
M per 10 minuti. La miscela è filtrata con un filtro Whatman® No 111 e lavata due volte con H3PO4
0,1 M oppure posta a + 4 °C per un eventuale stoccaggio (12 ore – uno stoccaggio fino ad un mese ha
prodotto un aumento di HCN libero, ma non di quello totale). Il filtrato è portato a 100 ml con H 3PO4
0,1 M.
A 2 ml di estratto vengono addizionati 2 ml di H2SO412 4 M in una provetta di vetro con tappo,
riscaldata in acqua bollente per 50 minuti e successivamente raffreddata (possibilità di stoccaggio 12
ore a 4 °C).Si aggiunge 5 ml di NaOH13 3,6 M e si agita (potrebbe essere necessaria una filtrazione).
Attendere la decomposizione dell’acetone cianoidrina in cianuro (5-10 min.). Preparare provette (in
doppio) da 10 ml contenenti 7 ml di buffer fosfato (PBS)14 (pH 6) 0,2 M ed aggiungerci 1 ml di campione. In una aggiungere 2 ml di acqua (da usare come bianco) e nell’altra aggiungere 0,4 ml di soluzione di cloramina-T15 (5 g di cloramina T ogni litro di acqua). Porre in ghiaccio per 5 min. Aggiunge-
10
Phosphoric acid, puriss., ≥99% (Riedel-de Haën)
Filter papers circles, 110 mm, Whatman ®, Schleicher & Schuell GmbH
12
Acido solforico, Carlo Erba Reagenti, > 98%
13
Sodium hydroxide, Ultra:  98.0% (T), BioChemika – Fluka Chemie GmbH
14
Phosphate Buffered Saline, Sigma Chemie GmbH
15
Chloramine T hydrate, Sigma Chemie GmbH
11
14
re 1,6 ml di soluzione di piridina16/acido barbiturico17 (40 ml di pyridina a 1 g di acido barbiturico e
dissolto in 200 ml di acqua). Attendere 60-90 minuti e leggere a 583 nm contro il bianco.
Gli autori citati hanno impiegato per la calibrazione cianuro di potassio (KCN) ma data la pericolosità di questo sale e le vigenti norme di sicurezza in Italia, risulta difficoltoso e costoso utilizzare
tale standard. Al fine di superare tale problema si è utilizzato una soluzione standard per la calibrazione di elettrodi sensibili al cianuro di Zn(CN)2, KCN e H2O della Fluka18 alla concentrazione di 0.998
g/l19 di CN-. La curva di calibrazione è costruita nel range di concentrazione 0.1 – 4.0 µg CN-/ml (4, 2,
1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 µg CN-/ml).
Metodo dell’idrolisi enzimatica
Tale metodica prevede una fase di estrazione, una fase di idrolisi enzimatica ed una fase di lettura spettrofotometrica (Nambisan e Sundaresan, 1984; Kobaisy et al., 1996). Essa consiste nel centrifugare per 10 min a 4.000 rpm l’estratto ottenuto con la modalità già descritta nella precedente metodica, raccogliere il surnatante, riestrarre allo stesso modo il pellet, raccogliere nuovamente il surnatante, unirlo al precedente e annotare il volume. Aggiustare il pH a 6.0, prelevare 0.2 ml di estratto e portare a secco, aggiungere 0.5 ml di buffer acetato di sodio20 0,1 M, incubare con 0.5 ml di B – glucosidasi21 per 1 ora a 30 °C, fermare la reazione aggiungendo 1 ml di 0.2 N NaOH. Dopo 5 minuti aggiungere 1 ml di HCl 0.2 N. Aggiungere 1 ml di soluzione di Cloramina T 1% e dopo 1 minuto 3 ml di soluzione acido barbiturico/piridina. Misurare l’assorbanza dopo 4 minuti a 570 nm dopo 10 minuti.
Metodo d’idrolisi alcalina
Porre 20 g di campione finemente macinato in una beuta ed aggiungere 200 ml di acqua distillata lasciando macerare per 4 ore; connettere la beuta ad un distillatore e raccogliere 150 ml di distillato in 20 ml di una soluzione di NaOH 25 %22. Portare a 250 ml con acqua distillata e trasferire 100 ml
di tale soluzione in un cilindro; aggiungere 8 ml di soluzione di idrossido di ammonio (NH4OH)23 6 N
e 3 ml di soluzione di ioduro di potassio (KI)24 al 5 %. Eseguire la titolazione con una soluzione di nitrato d’argento (AgNO3)25 0,02 N ponendo sotto il cilindro un foglio di carta nera al fine di osservare
la torbidità che indica la saturazione della soluzione.
Il contenuto in HCN del campione (mg/kg o %) è calcolato nel modo seguente:
16
Pyridine, for UV-spectroscopy, ≥99.5% (GC), Fluka Chemie GmbH
Barbituric acid puriss. p.a., for the determination of cyanide, ≥99.5% (HPLC), Fluka Chemie GmbH
18
Cyanide Ion Chromatography Standard Solution Fluka, 1 g/l, Fluka Chemie GmbH
19
Certificate of Analysis Lot. N° 1382986 del 15 aprile 2008.
20
Sodium acetate, ≥99.0%, anhydrous, Sigma-Aldrich
21
β-Glucosidase from almonds, BioChemika, lyophilized, powder, ≥6 units/mg
22
Sodium hydroxide, BioUltra, ≥98.0% (T), pellets, Fluka
23
Ammonium hydroxide solution puriss. p.a., 25% NH 3 in H2O (T), Fluka Chemie GmbH
24
Potassium iodide puriss. p.a., ACS reagent, =99.0% (AT), Fluka Chemie GmbH
25
Silver nitrate solution volumetric standard, 0.1 N in H2O, 0.0950-0.1050 N, Sigma-Aldrich Chemie GmbH
17
15
1 ml di 0,02 N AgNO3 = 1,08 mg HCN
HCN (mg/kg) = (1,08 x Vf / Va x 1000 / w) χ
Dove Vf indica il volume totale distillato (250 ml), V a è l’aliquota di distillato utilizzato per la titolazione (100 ml), w è il peso del campione analizzato (20 g) e χ è il volume di AgNO3 necessario per la
titolazione.
2.4.2
Tannini totali
È stato utilizzato il metodo con reagente di Folin-Ciocalteu26 con lettura spettrofotometrica a
725 nm (Riedl et al., 2007; Zielinski & Kozlowska, 2000). Questa metodica prevede tre fasi: estrazione, reazione e lettura. Operativamente 1 g di campione finemente macinato è estratto per agitazione in
5 ml di metanolo (MetOH) per 30 minuti in provette Falcon® di plastica da 15 ml e centrifugato (IEC
CL30R, Thermo Electrono Corporation) a 6.500 giri al minuto a temperatura ambiente per 10 min.
Dopo aver effettuato l’estrazione 0,25 ml di estratto sono miscelati in una provetta da 10 ml con 4 ml
di acqua ultrapura e 0,25 ml di reagente di Folin-Ciocalteu, precedentemente diluito con acqua ultrapura 1:1 (v/v) (Zielinski e Kozlowska, 2000).
Tale miscela è vortexata per 30 s e lasciata incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente all’aggiunta di 0,5 ml di soluzione satura di carbonato di sodio (Na2CO3)27 si è lasciato incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente e poi centrifugato a 5.000 giri al minuto
per 10 minuti (Riedl et al., 2007).
L’assorbanza del surnatante è misurata a 725 nm in cuvetta di polistirolo con C.O. di 1 cm; la
quantificazione è effettuata per estrapolazione da una curva di calibrazione a diverse concentrazioni di
catechina.
Tutti i campioni sono stati analizzati in doppio. Il risultato è espresso in mg/100 g di catechina
equivalenti (CE).
2.4.3
Tannini condensati
Per questa tipologia di analisi è stata utilizzata la metodica della vanillina acidificata (Burns,
1971).
26
27
Folin-Ciocalteu reagent BioChemika, 2 N (with respect to acid), Fluka Chemie GmbH.
Na2CO3 anidro  99.5%, Carlo Erba Reagenti.
16
Per la fase di estrazione sono stati utilizzati 3 g di campione estratti per shaking in 10 ml di
MetOH per 20 minuti entro tubi Falcon® di plastica da 15 ml e centrifugato a 6.500 giri al minuto a
temperatura ambiente per 10 minuti.
Ad 1 ml di estratto vengono addizionati 5 ml di cromogeno fresco costituito da una soluzione
di Vanillina (VLA) al 5% in MetOH / HCl 8% in MetOH 1:1 (v/v); dopo un passaggio in vortex si è
incubato in bagnetto termostatato a 30° C per 20 minuti esatti. La lettura è effettuata in cuvetta di polistirolo (C.O. 1 cm) a 500 nm contro il bianco, costituito da MetOH.
Anche in questo caso il contenuto in tannini condensati è espresso in catechina equivalenti
CE) calcolata attraverso una calibrazione effettuata utilizzando la (+) Catechina (1; 0,5; 0,25; 0,125
mg/ml). Ad 1 ml di calibratore vengono aggiunti 5 ml di cromogeno e si procede come per i campioni
incogniti.
La concentrazione in tannini viene ottenuta da quella in CE dividendo per un fattore 2
(Abs500=0,2) fino ad un fattore 3 (Abs500=1,4). In ogni caso il risultato viene espresso in mg/g secondo
le formule:
C.E.sample 
C.E. 10
 FD
3
TANN .sample  1 / 2 
C.E. 10
 FD
3
dove FD è il fattore di diluizione eventualemente applicato all’estratto per adattare
l’assorbanza del campione entro il range di linearità della calibrazione con la CTA. Il fattore 2 è valido
solo nel caso che la lettura a 500 nm sia inferiore a 0,2 UA (Price et al., 1978; Wang et al., 1998).
2.4.4
Alfa-galattosidi
Per la determinazione degli α-galattosidi (chiamati anche raffinose-family oligosaccharides,
RFOs) ci si è avvalsi della collaborazione del Departemento de Tecnologia des Alimentos dell’INIA di
Madrid, dove è stata applicata la metodica descritta da Muzquiz et al. (1992).
Questo metodo prevede una fase di estrazione di 100 mg di campione, omogeneizzandolo con
un Ultraturrax con 5 ml di etanolo acquoso (50%) per 1 minuto in ghiaccio. Tale miscela è centrifugata per 10 minuti a 12.100 g e poi è recuperato il surnatante. Il pellet è nuovamente estratto per due
volte ed il surnatante unito. Il campione estratto è deionizzato usando delle minicolonne C18 (Waters,
500 mg/6cc) attraverso un sistema sottovuoto (Supelco, Bellefonte, PA, USA). L’eluito è portato a
secco, risospeso in acqua Milli-Q e iniettato in un sistema HPLC (Beckman System Gold) equipaggiato con un lettore dell’indice di rifrazione; come stardard per la quantificazione è utilizzato uno standard commerciale, i risultati sono espressi in mg/g di s.s. e tutti i campioni sono analizzati in doppio.
17
2.4.5
Fitati
I fitati o fosfato-inositoli (IPs) sono stati determinati in collaborazione con il Departemento de
Tecnologia des Alimentos dell’INIA di Madrid, utilizzando la metodica descritta da Cuadrado et al.
(1996). Tale metodica prevede l’estrazione di 500 mg di campione macinato con 10 ml di HCl 0.5 M
per 1 minuto utilizzando un omogeneizzatore Ultraturrax e poi centrifugato per 15 minuti a 27.000 g a
4 °C. A 5 ml di estratto sono poi aggiunti 25 ml di acqua MilliQ e tale estratto diluito fatto eluire attraverso delle colonne SAX (500 mg/3cc) (Varian, Harbor City, CA, USA). IPs (IP3, IP4, IP5 e IP6) sono recuperate con 2 ml of HCl 2M, essiccati e poi risospesi in 0,5 ml di buffer. I campioni sono stati
iniettati in un sistema (Beckman System Gold) con un detector ad indice di rifrazione. I risultati sono
espressi come mgIP/g di s.s., utilizzando un idrolizzato di acido fitico come standard. Tutti i campioni
sono stati analizzati in doppio.
2.4.6
Inibitori della tripsina
Gli inibitori della tripsina (TI) sono stati determinati in collaborazione con il Departemento de
Tecnologia des Alimentos dell’INIA di Madrid, utilizzando la metodica descritta da Kakade et al.
(1974) e ripresa da diversi autori tra i quali Page et al. (2000) utilizzando l’α-N-benzoyl-DL-argininep-nitroanilidehydrochloride (BAPNA) come substrato per la tripsina. Tale metodica prevede una fase
di estrazione, una fase di reazione e lettura.
L’attività inibitoria (Trypsin inhibitor activity - TIA) è estrapolata dalla retta di calibrazione ed
espressa in Trypsin Unit (TU), unità di misura definita arbitrariamente come un incremento di 0,01 unità di assorbanza a 410 nm per 10 ml di soluzione (Kakade et al., 1974). Una TU corrisponde quindi
all’incremento dell’1% di inibizione (I %) (in riferimento al controllo) per mg di peso secco.
TU mg-1 = Pendenza/(0,01 x concentrazione del campione (mg cm-3)
La percentuale di inibizione è calcolata comparando l’assorbanza del campione con la media
dell’assorbanza del bianco (ADS100%):
I% = (ADS100% - ADScamp./ ADS100%) x 100.
La pendenza della retta di regressione riferita alle percentuali di inibizione contro la quantità
teorica di campione macinato corrisponde alle TUs per mg di campione fresco (TUfw).
Si corregge poi tale valore riferendolo alla sostanza secca (h %) ottenendo le TUs per mg di
s.s. (TUdw) = TUfw x h %.
18
Si sono prese in considerazione solo le percentuali di inibizione compresi tra il 40 – 60%, perché fuori questi limiti la relazione tra quantità teorica del campione macinato e assorbanza non è più
lineare.
2.5. Metodica analitica in vitro per la valutazione della fermentescibilità
Le prove di fermentescibilità sono state condotte in vitro mediante la tecnica della “Gas
Production” seguendo la procedura proposta da Theodorou et al. (1993, 1994) e modificata come segue.
Il substrato (0.5 g) (equivalente all’alimento da testare) viene posto in bottiglie di vetro con
capacità nominale di 125 ml e addizionato di 40 ml di un medium costituito da una soluzione tampone
e da soluzioni minerali oltre a un agente riducente. In un secondo momento vengono aggiunti 40 ml di
inoculo ruminale, prelevato da due manze alimentate con una razione a base di fieno di graminacee
integrato con 1 kg/capo/giorno di concentrato che apporta anche la necessaria integrazione vitaminicominerale. Tutte le operazioni di movimentazione del liquido ruminale e del medium vengono condotte
sotto corrente di anidride carbonica.
Ogni bottiglietta viene quindi a rappresentare un fermentatore indipendente. Ogni materrale è
stato incubato in quadruplo.
La misurazione del gas prodotto nel corso delle fermentazioni è stata effettuata mediante un
manometro collegato a un ago con il quale è stato perforato il tappo in gomma delle bottigliette. In tal
modo è possibile misurare la pressione presente all’interno della bottiglia che viene poi convertita in
volume di gas mediante una curva di calibrazione pressione-volume precedentemente predisposta nel
rispetto delle medesime condizioni operative delle prove in vitro. Le misurazioni della pressione sono
state effettuate 9 volte nel corso delle fermentazioni, protratte fino a 48 ore.
La quantità cumulata di gas prodotto ai diversi tempi è stata interpolata mediante un modello
esponenziale [y= b *(1-e-ct)], dove:
y = produzione di gas al tempo t (in ore)
b = produzione potenziale di gas (ml/g di sostanza organica)
c = velocità di fermentazione oraria
t = tempo (ore)
2.6. Analisi statistica
Tutti i dati sono stati sottoposti all’analisi della varianza (ANOVA), le medie comparate con il
test Least Significant Difference (LSD) e dichiarate significativamente differenti per p<0,05. È stato
utilizzato il sofware Statistica 7.0 (StatSoft,Inc.USA).
19
3. RISULTATI
3.1
Cece
3.1.1 Costituzione chimica centesimale
Lo studio della composizione chimica centesimale delle granelle di cece ha evidenziato un discreto contenuto in proteina grezza (20-23% sulla s.s.) associato a un elevato contenuto di amido (4748% sulla s.s.), che ne fanno un alimento bilanciato nell’apporto proteico ed energetico.
Interessante è il contenuto di lipidi grezzi (fino al 5,9% sulla s.s.), notevolmente più elevato di
quello di altri legumi, nei quali normalmente si aggira intorno all’1-2%; il contenuto in fibra grezza
risulta relativamente basso (2-4% sulla s.s). La stima delle UF ha portato alla definizione di un valore
pari a circa 116 UFL/s.s. e di 129 UFC/s.s.. Nelle tabelle seguenti (Tabb. 4 e 5) sono riportati i valori
analitici medi delle granelle ottenute dalle coltivazioni sperimentali realizzate dall’UO 2 nel 2007 e nel
2008:
Tab. 4: costituzione chimica dei semi di cece (raccolto 2007) (% S.S. ± D.S.)
Varietà Protidi grezzi Lipidi grezzi Fibra grezza Ceneri
Amido
Pascià 21,02±0,77
4,68±0,18
2,48±0,14 3,22±0,12 47,49±0,93
Sultano
20,23±1,92
4,79±0,24
3,37±0,41 3,09±0,15 47,79±1,46
Tab. 5: costituzione chimica dei semi di cece (raccolto 2008) (% S.S. ± D.S.)
Varietà Protidi grezzi Lipidi grezzi Fibra grezza Ceneri
Amido
4,91±0,40
2,53±0,25
3,71±0,26 47,81±1,32
Pascià 23,06±0,98
22,55
±2,04
4,91
±0,70
3,48
±0,31
3,37±0,48 48,46±1,65
Sultano
L’analisi statistica dei dati relativi alla composizione chimica ha evidenziato alcune differenze
rilevanti tra le due varietà e tra i due anni di sperimentazione. Per quanto riguarda la differenze tra le
varietà si evidenzia una differenza significativa (p=0,0148) per il contenuto in ceneri, come è possibile
osservare nella figura seguente (Fig. 4); non emergono altre differenze tra le due varietà per gli altri
parametri, eccetto una tendenza alla significatività per il contenuto in amido più elevato in Sultano rispetto a Pascià (p=0,052).
20
Fig. 4: il grafico evidenzia il contenuto in ceneri più elevato nella variatà Pascià rispetto a Sultano. a,b
p<0,05; A,B p<0,01
Per quanto riguarda la differenza tra gli anni, invece si evidenziano differenze a carico del
contenuto proteico (p=0,0001) e di ceneri (p=0,0038), così come meglio evidenziato nei grafici seguenti (Figg. 5 e 6).
Fig. 5: il grafico evidenzia che nel 2008 il contenuto proteico è stato più elevato rispetto al 2007 . a,b p<0,05;
A,B
p<0,01
Fig. 6: il grafico evidenzia che nel 2008 il contenuto in ceneri è stato più elevato rispetto al 2007 . a,b
p<0,05; A,B p<0,01
21
Per quanto riguarda le differenze nella composizione chimica in funzione della densità e
dell’epoca di semina, si evidenzia che questi parametri agronomici incidono fortemente sia sulla produttività sia sulla composizione chimica e quindi sulla qualità nutrizionale delle granelle. In particolare
da questo studio è emerso che il livello proteico e di amido, per entrambe le varietà, è maggiore per
l’epoca di semina primaverile (p=0.000012 e p=0.0255) (Figg. 7 e 8).
Fig. 7: il grafico evidenzia il maggiore contenuto proteico dei semi per l’epoca di semina primaverile . a,b
p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 8: il grafico evidenzia il maggiore contenuto di amido nei semi per l’epoca di semina primaverile.
a,b
p<0,05; A,B p<0,01
Diversamente, il contenuto lipidico risulta superiore per l’epoca di semina autunnale (Fig. 9).
22
Fig. 9: il grafico evidenzia il maggiore contenuto di lipidi grezzi nei semi per l’epoca di semina autunnale.
a,b
p<0,05; A,B p<0,01
Per quanto riguarda l’effetto della densità di semina sui valori nutrizionali si evidenzia per
l’amido un contenuto significativamente minore per la densità D3 (70 piante/m2), come riportato in
Fig. 10, rispetto alle altre densità.
Fig. 10: differenze nel contenuto in amido per le diverse densità di semina. a,b p<0,05; A,B p<0,01
23
3.1.2 Composizione aminoacidica delle proteine
Dallo studio della composizione aminoacidica si potuto rilevare la buona rappresentativià di
tutti gli aminoacidi essenziali. Il profilo aminoacidico medio è riportato nella seguente tabella (Tab. 6).
Tab. 6: profilo aminoacidico dei semi di cece (mg/g±D.S.)
Alanina
Arginina
Ac. Aspartico
Cisteina
Glutamine
Glicina
Istidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Serina
Fenilalanina
Prolina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
Totale essenziali
Totale solforati
Totale aromatici
ALA
ARG
ASP
CYS
GLU
GLY
HIS
ILE
LEU
LYS
MET
SER
PHE
PRO
THR
TRP
TYR
VAL
Sultano
11,77±1,26
26,74±3,08
25,07±4,52
1,16±0,28
41,91±8,03
9,78±1,17
7,06±0,77
12,15±3,91
16,40±1,84
14,46±3,62
1,12±0,44
10,59±0,87
13,29±1,94
10,56±0,79
8,84±0,74
1,98±0,18
4,77±1,47
10,97±1,16
79,21±8,03
2,28±0,69
20,04±3,02
Pascià
10,17±1,76
24,20±2,62
25,02±4,39
1,40±0,52
44,77±6,16
10,06±0,83
7,19±0,61
11,82±1,61
18,49±2,66
13,71±3,49
0,87±0,25
13,24±8,26
11,24±2,13
11,21±1,34
8,72±1,00
1,88±0,29
5,71±0,82
11,22±1,53
77,93±10,12
2,27±0,57
18,83±2,22
Dall’analisi statistica dei dati è emersa una discreta variabilità della componente aminoacidica
in funzione della densità di semina, denotandosi una concentrazione maggiore per le alte densità rispetto alle basse. I grafici seguenti mostrano chiaramente tale effetto sia per gli aminoacidi aromatici
(Fig. 11), sia per quelli essenziali (Fig. 12) che per quelli solforati (Fig. 13).
24
Fig. 11: effetto della densità di semina sul contenuto di aminoacidi aromatici. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 12: effetto della densità di semina sul contenuto di aminoacidi essenziali. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 13: effetto della densità di semina sul contenuto di aminoacidi solforati. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Analogamente si evidenziano differenze per le due epoche di semina, significative solo per
quel che riguarda il contenuto di aminoacidi essenziali (Fig. 14).
25
Fig. 14: effetto dell’epoca di semina sul contenuto di aminoacidi essenziali. a,b p<0,05; A,B p<0,01
3.1.3 Contenuto in fattori antinutrizionali
Tannini
Il contenuto in tannini totali medio rilevato è stato pari a 185 mg/100 g CE (Tab. 7), mentre il
contenuto in tannini condensati è risultato sotto il limite di quantificazione.
Tab. 7: contenuto in tannini totali (mg/100g C.E. ± D.S.) dei semi di cece
Varietà Tannini totali
Pascià 167,83±22,98
Sultano 203,09±24,40
L’analisi statistica ha messo in evidenza che la varietà Pascià contiene meno tannini totali rispetto alla varietà Sultano (p=0,000074), così come meglio evidenziato nel grafico seguente (Fig. 15).
Fig. 15: contenuto in tannini totali delle due varietà. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Rispetto all’epoca di semina, inoltre si riscontra un quantitativo nettamente inferiore di tannini
totali nei semi provenienti dalle piante seminate in epoca primaverile (p=0.0305) (Fig. 16).
26
Fig. 16: variazione del contenuto in tannini tra le due epoche di semina. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Non sono evidenziabili differenze significative per le diverse densità di semina e non esiste
una variabilità significativa tra i due anni di sperimentazione.
Alfa-galattosidi
Per quanto riguarda il contenuto di α-galattosidi (o RFOs) sono stati rilevati valori medi di
73,60 ± 6,18 mg/g come somma di tutti gli zuccheri analizzati; i singoli valori sono riportati nelle Tabelle seguenti (Tabb. 8 e 9):
Tab. 8: contenuto di α-galattosidi (mg/g±D.S.) dei semi di cece (raccolto 2007)
Varietà Saccarosio Maltosio Galactinolo Raffinosio Ciceritolo Stachiosio RFOs Totali
4,43±0,47 30,81±1,23 17,88±1,10 78,55±3,93
Pascià 21,46±0,47 1,79±0,54 2,18±0,37
4,89±0,42 38,74±2,72 16,99±1,19 81,11±4,71
Sultano 14,86±0,42 2,90±0,41 2,73±0,14
Tab. 9: contenuto di α-galattosidi (mg/g±D.S.) dei semi di cece (raccolto 2008)
Varietà Saccarosio Maltosio Galactinolo Raffinosio Ciceritolo Stachiosio RFOs Totali
5,14±0,62 26,91±1,91 18,51±1,87 72,84±4,79
Pascià 16,23±1,51 3,27±0,64 2,77±0,68
Sultano 13,42±2,32 2,32±0,73 2,26±0,68
5,34±0,98
30,16±2,15 16,20±1,31 69,70±5,29
Il contenuto di α-galattosidi mostra variazioni significative tra due anni di sperimentazione
(Fig. 17) ma, pur analizzando singolarmente i campioni di ogni anno, non si evidenziano differenze
significative tra le due varietà né tra le diverse epoche di semina.
27
Fig. 17: contenuto di galattosidi nei due anni di sperimentazione. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Si sono rilevati, invece, differenze tra le diverse densità di semina (Fig. 18); in particolare è
evidenziabile un contenuto significativamente minore per le densità più elevate (D3 e D4).
Fig. 18: effetto delle densità di semina sul contenuto in alfagalattosidi totali. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fitati
Lo studio del contenuto di fitati ha evidenziato un contenuto medio di 8,29±1,20 mg/g, con
una netta prevalenza di IP6 (84%) rispetto agli altri inositol fosfati. Di seguito sono riportati i valori
rilevati per i due anni di sperimentazione (Tabb. 10 e 11).
Tab. 10: contenuto di fitati (mg/g±D.S.) dei semi di cece (raccolto 2007)
Varietà
IP3
IP4
IP5
IP6
IP totali
Pascià 0,13±0,00 0,28±0,02 1,18±0,18 5,74±1,93 7,32±2,08
Sultano 0,13±0,00 0,23±0,05 1,08±0,21 6,25±1,53 7,68±1,78
Tab. 11: contenuto di fitati (mg/g±D.S.) dei semi di cece (raccolto 2008)
Varietà
IP3
IP4
IP5
IP6
IP totali
Pascià 0,13±0,00 0,23±0.03 0,95±0,10 7,47±0,75 8,78±0,82
Sultano 0,13±0,00 0,20±0,03 0,85±0,08 7,21±0,76 8,38±0,80
28
L’analisi statistica dei dati ha mostrato che nell’anno 2008 il contenuto di IP totali è stato più
elevato rispetto al 2007 (Fig. 19), pur non evidenziando differenze significative tra le due varietà.
Fig. 19: il grafico evidenzia che nel 2008 il contenuto in fitati totali è stato più elevato rispetto al 2007. a,b
p<0,05; A,B p<0,01
Per quanto riguarda le epoche di semina, invece, si è rilevato un quantitativo maggiore di fitati
totali per le granelle provenienti dalle coltivazioni seminate in primavera (E3) (Fig. 20), così come un
quantitativo superiore è stato rilevato per la densità di semina più bassa (Fig. 21).
Fig. 20: differenza tra le due epoche di semina nel contenuto di fitati totali nelle granelle. a,b p<0,05; A,B
p<0,01
29
Fig. 21: differenza tra le 4 densità di semina nel contenuto di fitati totali nelle granelle. a,b p<0,05; A,B
p<0,01
Inibitori della tripsina
Il contenuto di inibitori della tripsina medio rilevato è stato di 15,59 ± 3,66 TIU/10 ml di estratto, corrispondente a 155,9 ± 36,60 TIU (mg/g s.s. ± D.S.); i valori rilevati per i due anni e per le
differenti densità ed epoche di semina sono riportati di seguito (Tabb. 12 e 13).
Tab. 12: contenuto di inibitori della tripsina dei semi di cece (raccolto 2007)
Varietà TIU/10ml estratto±D.S. TIU (mg/g s.s.) ±D.S.
19,78±2,94
197,78±29,37
Pascià
18,75±0,54
187,54±5,40
Sultano
Tab. 13: contenuto di inibitori della tripsina dei semi di cece (raccolto 2008)
Varietà TIU/10ml estratto±D.S.
Pascià
13,42±2,66
Sultano
14,99±3,59
TIU (mg/g s.s.) ±D.S.
134,21±26,60
149,89±35,93
L’analisi statistica ha evidenziato differenze significative tra i due anni di sperimentazione
(Fig. 22) e per le due epoche di semina (Fig. 23).
30
Fig. 22: il grafico evidenzia che nel 2007 il contenuto in inibitori della tripsina è stato più elevato rispetto
al 2008. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 23: effetto dell’epoca di semina sul contenuto di inibitori della tripsina. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Non ci sono differenze significative tra le due varietà e tra le 4 densità di semina.
Per quanto riguarda gli altri fattori antinutrizionali indagati e previsti nel progetto di ricerca si
sono rilevati valori inferiori al limite di quantificazione delle metodiche adottate.
31
3.1.4 Fermentescibilità
Le prove di fermentescibilità condotte in vitro hanno evidenziato per il cece una elevata velocità di fermentazione che ha portato a concentrare oltre il 50% della produzione complessiva di gas,
indice del grado di digestione ruminale, nelle sole prime 8 h di incubazione (Fig. 24).
350
(ml/g OM)
300
250
200
150
100
50
0
0
10
20
Ore
30
40
50
Fig. 24: Andamento della produzione di gas derivante dalla fermentazione in vitro di farina di cece.
La comparazione tra le due varietà (Fig. 25) e le tre diverse epoche di semina (Fig. 26) poste a
confronto nel corso dell'anno 2007 non ha posto in evidenza differenze significative nella fermentescibilità complessiva, valutata mediante la quantità di gas complessivamente prodotta per grammo di sostanza organica nel corso delle complessive 48 h di fermentazione in vitro, tra le due varietà considerate (Pascià e Sultano) mentre un effetto altamente significativo è risultato attribuibile all’epoca di semina.
(ml/g s.o.)
340
338
336
334
332
330
328
326
Pascià
Sultano
Fig. 25: Produzione media complessiva di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di cece di varietà
Pascià e Sultano e ottenute nell’anno 2007.
In particolare la semina più tardiva (epoca 3) si è tradotta in una minore fermentescibilità
(P<0.01) rispetto alle due semine più precoci. Non è invece risultata significativa l'interazione varietà epoca di semina.
32
(ml/g s.o.)
340
338
336
334
332
330
328
326
324
322
320
Epoca 1
Epoca 2
Epoca 3
Fig. 26: Produzione media complessiva di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di cece di varietà
Pascià e Sultano seminate a tre diverse epoche nell’anno 2007.
L’elaborazione delle cinetiche di produzione di gas ha fornito risultati interessanti in quanto
hanno da un lato confermato i risultati relativi alla fermentescibilità potenziale appena sopra ricordati,
ma hanno anche posto in luce differenze significative nella velocità di fermentazione. Differenze che
si sono evidenziate fra le due varietà poste a confronto, in quanto la varietà Pascià è risultata più rapidamente digerita rispetto alla varietà Sultano (0.074 vs. 0.068, P<0.01) (Fig. 27).
7.50
7.40
7.30
7.20
7.10
7.00
6.90
6.80
6.70
6.60
6.50
(% / h)
Pascià
Sultano
2007
Fig. 27: Velocità oraria di produzione di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di cece di varietà Pascià e Sultano seminate nell’anno 2007.
Significativo è stato anche l’effetto dell’epoca di semina, in quanto il materiale proveniente
dalla semina più tardiva si è dimostrato essere digerito più velocemente rispetto ai prodotti derivanti
dalle due epoche di semina precedenti, tra i quali non sono invece state riscontrate differenze significative. Si può comunque notare una tendenza all’aumento della velocità di fermentazione con il progressivo posticipo dell’epoca di semina (Fig. 28).
33
7.4
(%/h)
7.3
7.2
7.1
7.0
6.9
6.8
6.7
Epoca 1
Epoca 2
Epoca 3
Fig. 28: Velocità oraria media di produzione di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di cece di varietà Pascià e Sultano seminate in tre epoche diverse nell’anno 2007.
Le prove agronomiche condotte nel corso dell'anno 2008 hanno permesso di valutare l'effetto
della varietà, della densità di semina e dell’epoca di semina, nonché ovviamente le relative interazioni.
Con riferimento alla quantità di gas complessivamente prodotto, la varietà Sultano si è dimostrata significativamente superiore rispetto a Pascià (336.2 vs. 333.7 ml / g sostanza organica; P<0.05)
(Fig. 29).
(ml/g s.o.)
340
339
338
337
336
335
334
333
332
331
330
Pascià
Sultano
Fig. 29: Produzione media complessiva di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di cece di varietà
Pascià e Sultano e ottenute nell’anno 2008.
Per quanto concerne l'effetto della diversa densità di semina si è osservato un andamento di tipo quadratico, in quanto la fermentescibilità è aumentata dal primo al terzo livello di densità di semina
per poi diminuire leggermente con la densità massima. Le differenze tra le tesi a confronto non hanno
però raggiunto la significatività statistica (Fig. 30).
34
(mg/g s.o.)
340
338
336
334
332
330
D1
D2
D3
D4
Fig. 30: Velocità oraria media di produzione di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di cece di varietà Pascià e Sultano seminate a quattro diverse densità nell’anno 2008.
Con riferimento alla epoca di semina, il materiale seminato più precocemente ha dimostrato
una più elevata digeribilità (336.9 vs. 333.0 ml/g s.o.; P<0.01) (Fig. 31).
(mg/g s.o.)
340
338
336
334
332
330
Epoca 1
Epoca 2
Fig. 31: Produzione complessiva media di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di cece di varietà
Pascià e Sultano seminate in due epoche diverse nell’anno 2008.
Significative sono risultate anche le interazioni tra densità ed epoca di semina come pure tra
varietà ed epoca di semina.
I risultati della elaborazione delle cinetiche di fermentescibilità in vitro hanno confermato i risultati relativi alla digeribilità potenziale dei materiali considerati (Fig. 32) mentre non sono state evidenziate differenze significative per quanto concerne la velocità di fermentazione che si è attestata
mediamente al 7.8%/ora (Fig. 33).
35
(ml/g s.o.)
360
355
350
345
340
Pascià
Sultano
Fig. 32: Produzione potenziale media di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di cece di varietà Pascià e Sultano e ottenute nell’anno 2008.
(%/h)
8.00
7.90
7.80
7.70
7.60
7.50
Pascià
Sultano
Fig. 33: Velocità oraria di produzione di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di cece di varietà Pascià e Sultano seminate nell’anno 2008.
36
3.2
Lupino azzurro
3.2.1 Costituzione chimica centesimale
Lo studio della composizione chimica centesimale delle granelle di lupino azzurro ha evidenziato un elevato contenuto in proteina grezza (mediamente il 32-33% sulla s.s.). Tale pregio, viene da
un lato enfatizzato dalla presenza di carboidrati non amidacei come fonte energetica, ma nello stesso
tempo sminuito in quanto larga parte di tali carboidrati appartengono alla famiglia degli α-galattosidi,
responsabili della flautolenza intestinale (Martıń ez-Villaluenga et al., 2005), così come meglio evidenziato in seguito.
Interessante è il contenuto di lipidi grezzi (fino al 5,8% sulla s.s.), notevolmente più elevato di
quello di altri legumi dove normalmente si aggira intorno all’1-2%. Il contenuto in fibra grezza risulta
mediamente pari al 18-20 % sulla s.s.. Le Tabelle seguenti (Tabb. 14, 15, 16, 17 e 18) mostrano i valori analitici delle componenti nutrizionali considerate, nonché una stima delle UFC e UFL di ciascuna
linea genetica.
Tab. 14 – Composizione chimica centesimale delle granelle fornite da UO 1 – ENEA Casaccia (% s.s.)
Linea genetica Protidi grezzi Lipidi grezzi Fibra grezza NDF ADF ADL Ceneri
20A
32,13
5,10
19,51
36,80 25,22 2,07 3,89
18
31,78
5,42
16,63
33,88 23,59 2,04 3,72
12A
31,00
5,22
13,52
31,64 23,93 1,61 3,81
17B
34,94
5,20
15,92
33,11 21,47 1,27 3,28
26A
30,83
5,58
18,10
32,73 12,62 1,82 3,25
30A
33,24
5,83
14,66
32,83 25,45 2,87 4,02
32A
30,51
5,44
15,72
38,83 28,81 1,55 2,92
43A
29,31
5,19
18,09
34,52 24,58 2,41 3,99
48A
33,05
5,73
41,95
35,69 17,59 2,11 3,31
4A
34,36
5,73
15,57
31,35 15,41 2,03 3,65
65-3
28,44
4,92
18,64
35,59 27,63 2,42 3,79
50A
28,12
4,89
18,41
31,79 22,04 2,80 3,92
Tab. 15: UFL e UFC riferiti alla s.s. e al t.q.
Linea genetica UFL/TQ UFL/SS UFC/TQ UFC/SS
20A
85,12
93,29
76,34
87,06
18
92,14
99,17
84,29
94,22
12A
96,98
104,45
90,33
101,14
17B
93,68
101,10
85,96
95,92
26A
90,16
97,14
81,80
91,10
30A
93,24
103,13
86,22
99,36
32A
91,91
101,73
84,65
96,52
43A
87,15
95,57
79,03
90,27
48A
49,41
53,63
32,21
36,16
4A
91,58
101,88
84,23
97,25
65-3
85,07
94,37
76,89
88,66
50A
84,24
91,48
77,28
87,35
MEDIA
86,72
94,74
78,27
88,75
37
Tab. 16: Composizione chimica centesimale delle granelle oggetto di sperimentazione dell’annata agraria
2006-2007 – UO 2 (% sulla s.s.)
Linea genetica Protidi grezzi Lipidi grezzi Fibra grezza NDF ADF ADL Amido Ceneri
30A
26,65
5,44
19,79
30,2 23,2 5,12 0,24
3,37
65/4
30,7
4,46
17,81
29 21,7 4,01 0,26
3,71
43A
30,04
3,67
16,62
30,7 22,5 7,31 0,35
3,49
65/1
28,39
3,1
17,14
30,6 21,2 3,57
0,7
3,79
65/2
26,94
3,97
18,4
34,5 23,4 3,18 0,35
3,78
12A
27,07
3,09
19,25
30 25,3 7,36
0,3
3,56
18
27,55
5,39
19,81
34,2 26 5,65 0,33
3,24
20A
33,4
5,05
15,54
30,3 22,2 4,69 0,27
3,69
65/3
30,8
4,12
16,27
31,7 22,6 3,84 0,31
3,58
17
30,9
5,63
17,00
31,9 20,5 4,47
0,4
3,51
26A
25,49
5,24
21,28
30,9 20 2,52 0,35
3,4
32A
24,04
3,41
22,28
28,7 22,7 5,51 0,35
3,41
48A
30,6
4,93
19,44
30,5 20,9 3,07 0,32
3,53
51B
28,55
2,97
22,74
40,4 23,5 4,47 0,41
3,6
50A
29,45
0,42
19,87
33,3 24,1 4,09 0,45
3,29
4A
31,47
3,47
21,51
36
23.1 1,65 0,41
3,58
42A
28,79
9,95
17,10
30,8 21,4 3,61 0,59
3,44
Tab. 17: UFL e UFC riferiti alla s.s. e al t.q. delle granelle dell’annata agraria 2006/2007
Linea genetica
UFL/TQ UFL/SS UFC/TQ UFC/SS
30A
83,26
90,56
73,80
83,32
65/4
86,52
93,41
77,68
87,37
43A
86,81
94,62
78,51
88,96
65/1
85,46
92,43
77,06
86,91
65/2
83,02
90,65
74,15
84,45
12A
83,29
88,85
74,11
82,18
18
83,62
90,79
74,10
83,39
20A
90,61
98,83
82,52
93,78
65/3
90,48
96,52
82,27
91,24
17
88,71
96,68
80,14
90,81
26A
79,73
87,00
69,73
79,03
32A
74,56
81,95
64,31
73,43
48A
86,86
91,76
77,36
84,89
51B
74,80
81,21
64,15
72,49
50A
81,36
85,30
71,92
78,10
4A
78,29
84,82
67,98
76,62
42A
93,96 102,35
85,28
96,52
MEDIA
84,20
91,86
75,00
84,32
Tab. 18: composizione chimica dei semi di lupino azzurro (raccolto 2008) (% S.S.)
Linea genetica Protidi grezzi Lipidi grezzi Fibra grezza
NDF
ADF
ADL
Ceneri
26A
30,55±1,74
4,87±0,69
18,32±0,31 30,46±0,35 22,14±1,50 5,46±0,48 4,07±0,15
42A
32,79±3,07
4,27±1,06
19,93±0,14 29,33±0,43 22,12±0,53 5,66±2,34 3,91±0,09
48A
34,00±1,34
4,94±1,15
18,74±0,67 33,08±3,53 22,31±1,55 4,62±2,03 3,76±0,13
L’analisi statistica, condotta sulle linee genetiche più promettenti dal punto di vista produttivo
(26A, 42A e 48A) ed oggetto della prova sperimentale con epoche di semina differenti (autunnali e
primaverili), ha evidenziato alcuni aspetti significativi sotto l’aspetto nutrizionale.
In primo luogo si evidenza una differenza significativa tra le linee genetiche nel contenuto
proteico (Fig. 34), della fibra grezza (Fig. 35) e delle ceneri (Fig. 36).
38
Fig. 34: differenza tra le linee genetiche nel contenuto proteico. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 35: differenza tra le linee genetiche nel contenuto in fibra grezza. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 36: differenza tra le linee genetiche nel contenuto in ceneri. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Per quanto riguarda l’effetto dell’epoca di semina si sono evidenziate differenze significative
per il contenuto di lipidi grezzi (Fig. 37) e per l’ADF (Fig. 38).
39
Fig. 37: effetto dell’epoca di semina sul contenuto in lipidi grezzi. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 38: effetto dell’epoca di semina sul contenuto di ADF. a,b p<0,05; A,B p<0,01
40
3.2.2 Composizione aminoacidica delle proteine
I valori medi della composizione aminoacidica dei campioni relativi alle diverse accessioni
di lupino azzurro è riportata di seguito (Tab. 19.
Tab. 19: profilo aminoacidico dei semi di lupino azzurro (mg/g±D.S.)
Alanina
ALA 14,81±2,31
Arginina
ARG 32,49±4,50
Ac. Aspartico
ASP 31,56±5,26
Cisteina
CYS 1,97±0,27
Ac. Glutammico GLU 69,98±14,63
Glicina
GLY 18,88±5,40
Istidina
HIS 10,06±0,84
Isoleucina
ILE 17,75±3,16
Leucina
LEU 23,43±3,57
Lisina
LYS 15,93±2,58
Metionina
MET 0,93±0,34
Fenilalanina
PHE 11,70±1,4
Prolina
PRO 17,28±5,13
Serina
SER 19,25±8,50
Treonina
THR 12,87±1,08
Triptofano
TRP 2,47±0,33
Tirosina
TYR 9,34±2,25
Valina
VAL 15,39±1,38
Totale essenziali
23,51±3,41
Totale solforati
100,47±7,42
Totale aromatici
2,90±0,25
L’epoca di semina incide significativamente sul contenuto di aminoacidi aromatici
(p=0,000007) (Fig. 39), così come esistono differenze significative per il contenuto dei singoli aminoacidi.
Fig. 39: effetto dell’epoca di semina sul contenuto di aminoacidi aromatici. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Tra le linee genetiche testate si nota una differenza significativa tra loro sia per il contenuto di
aminoacidi essenziali, che solforati e aromatici (Figg. 40, 41 e 42), nonché per i singoli aminoacidi.
41
Fig. 40: differenza nel contenuto di aminoacidi aromatici tra le linee studiate. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 41: differenza nel contenuto di aminoacidi essenziali tra le linee studiate. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 42: differenza nel contenuto di aminoacidi solforati tra le linee studiate. a,b p<0,05; A,B p<0,01
42
3.2.3 Contenuto in fattori antinutrizionali
Tannini
Il contenuto in tannini totali medio rilevato è stato pari a 308,05±37,78 mg/100 g CE s.s (Tab.
20), mentre il contenuto in tannini condensati è risultato sotto il limite di quantificazione.
Tab. 20: contenuto in tannini totali (mg/100g CE s.s.±D.S.) dei semi di lupino azzurro (raccolto 2008)
Varietà
26 A
42 A
48 A
Tannini totali
327,46±5,09
287,65±46,82
309,04±55,71
Pur non evidenziandosi differenze tra le linee genetiche, si evidenziano variazioni significative
tra le due epoche di semina, con valori nettamente più bassi per la semina primaverile (Fig. 43).
Fig. 43: effetto dell’epoca di semina sul contenuto in tannini totali. a,b p<0,05; A,B p<0,01
α-galattosidi
Per quanto riguarda il contenuto di α-galattosidi (o RFOs) sono stati rilevati valori medi di
86,62 ± 15,81 mg/g come somma di tutti gli zuccheri analizzati; i singoli valori sono riportati nella
Tabella seguente (Tab. 21):
Tab. 21: contenuto di α-galattosidi (RFOs) (mg/g s.s.) dei semi di lupino azzurro (raccolto 2008)
Linea genetica
26A
Saccarosio Maltosio Raffinosio Ciceritolo Stachiosio Galactopinitolo Verbascosio RFOs Totali
14,72±2,73 1,64±0,73 4,36±1,09 2,68±0,07 25,25±4,38 4,21±0,21
18,12±2,85 70,98±12,05
42A
20,87±0,13 0,70±0,25 7,31±1,70
4,52±03,7 30,02±5,28 3,71±0,27
23,26±0,94
90,39±7,98
48A
21,63±3,56 1,16±0,78 7,78±1,03
4,00±0,30 34,21±6,84 5,64±1,08
24,06±1,95
98,48±15,55
43
Dall’analisi statistica dei dati emergono differenze significative sia tra le diverse linee genetiche che tra le due epoche di semina (Figg. 44 e 45).
Fig. 44: differente contenuto in galattosidi nelle tre linee genetiche indagate. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 45: differenze nel contenuto di galattosidi tra le due epoche di semina. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fitati
Lo studio del contenuto di fitati ha evidenziato un contenuto medio di 8,83±0,80 mg/g, con
una netta prevalenza di IP6 (91%) rispetto agli altri inositol fosfati. Di seguito sono riportati i valori
rilevati per le 3 linee genetiche oggetto di sperimentazione nel 2008 (Tab. 22).
Tab. 22: concenuto di fitati (mg/g s.s. ±D.S.) dei semi di lupino azzurro (raccolto 2008)
Linea genetica
IP3
IP4
IP5
IP6
IP totali
26A
0,13±0,00 0,15±0,00 0,47±0,00 8,88±0,64 9,57±0,67
42A
0,13±0,00 0,17±0,00 0,43±0,02 8,20±0,18 8,93±0,16
48A
0,13±0,00 0,17±0,00 0,45±0,01 7,27±0,47 8,00±0,51
L’analisi statitistica ha messo in evidenza differenza significative sia tra le linee genetiche che
tra le epoce di semina, come mostrato di seguito (Figg. 46 e 47).
44
Fig. 46: differenze nel contenuto di fitati tra le linee genetiche nell’anno 2008. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Fig. 47: effetto dell’epoca di semina sul contenuto di fitati nell’anno 2008. a,b p<0,05; A,B p<0,01
Per quanto riguarda gli altri fattori antinutrizionali indagati e previsti nel progetto di ricerca si
sono rilevati valori inferiori al limite di quantificazione delle metodiche adottate.
3.2.4 Fermentescibilità
I campioni disponibili per questa leguminosa e derivanti dalle prove agronomiche condotte
negli anni 2007 i 2008 hanno consentito di porre a confronto genotipi diversi e diverse epoche di semina, queste ultime limitatamente all'anno 2008.
Va innanzitutto posto in evidenza come la quantità di gas complessivamente prodotta da tal
lupino sia risultata leggermente inferiore rispetto alla equivalente produzione ottenuta con il cece
(321.4 vs 350.3 ml/g s.o.), in accordo con le differenze di composizione chimica esistenti tra queste
due granelle e che vedono il cece più ricco in carboidrati fermentescibili e il lupino più ricco invece in
45
lipidi che non vengono fermentati dalla microflora ruminale ma possono comunque fornire energia
all’animale.
Le differenze varietali sono state valutate complessivamente per il biennio 2007-2008 e, per
quanto concerne la produzione complessiva di gas misurata in vitro, sono risultati significativi sia l'effetto dell'anno di coltivazione sia l'effetto della varietà.
Con riferimento al primo fattore, le granelle prodotte nel corso del 2007 hanno generato una
quantità di gas significativamente superiore (326.5 vs. 316.4 ml/g s.o.; P<0.01) (Fig. 48).
(ml/g s.o.)
330
325
320
315
310
2007
2008
Fig. 48: Produzione media complessiva di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di lupino di quattro
differenti varietà seminate negli anni 2007 e 2008.
I confronti varietali hanno fornito indicazioni favorevoli soprattutto per i genotipi 26A e 48A
rispetto ai rimanenti 42A e 4A, con scostamenti spesso significativi (Fig. 49).
322
(ml/g s.o.)
322
321
321
320
320
319
319
318
26A
42A
48A
4A
Fig. 49: Produzione media complessiva di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di lupino di quattro
differenti varietà seminate negli anni 2007 e 2008.
Entrambi i fattori considerati, annata agraria e varietà, hanno invece inciso significativamente
sulle cinetiche di fermentazione e in particolar modo sulla velocità di produzione di gas. Le granelle
46
prodotte nel corso del 2007 sono risultate più rapidamente fermentate rispetto a quelle prodotte nel
corso del 2008 (7.62 vs 6.83 %/h; P<0.01) (Fig. 50).
(%/h)
7.8
7.6
7.4
7.2
7.0
6.8
6.6
6.4
2007
2008
Fig. 50: Velocità media oraria di produzione di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di Lupino di
differenti varietà seminate nell’anno 2008.
Per quanto concerne le differenze tra le diverse popolazioni genetiche non è stata invece riscontrata alcuna differenza significativa nella velocità di digestione (Fig. 51).
10
(%/h)
9
8
7
6
5
4
26A
42A
48A
4A
Fig. 51: Velocità oraria di produzione di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di lupino di differenti
varietà seminate negli anni 2007 e 2008.
Nel corso del 2008 i fattori sperimentali posti a confronto sono stati relativi alle differenze genetiche e di densità di semina.
Le differenze tra varietà sono risultate ai limiti della significatività statistica, con la varietà
42A che ha prodotto più gas rispetto alle altre (P<0.10). Non è stato invece riscontrato alcun effetto
significativo dell’epoca di semina sulla quantità di gas generato durante le incubazioni (Fig. 52).
47
(ml/g s.o.)
325
320
315
310
26A
42A
48A
4A
Fig. 52: Produzione complessiva di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di lupino di quattro differenti varietà seminate nell’annata 2008.
I parametri derivanti dalla elaborazione delle curve di produzione cumulata di gas hanno permesso di porre in maggior risalto la maggiore produzione potenziale di gas della varietà 42A che risultata sempre e significativamente (P<0.01) superiore rispetto alle altre (Fig. 53).
340
(ml / g s.o.)
335
330
325
26A
42A
48A
4A
Fig. 53: Produzione potenziale di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di lupino di quattro differenti varietà seminate nell’annata 2008.
Non significativo è invece risultato l'effetto del patrimonio genetico sulla velocità di produzione di gas, con differenze tra le tre varietà poste a confronto sempre quantitativamente contenute. L'epoca di semina non ha invece parimenti influenzato significativamente questo parametro (Figg. 54 e
55).
48
10
(%/h)
9
8
7
6
5
4
26A
42A
48A
4A
Fig. 54: Velocità oraria di produzione di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di lupino di differenti
varietà seminate nell’anno 2008.
(%/h)
6.80
6.78
6.76
6.74
6.72
6.70
Epoca 1
Epoca 2
Fig. 55: Velocità oraria di produzione di gas ottenuta dall’incubazione delle granelle di lupino di differenti
varietà seminate nell’anno 2008 a due differenti densità.
49
4 Considerazioni finali e conclusioni
Dal raffronto con i dati riportati in bibliografia, sia con le stesse specie oggetto del presente
studio sia con altre proteaginose di utilizzo comune, in particolare con la soia, è possibile asserire che i
valori di composizione chimica e fattori antinutrizionali del cece e del lupino azzurro, coltivati nelle
condizioni sperimentali descritte nei capitoli precedenti, appaiono perfettamente in linea e di sicuro
interesse per l’alimentazione animale.
L’elevata rusticità di queste specie di leguminose consente livelli produttivi simili rispetto a
quelli conseguibili da altre proteaginose. I pregi nutrizionali si devono essenzialmente a:
-
buon contenuto proteico, che nel caso del lupino azzurro risulta maggiormente
disponibile a livello intestinale poiché accumulata nel seme sotto forma di globuline dotate di minore potere emulsionante alle albumine caratterizzanti altre proteaginose (Van
Berneveld, 1999);
-
elevato contenuto di energetico, fornito nel caso del cece dall’amido e nel caso
del lupino azzurro da zuccheri solubili non amidacei, che in parte sono tuttavia rappresentati da α-galattosidi, considerati antinutrizionali in quanto responsabili della flautolenza ed
in parte rappresentati da β-(1-4)-galattani (Carre et al., 1985).
Non è da sottovalutare, inoltre, il contenuto di vitamine del gruppo B (tiamina, riboflavina e niacina), di amminoacidi essenziali (in particolar modo della lisina) (Piccioni, 1979) e di sali minerali (ferro, zinco e calcio) (Carnovale et al., 1987), unitamente ad un limitato contenuto in lignina. Interessante
è il contenuto di lipidi grezzi, notevolmente più elevato di quello di altri legumi dove normalmente si
aggira intorno all’1-2%.
Il profilo aminoacidico è simile a quello di altri legumi, con un alto contenuto in lisina ed un basso
contenuto in amminoacidi solforati presentando, tuttavia, carenze di metionina e lisina ed un eccesso
di arginina (Van Barneveld, 1999), che rende cece e lupino azzurro particolarmente adatti alla complementazione con i cereali. La Tabella seguente (Tab. 23) pone a contronto i dati acquisiti con altri
alimenti utilizzati come fonte proteica per l’alimentazione animale.
Data la rilevante presenza di carboidrati complessi (amido e fibra) oltre che di costituenti minori, si
può affermare in generale che il cece ed il lupino azzurro, come altri legumi, svolge un’importante
funzione di regolazione del metabolismo lipidico e glucidico, oltre che dell’attività gastro-intestinale
(Jenkins et al., 1980; Crapo, 1985).
50
Tab. 23: confronto del profilo aminoacidico di alcune fonti proteiche (g/16gN)
Lupino bianco
Cece
Cece (Pascià e
Lupino
Soia* Pisello proteico*
var Multitalia* tipo Kabuli**
Sultano)***
azzurro***
ALA
4,39
4,19
3,31
4,4
3,16
3,23
ARG
7,67
6,68
9,99
10,3
13,55
9,74
ASP
10,84
12,47
11,87
11,4
12,37
12,00
CYS
1,49
1,41
1,43
1,3
2,06
1,74
GLU
12,99
16,28
23,02
17,3
16,48
31,86
GLY
4,24
4,00
3,88
4,1
2,19
1,36
HYS
2,64
1,79
2,34
3,4
8,76
8,26
ILE
5,03
4,09
4,65
4,1
3,76
3,30
LEU
7,80
6,64
7,45
7
7,70
7,23
LYS
6,30
1,41
4,25
7,7
4,19
3,30
MET
1,44
0,85
0,68
1,6
0,60
0,53
PHE
5,21
4,47
4,19
5,9
4,02
2,95
PRO
5,43
4,00
4,28
4,6
2,44
2,86
SER
5,63
5,32
6,22
4,9
3,58
3,54
THR
3,99
2,40
3,71
3,6
3,45
2,71
TRP
1,35
0,85
0,60
1,1
TYR
3,84
2,92
4,56
3,7
2,17
1,71
VAL
5,06
4,28
3,94
3,6
1,87
2,67
22,06
14,40
18,46
21,70
18,31
16,09
Totale solforati
9,05
7,39
8,76
9,60
6,19
4,66
Totale aromatici
24,85
31,27
33,70
25,82
23,18
Totale essenziali 36,30
*Prandini et al. (2005); ** El-Adawy (1999); *** campioni oggetto della presente sperimentazione
I semi di lupino azzurro contengono un buon quantitativo di oligosaccaridi della famiglia dello stachiosio (35-38 g/kg s.s.) (Van Kempen et al., 1994) e del raffinosio (4-9 g/kg s.s.); quest’ultimo, tuttavia, può provocare diversi effetti negativi aumentando la produzione di gas ed interferendo con la digestione di altri nutrienti (Van Barneveld, 1999).
Il contenuto in lipidi grezzi risulta piuttosto elevato, con valori prossimi al 5% sulla s. s. I principali
acidi grassi presenti sono l’acido linoleico (483 g/kg), l’oleico (312 g/kg), il palmitico (76 g/kg) e il
linolenico (54 g/kg) (Hansen e Czochanska, 1974), risultando anche resistenti all’ossidazione (Petterson, 1998).
Nel caso della farina di lupino azzurro McDonald e collaboratori (1992), riportano un contenuto in
Energia Metabolizzabile (EM) pari a 11,5 MJ/kg s.s. per i polli e 13,2 MJ/Kg s.s. per i ruminanti; il
contenuto in energia digeribile per i suini risulta pari a 17,3 MJ/Kg s.s..
Il problema principale per l’alimentazione animale è rappresentato dal contenuto in alcaloidi tossici
(lupanina, sparteina, lupinina, isolupanina, angustifolina, L-17-idrossilupanina), che possono raggiungere valori anche di 20 g/kg in alcune varietà amare. Non del tutto trascurabili appaiono i problemi posti dal rivestimento fibroso del seme, che ha effetti negativi sulla digeribilità, in particolare nei monogastrici.
Tali fattori limitanti possono essere in buona parte ridotti sottoponendo il seme a diversi trattamenti
tecnologici (bagnatura, estrusione, espansione, tostatura).
51
Alcuni trattamenti tecnologici producono sugli alimenti ad uso zootecnico modificazioni chimicofisiche, influenzandone il valore nutrizionale complessivo, la degradabilità ruminale, (Tabella 3)
l’utilizzazione digestiva, la disponibilità di nutrienti, l’appetibilità e lo stato igienico sanitario.
Tali modifiche indotte da trattamenti tecnologici riguardano soprattutto:
- gelatinizzazione e destrinizzazione degli amidi (incremento anche fino al 15-20% dell’efficienza
digestiva);
- diminuzione della degradabilità ruminale delle proteine nei poligastrici;
- riduzione dell’ossidazione dei grassi (inattivazione delle lipasi);
- riduzione della carica batterica.
Per il cece ed il lupino azzurro, i trattamenti tecnologici possono risolvere i problemi relativi ad alcuni fattori antinutrizionali, che con diverse modalità interagiscono con l’utilizzazione digestiva dei
nutrienti provocando perdite di produzione.
Occorre tuttavia porre attenzione agli effetti sulla qualità della materia prima in funzione del tipo e
dell’intensità del trattamento tecnologico; ad esempio sono noti effetti negativi del trattamento termico
sulla disponibilità di alcuni aminoacidi essenziali, lisina in modo particolare.
La nutrizione proteica degli animali d’interesse zootecnico risulta di fondamentale importanza sia
per gli allevamenti da latte che per quelli da carne; il fattore comune è il miglioramento della produttività, riducendo i costi di alimentazione e mitigando al contempo la quantità di azoto escreto.
Tenendo conto del livello produttivo e dei fabbisogni proteici degli animali in funzione del loro stato fisiologico, l`impiego di diverse materie prime nella razione, avviene in funzione principalmente dei
seguenti parametri:
-
quantità di proteina;
-
quantità massima utilizzabile all`interno della razione;
-
valore biologico, ovvero qualità nutrizionale della proteina;
-
costo;
-
disponibilità aziendale;
-
facilità di reperimento, stoccaggio e conservabilità.
Alla luce di quanto sopra esposto, le scelte attuabili sono diverse in funzione di una molteplicità di
circostanze, per le quali è difficile indicare una soluzione univoca ottimale per un corretto razionamento. A queste considerazioni vanno aggiunte quelle di carattere economico legate al costo della proteina
ed, a parità di altre condizioni, quelle inerenti le esternalità ambientali dovute all’escrezione azotata.
L’impiego delle proteaginose considerate “minori” (favino, pisello proteico, lenticchia, cicerchia,
cece, lupino) nel razionamento animale, pur se oggetto di diverse trattazioni scientifiche e tecniche che
ne dimostrano l’importanza, ha trovato difficoltà di sviluppo principalmente per la mancanza di quantitativi idonei ad una espansione di massa.
52
Tuttavia la necessità di reperimento di fonti proteiche alternative o complementari, sorta per effetto
dell’aumento del costo della soia (sia GM che non) e del blocco agli OGM in Europa, sta riattivando
l’interesse per le proteaginose “minori”.
È da sottolineare, inoltre, il fatto che l’industria mangimistica italiana dipende in larga misura dalle
importazioni di mais e soia da USA, Argentina, Brasile, Uruguay e Paraguay dove le coltivazioni transgeniche sono sempre più diffuse. Il blocco nei confronti degli OGM porterà, secondo uno studio della
Commissione Europea (http://ec.europa.eu/agricultu-re/envir/gmo/economic_impactGMOs_en.pdf, ad
un deficit di soia di 32 milio-ni di tonnellate nel 2010, con ovvie forti ripercussioni sulla produzione
zoo-tecnica.
Tra le prospettive di rilancio delle leguminose da granella in Italia ed in Europa, si può annoverare,
inoltre, la crescente richiesta da parte dei consumatori di carni biologiche, pro-venienti da allevamenti
condotti secondo precise prescrizioni tecniche. In tale nuovo contesto, l’alimentazione del bestiame
assume importanza strategica, in quanto la normativa che regola il settore, a partire dal Regolamento
CE 2092/91 (che sarà abrogato dal Reg. Ce 834/2007 a far data dal 1 Gennaio 2009), prevedono
l’utilizzo esclusivo di erbe, mangimi e foraggi di provenienza aziendale o extraziendale ottenuti con le
metodologie dell’agricoltura biologica. Le leguminose, e le proteaginose da granella in particolare, sono quindi un’importante fonte di energia ed aminoacidi per l’alimentazione animale, in particolar modo per i monogastrici (James et al., 2005).Tali alimenti sono caratterizzati, da un notevole contenuto di
proteine ma, parallelamente, la loro inclusione nella dieta può essere limitata dalla presenza di fattori
antinutrizionali endogeni del seme, potenzialmente in grado di produrre effetti biologici negativi negli
animali con effetti indesiderati sulle performance.
Un supporto scientifico con approccio multidisciplinare può contribuire alla diffusione delle proteaginose “minori”, attraverso contributi all’azione gestionale in sede di pianificazione della politica agricola e attraverso la messa a disposizione di conoscenze approfondite di carattere genetico, agronomico e zootecnico.
Il successo di tali colture in ambito zootecnico dipenderà in larga parte dall’attivazione delle relative filiere (dalla produzione di seme certificato alla trasformazione ad opera dei mangimifici, fino
all’inclusione nelle razioni alimentari) e dal raggiungimento della competitività sul mercato nei confronti della soia.
La disponibilità e la qualità degli alimenti concentrati gioca un ruolo cruciale nella gestione
dei sistemi di allevamento, influendo sul benessere animale, sulla sua efficienza produttiva, sulla qualità degli alimenti e sulla redditività dell’impresa. Nel caso degli allevamenti ad indirizzo biologico, le
regole poste dalla Comunità Europea avranno un impatto crescente sulle scelte degli allevatori, a causa
degli elevati costi delle materie prime derivanti dall’agricoltura biologica e a causa della non facile e
costante disponibilità di mercato. Sia per l’allevamento degli erbivori domestici, sia soprattutto per
l’allevamento dei monogastrici non è infatti prospettabile un sistema di gestione che non preveda un
adeguato apporto di alimenti ad elevata concentrazione energetica e proteica. La diffusa presenza di
53
tipi genetici animali a medio-elevato livello produttivo implica necessariamente l’adozione di piani alimentari adeguati in ogni fase del ciclo di allevamento.
Nel caso degli erbivori, ruminanti in particolare, la qualità dei foraggi rappresenta un obiettivo irrinunciabile, condizione per migliorare la digeribilità della razione e ridurre l’apporto di concentrati entro i
limiti posti dalle normative vigenti.
Nell’impossibilità di utilizzare fonti di alimenti concentrati derivanti da manipolazioni genetiche (OGM) e nella difficoltà crescente di reperire soia e mais non OGM, si rende necessario implementare la produzione nazionale di fonti energetiche e proteiche sostitutive, anche attraverso la valorizzazione di produzioni tradizionali che si adattano alla coltivazione anche in aree collinari e con limitati input agronomici. Le aziende zootecniche ad indirizzo biologico potranno raggiungere condizioni di sostenibilità gestionale ed economica soprattutto se riusciranno raggiungere un ottimale livello
di integrazione con le attività di produzione agricola. La mangimistica aziendale rappresenta una prospettiva di estremo interesse in questa direzione. Restano tuttavia aperti i problemi della conservazione
delle materie prime per evitare alterazioni e contaminazioni, nonché i problemi del trattamento tecnologico per neutralizzare la presenza di eventuali fattori antinutrizionali e per migliorare il loro livello
di utilizzazione digestiva. L’inserimento di fonti proteiche alternative o complementari a quelle più
largamente diffuse nella alimentazione dei ruminanti e dei monogastrici deve essere preceduto da una
attenta valutazione anche di aspetti legata alla digeribilità ed alla qualità della proteina alimentare. Entro tali scenari, alcune leguminose da granella, considerate proteaginose “minori” per la loro scarsa
diffusione, tra i quali il cece (Cicer arietinum L., 1753) e il lupino azzurro (Lupinus angustifolius L.,
1753) possono fornire un contributo importante per l’affermarsi di tali indirizzi produttivi. Tali leguminose possono costituire alternative colturale in sistemi agricoli basati su monosuccessione di cereali, determinano un arricchimento azotato del suolo, sono utili per la preparazione dei terreni per la
conversione a produzioni biologiche, costituiscono un valido sistema per la copertura e la protezione
del suolo, sono fonte di proteine per il razionamento degli animali da reddito e anche, nel caso del cece, per l’alimentazione umana.
Il progetto di ricerca ha avuto la finalità di approfondire le conoscenze riguardo alla qualità
nutrizionale di leguminose tradizionali da destinare all’alimentazione animale, in particolare di due varietà di cece ed alcune linee genetiche sperimentali di lupino azzurro, proponendosi, in un ambito più
ampio la possibilità di inserire tali alimenti nella dieta degli animali di interesse zootecnico, supportando strategie agronomiche e di miglioramento genetico volte a offrire una valida alternativa alle colture proteiche industriali.
54
BIBLIOGRAFIA
-
Aikman K., Bergman D., Ebinger J., Seigler D., 1996. Variation of cyanogenesis in some plant
species of the Midwestern United States. Biochemical Systematics and Ecology, 24 (7/8): 637-645.
-
AOAC (Association of Official Analytical Chemist), 1990. Official Methods of Analysis, Asso-
ciation of Official Analytical Chemists. 15th Ed. Gaithersburg, USA: AOAC Press.
-
AOAC (Association of Official Analytical Chemist), 2000. Official Methods of Analysis, Asso-
ciation of Official Analytical Chemists. 17th Ed. Gaithersburg, USA: AOAC Press
-
Bell J. M., 1993. Factors affecting the nutritional value of Canola meal: a review. Canadian Jour-
nal of Animal Science, 73: 679-697.
-
Bengala-Freire J., Aumaitre A., Peiniau J., Freire J. B., 1991. Effects of feeding raw and extruded
peas on ileal digestibility, pancreatic enzymes and plasma glucose and insulin in early weaned pigs.
Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 65 (3-4): 154-164.
-
Bradbury J. H., Egan S. V., Lynch M. J. 1991. Analysis of cyanide in cassava using acid hydroly-
sis of cyanogenic glucosides. Journal of the Science of Food and Agriculture, 55: 277-290.
-
Brinker A. M., Seigler D. S., 1989. Methods for the detection and quantitative determination of
cynide in plant materials. Pytochemistry Bulletin, 21: 24-31.
-
Burns R. E. , 1971. Method for estimation of tannin in grain sorghum. Agronomy Journal, 63
(May-June): 511-512.
-
Carnovale E, Lombardi-Boccia G, Lugaro E , 1987. Phytate and zinc content of Italian diets. Hu-
man Nutrition - Applied Nutrition, 41A: 180-86.
-
Carre B., Brillouet J. M., Thibault J. F. 1985. Characterization of polysaccharides from white lu-
pin (Lupinus albus L.) cotyledons. Journal of Agriculture and Food Chemistry 33: 285-292.
-
Chavan J. K., Kadam S. S., Salunkhe D. K. 1989. Biochemistry and technology of chickpea (Ci-
cer arietinum) seeds. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 25 (2): 107-109.
-
Clemente A., Sanchez-Vioque R., Vioque J., Bautista J., Millàn F., 1998. Effect of cooking on
protein quality of chickpea (Cicer arietinum) seeds. Food Chemistry, 62 (1): 1-6.
-
Cohen, S., Michaud, D., 1993. Synthesis of a fluorescent derivatizing reagent, 6-Aminoquinolyl-
N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate, and its application for the analysis of hydrolysate Amino Acids
via High-Performance Liquid Chromatography. Analytical Biochemistry, 211:279-287.
-
Cohen, S., De Antonis, K. M., 1994. Applications of Amino Acid derivatization with 6-
Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate. Analysis of feed grains, intravenous solutions, and
glycoproteins. Journal of Chromatography A, 661:25-34.
-
Crapo, P. A., 1985. Simple versus complex carbohydrate use in the diabetic diet. Annual Review of
Nutrition, 5: 95-114.
55
-
Cuadrado C., Ayet A., Robredo L. M., Tabera J., Villa R., Pedrosa M. M., Burbano C., Muzquiz
M., 1996. Effect of natural fermentation on the content of inositol phosphates in lentils. Z Lebensm.
Unters. Forsch., 203: 268–271.
-
De Lange C. F. M., Nyachoti C. M., Verstegen M. W. A., 2000. The significance of antinutritional
factors in feedstuffs for monogastric animals. In “Feed evaluation – principles and practice”,
Moughan P J., Verstegen M. W. A., Visser-Reyneveld M. I. (eds). Wageningen Pers., Wageningen,
The Netherlands: 169-183.
-
Egan S.V., Yeoh H. H., Bradbury J.H., 1998. Simple picrate paper kit for determination of the
cyanogenic potential of cassava flour. Journal of the Science of Food and Agriculture, 76: 39-48.ù
-
Feigl F., Anger V., 1966. Replacement of benzidine by copper ethylacetoacetate and tetra base as
spot-test reagent for hydrogen cynide and cyanogen. Analyst, 91: 282-284.
-
Groff E. B., Wu Z., 2005. Milk production and nitrogen excretion of dairy cows fed different
amounts of protein and varying proportions of alfalfa and corn silage. Journal of Dairy Science, 88:
3619-3632.
-
Hadjipanayiotou M., 2002. Replacement of soybean meal and barley grain by chickpeas in lamb
and kid fattening diets. Animal Feed Science and Technology, 96: 103-109.
-
Hansen R. P., Czochanska Z., 1974. Composition of the lipids of lupin seed. Journal of the Sci-
ence of Food and Agriculture 25: 409.
-
Haque M.R., Bradbury H.J., 2002. Total cyanide determination of plants and foods using the
picrate and acid hydrolysis methods. Food Chemistry, 77: 107-114.
-
Huisman J, Tolman G.H, 1992. Anti-nutritional factors in the plant proteins of diets for non-
ruminants. In: “Recent Advances in Animal Nutrition”, P.C. Garnsworthy, W. Haresign and D.J.A.
Cole, Editors, , Butterworths, London: 3–31.
-
James K. A. C., Butts C. A., Morrison S. C., Koolaard J. P., Scott M. F., Scott R. E., Griffin W.
B., Bang L. M., 2005. The effects of cultivar and heat treatment on protein quality and trypsin inhibitor content of New Zealand field peas. New Zealand Journal of Agricultural Research, 48: 117-124.
-
Jansman, A. J. M., 1993. Tannins in feedstuffs for simplestomached animals. Nutrition Research
Reviews, 6 (1): 209-236.
-
Jenkins D. J. A., Wolever T. M. S., Taylor R. H., Barker H., Fielden H., 1980. Exceptionally low
blood glucose response to dried beans: comparison with other carbohydrate foods. British Medical
Journal, 281: 518-580.
-
Kakade, M. L., Rackies J.J., McGhee J. E., Puski G., 1974. Determination of trypsin inhibitor ac-
tivity of soy products: a collaborative analysis of an improved procedure. Cereal Chemistry, 51: 376382.
-
Kobaisy M., Oomah B. D., Mazza G., 1996. Determination of Cyanogenic Glycosides in flaxseed
by Barbituric Acid-Pyridine, Pyridine-Pyrazolone, and High-Performance Liquid Chromatography
Methods. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44: 3178-3181.
56
-
Liu, H. J., Chang, B. Y., Yan, H. W., Yu, F. H., Liu., X. X., 1995. Determination of Amino Acids
in food and feed by derivatization with 6-Aminoquionolyl-N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate and
Reversed-Phase Liquid Chromatographic Separation. Journal of AOAC International, 78(3): 736-743.
-
Martillotti F., Antongiovanni M., Rizzi L. Santi E., Bittante G., 1997. Metodi di analisi per gli a-
limenti d’impiego zootecnico. Quaderni metodologici n. 8, CNR-IPRA, Roma.
-
Martın
́ ez-Villaluenga C., Frıá s J., Vidal-Valverde C., 2005. Raffinose family oligosaccharides and
sucrose contents in 13 Spanish lupin cultivars. Food Chemistry, 91 (4): 645-649.
-
McDonald P., Edwards R.A., Greenhalgh J. F., 1992. Nutrizione Animale. Tecniche Nuove Edito-
re: 453 – 458.
-
Muzquiz M., Rey C., Cuadrado C., Fenwick G. R., 1992. Effect of germination on the oligosac-
charide content of lupin species. J. Chromatogr., 607: 349–352.
-
Nambisan B., Sundaresan S., 1984. Spectrophotometric determination of cyanoglucosides in cas-
sava. J Assoc Off Anal Chem., 67 (3): 641-643.
-
NRC, 2001. Nutrient Requirements of Dairy Cattle: Seventh Revised Edition.
-
Onwuka G. I., 2006. Soaking, boiling and antinutritional factors in pigeon peas (Cajanus cajan)
and cowpeas (Vigna unguiculata). Journal of Food Processing and Preservation, 30: 616-630.
-
Page D., Quillien L., Duc G., 2000. Trypsin inhibitory activity measurement: simplification of the
standard procedure used for pea seed. Crop Science, 40: 1482-1485.
-
Petterson D. S., Harris D.J., Rayner C. J., Blakeney A. B., Choct M., 1999. Methods for the analy-
sis of premium livestock grains. Australian Journal of Agricultural Research, 50: 775-787.
-
Piccioni M, 1979. Dizionario degli alimenti per il bestiame - IV ed. Edagricole, Bologna.
-
Price M. L. Van Scoyoc S., Butler L. G., 1978. A critical evaluation of the vanillin reaction as an
assay for tannin in sorghum grain. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 26 (5): 1214-1218.
-
Riedl K. M.Lee J. H., Renita M., Martin S. K. S., Schwartz S. J., Vodovotz Y., 2007. Isoflavone
profiles, phenol content, and antioxidant activity of soybean seeds as influenced by cultivar and growind location in Ohio. Journal of the Science of Food and Agriculture, 87: 1197-1206.
-
Salunkhe, D. K., Chavan, J. K., Kadam, S.S., 1990. Dietary tannins: consequences and remedies.
Boca Raton, Floride, Etats-Unis, CRC Press.
-
Singh U., Jambunathan R. D., 1981. Studies on desi and kabuli chickpea (Cicer arietinum, L.) cul-
tivars: levels of protease inhibitors, levels of polyphenolic compound and in vitro protein digestibility.
Journal of Food Science, 46: 1364-1367.
-
Tantisewie B., Ruijgrok H.W.L., Hegnauer R., 1969. Die Verbreitung der blausäure bei den Cor-
mophyten. 5. Mitteilung: Über cyanogene Verbindungen bei den Parietales und bei einigen weiteren.
Sippen. Pharm. Weekblad, 104: 1341–1355.
-
Theodorou M. K., 1993. A new laboratory procedure for determining the fermentation kinetics of
ruminant feeds. Ciencia e Investigacion Agraria 20, 332-344.
57
-
Theodorou, M. K., Williams, B. A., Dhanoa, M. S., McAllan, A. B., France, J., 1994. A simple
gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant
feeds. Animal Feed Science and Technology, 48: 185-197.
-
Van Barneveld R. J., 1999. Understanding the nutritional chemistry of lupin (Lupinus spp.) seed to
improve livestock production efficiency. Nutrition Research Reviews, 12: 203-230.
-
Van Kempen, R. J., & Hughes, R. J.,1994. The nutritive value of lupin for pigs and poultry. In
Proceedings of the first Australian lupin technical symposium: 49–57.
-
Waghorn G., 2008. Beneficial and detrimental effects of dietary condensed tannins for sustainable
sheep and goat production . Progress and chellenges. Animal Feed Science and Technology, 147: 116139.
-
Wang X., Warkentin T. D., Briggs C. J., Oomah B. D., Campbell C. G., Woods S., 1998. Total
phenolics and condensed tannins in field pea (Pisum sativum L.) and grass pea (Lathyrus sativus L.).
Euphytica, 101: 97-102.
-
Zielinski H., Kozlowska H., 2000. Antioxidant activity and total phenolics in selected cereal
grains and their different morphological fractions. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 48:
2008-2016.
58