Non solo il Gradiente Morfogenetico (una molecola diffusibile agisce secondo un gradiente di
concentrazione) può spiegare il differenziamento cellulare a seguito dell’esposizione alla
fonte di activina.
1.Cascata di reazioni di amplificazione: l’activina agisce solo a concentrazioni elevate,
inducendo il differenziamento SOLO delle cellule immediatamente adiacenti alla fonte. Tali
cellule emettono un secondo segnale, che induce il differenziamento delle cellule adiacenti, e
così via. Tale ipotesi è stata verificata (ed esclusa) interponendo uno strato di cellule
insensibili all’activina tra l’emisfero animale (in grado di rispondere) e la fonte di activina.
2.Migrazione cellulare: l’activina induce nelle cellule immediatamente adiacenti, oltre al
differenziamento, anche migrazione cellulare; le cellule differenziate si ritrovano quindi a
grande distanza dalla fonte di activina dalla quale son partite. Tale ipotesi è stata verificata
(ed esclusa) colorando in modo differente le cellule:
Le
cellule
competenti
per
la
risposta
all’activina hanno circa 500 recettori activina-
specifici sulla loro superficie cellulare.
Se i recettori complessati dall’activina sono tra
100 e 300, viene trascritto il gene bra, e le
cellule
differenziano
verso
un
destino
mesodermico ventrale. Se il numero di recettori
complessati è più alto, allora viene attivato gsc,
che
porta
a
differenziamento
mesodermico dorsale.
in
senso
specificazione
Specificazione sinciziale (insetti). Segmentazione superficiale. Blastoderma sinciziale
Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO
specific. sinciziale
Specificazione sinciziale (insetti).
mRNA localizzati
asimmetricamente
Gradienti morfogenetici
delle proteine bcd e nos
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mRNA bicoid
proteina bicoid
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Zanichelli editore S.p.A. Copyright
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mRNA bicoid anteriore
mRNA nanos posteriore
mRNA
hunchback
e
caudal
distribuiti
uniformemente.
Gilbert, BIOLOGIA DELLO
SVILUPPO, Zanichelli
editore S.p.A. Copyright
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(NRE)
(pum)
(pum)
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equivalenza del genoma
Tutte
le
cellule
dell ’ organismo
hanno
effettivamente lo stesso identico genoma?
Oppure il patrimonio genetico della cellula
ormai
differenziata
ha
subito
modificazioni funzionali irreversibili?
delle
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equivalenza del genoma
Hans Spemann e la Teoria del Trasferimento Nucleare
1938: una cellula già terminalmente differenziata è in grado di
riprogrammare l'informazione in termini di espressione genica e
di controllare lo sviluppo embrionale? Spemann propose di
prelevare il nucleo da una cellula di un embrione in avanzata fase
di sviluppo e trasferirlo nel citoplasma di una cellula uovo
enucleata. Spemann non pote' condurre l'esperimento per la
mancanza di strumenti adatti alla manipolazione e dissezione
delle cellule somatiche e germinali.
equivalenza del genoma
exp. Robert Briggs e Tom J. King, 1952
Rana pipiens
equivalenza del genoma
equivalenza del genoma
Briggs e King pongono le basi sperimentali (creano quegli strumenti che
erano mancati a Spemann 14 anni prima quando elaborava la teoria del
Trasferimento Nucleare) per fornire le risposte ai quesiti di quegli anni:
(?) Il nucleo di una cellula differenziata conserva ancora tutte le
informazioni originarie; inoltre, tale nucleo risulta riprogrammabile ed in
grado di originare un nuovo individuo.
(?) La sinergia tra il citoplasma ospite dell’uovo e il nucleo che in esso
viene rilocato è sufficiente a riattivare il nucleo a dirigere lo sviluppo del
nuovo individuo.
equivalenza del genoma
1962: J. Gurdon ritenta l'esperimento di
Briggs e King, usando nuclei di cellule
differenziate
d'intestino
di
girino
di
Xeanopus laevis. 1.4 la % di successo a
girino. Utilizzando il trapianto in serie - il
nucleo viene trapiantato nell ’ uovo che
viene lasciato sviluppare fino a blastula. Il
nucleo
della
cellula
di
blastula
si
trasferisce in un altro uovo enucleato e
così via - ottenne un successo del 7%
comprendente 7 rane adulte fertili.
Gurdon dimostra che i nuclei di cellule
somatiche
differenziate,
citoplasma
di
modificano
il
genetico.
un
trasferiti
uovo
proprio
nel
enucleato,
programma
equivalenza del genoma
1997: I. Wilmut e collaboratori clonano il
primo mammifero.
Prelievo
cellule
somatiche
da
ghiandola
mammaria di adulto (razza Finn-Dorset).
Coltura cellulare e arresto in G1 (le cellule,
2n, son quindi sincronizzate).
Oociti dalla donatrice (razza Scottish blackface)
in seconda metafase meiotica enucleati.
Fusione cellulare somatica/oocito e attivazione
dell’oocito stesso mediante impulsi elettrici.
Trasferimento in utero di pecora gravida.
% di successo: 1/434 oociti impiantati = Dolly.
Dimostrazione della totipotenza del nucleo dei
mammiferi: il genoma rimane inalterato e
capace di differenziare in tutti i tipi cellulari.
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(TATA binding protein)
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variazioni epigenetiche
Modifica ereditabile (quindi trasmissibile alla progenie), che può riguardare un
cromosoma o l’attività di un gene, che non varia la sequenza nucleotidica.
Es: metilazione del DNA
Nei vertebrati la metilazione interessa solamente la Citosina sul dinucleotide CpG ad
opera di enzimi DNA-metiltransferasi (Dnmt) che aggiungono un gruppo metile al
C5 della citosina: il risultato è la 5-metilcitosina. Il 3-5% circa delle C risulta
metilato in cellule eucariotiche
metilazione del DNA
Lo schema di metilazione viene mantenuto ad opera di DNA-metil transferasi di
mantenimento, che hanno particolare affinità per le sequenze emi-metilate:
tendono quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo
metilato.
Globina embrionale
e >
gene attivo nell ’ embrione,
inattivo nel feto
Globina fetale
g >
gene inattivo nell’embrione, attivo
nel feto
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Istone acetiltransferasi (HAT) trasferiscono gruppi acetile agli istoni del nucleosoma,
che viene così destabilizzato consentendo la trascrizione del gene. I fattori di
trascrizione sono spesso in grado di reclutare le HAT o sono essi stessi delle HAT.
Istone deacetilasi > reazione ‘inversa’ con conseguente stabilizzazione dello stato
trascrizionalmente inattivo del gene. Vengono anche reclutate dalle regioni metilate.
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anfibi
• Facili da mantenere
• Iniezione di ormone
• Uova grosse e manipolabili
• Sviluppo embrionale piuttosto rapido
anfibi
solco di segmentazione
gastrulazione
La gastrulazione in Xenopus ha inizio nella regione della semiluna grigia (futuro
lato dorsale dell’embrione)
Lo spermatozoo è importante nel determinare non il movimento in sé, quanto il
senso della rotazione del citoplasma corticale. Un uovo artificialmente attivato
ruota ancora il suo citoplasma, ma in direzione non prevedibile.
anfibi
Il citoplasma ruota grazie alla presenza di un apparato di microtubuli che si
forma, al polo vegetativo, tra il citoplasma corticale e quello interno. Tale
apparato compare appena prima della rotazione e scompare subito dopo.
anfibi - segmentazione
Uova mesolecitiche (quantità modesta di vitello al polo vegetativo), segmentazione
oloblastica (totale) ineguale con simmetria radiale
solco di segmentazione
blastocele
1. Permette la migrazione cellulare durante i massivi movimenti della gastrulazione
2. Impedisce il contatto – quindi l’interazione – tra le cellule.
emisfero (calotta) animale
Nieuwkoop (1973)
anfibi - segmentazione
Blastocele (cavità)
Morula (16-64 cellule)
Blastula (128 cellule)
oligonucleotidi antisenso anti-EP-caderina.
Heasman et al, 1994
blastocele
controllo
Heasman et al, 1994
oligonucleotidi antisenso anti-EP-caderina
gastrulazione
gastrulazione
La blastula deve ridistribuire le cellule/aree in modo tale da portare verso l’interno
quelle (cellule/aree) che daranno origine alle strutture endodermiche, verso
l’ esterno quelle che origineranno il rivestimento dell’ organismo e interporre a
questi due “blocchi“ le cellule/aree con destino mesodermico.
Løvtrup (1975), Landstrom & Løvtrup (1979), Keller (1975, 1976)
anfibi
localizzazione RNA materni
1. l’mRNA deve essere trasportato al polo vegetativo.
2. l’mRNA deve essere ancorato al polo vegetativo.
localizzazione RNA materni
Vg1LE (Vg1 localization element), una sequenza di circa 350 nucleotidi localizzata nella
regione 3´UTR (untranslated region) dell’mRNA di Vg1 mRNA, necessaria affinchè il
messaggero localizzi al polo vegetativo dell ’ uovo. Vg1LE è una sequenza zipcode
(C.A.P.). Vg1LE viene complessata da almeno 6 proteine, 2 sole delle quali note,
Vg1RBP/Vera e VgRBP60. Omologhi di Vera funzionano come localizzatori di mRNA
anche in altri sistemi (es. pollo).
Piccoli RNA non tradotti (Xlsirt) sono essenziali per l’associazione dell’mRNA Vg1 con
la cell cortex del polo vegetativo, ma non per il trasporto. Essi contengono stretch
complementari al mRNA per Vg1 e ne mediano l’associazione con la corticale.
localizzazione RNA materni
Vg1RBP/Vera
A
V
Vg1RBP/Vera colocalizza con il
mRNA di Vg1 ed è necessario
per la sua corretta localizzazione
al polo vegetativo dell’uovo
polarità dell’uovo
La prova sperimentale dell’imposizione di una polarità all’uovo di Xenopus da
parte di determinanti citoplasmatici viene dall’ablazione dei mRNA codificanti per
tali determinanti, VegT (Zhang et al, 1998) e Vg1 (Joseph & Melton, 1998).
La mancanza di VegT e Vg1 altera la distribuzione delle cellule nei tre foglietti
embrionali.
anfibi
Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO,
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