Sistemi di regolazione
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Importanza del controllo
• I componenti cellulari devono essere presenti
nelle giuste concentrazioni.
• La composizione chimica dell’ambiente che
circonda la cellula è in contante cambiamento
quindi la cellula deve essere in grado di
rispondere
efficacemente
ai
questi
cambiamenti ambientali
• La regolazione è importante affinché la cellula
conservi energia e materie prime e mantenga
l’equilibrio metabolico.
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La variazione di fase in Salmonella: un esempio
di controllo a livello di DNA
Il promotore H2 si trova in un segmento delimitato da sequenze
ripetute e invertite. La ricombinazione tra queste sequenze
determina un inversione del frammento di DNA. Adiacente ad H2 si
trova un gene che codifica per un repressore del gene H1. Quando il
segmento H2 viene invertito, non viene sintetizzato il repressore e
quindi H1 può essere espresso.
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La regolazione dell’attività
enzimatica
• Inibizione dell’attività enzimatica
• Modificazione degli enzimi
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Inibizione da Feedback
• La velocità di molte vie metaboliche viene modulata
attraverso il controllo dell’attività degli enzimi regolatori.
Ciascuna via ha almeno un enzima pacemaker (segnapasso)
che catalizza la reazione più lenta, ovvero quella che limita la
velocità della via stessa. Di solito questo enzima catalizza la
prima reazione di una via metabolica. Quando il prodotto
finale diventa troppo concentrato, l’attività dell’enzima viene
inibita.
• Questo tipo di inibizione viene definita in vari modi:
inibizione da feedback, inibizione da prodotto finale o
retroinibizione.
• Il primo enzima di questa sequenza, quello che viene inibito
dal prodotto finale, viene definito enzima allosterico.
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Inibizione da Feedback
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Effettore
Allosterico
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γ-glutamil
chinasi
Inibizione
da
feedback in
una via
biosintetica
ramificata
N-acetil
glutamato
sintetasi
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Inibizione da feedback delle vie metaboliche che
portano alla sintesi di amminoacidi aromatici
3-deossi-Darabinoeptulusonato
7-fosfato
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Modificazione covalente degli
enzimi
• Gli enzimi regolatori possono essere attivati e
disattivati da modificazioni covalenti reversibili
catalizzate da altri enzimi.
• Di solito, questo si verifica attraverso l’aggiunta o
la rimozione di un particolare gruppo chimico
dando luogo a due forme enzimatiche, una attiva
e una inattiva.
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Regolazione della glutamina sintetasi
mediante modificazioni covalenti
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Regolazione dell’espressione
genica
• L’espressione genica può essere controllata
tramite la regolazione di:
•
• INIZIO DELLA TRASCRIZIONE
• STABILITA’ DEGLI mRNA
• MATURAZIONE DEGLI mRNA
• INIZIO DELLA TRADUZIONE
• STABILITA’ DELLE PROTEINE
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Repressione degli enzimi
Figura 8.10
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Induzione degli enzimi
Figura 8.11
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Repressione
Figure 8.12
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Induzione regolata da un repressore
Figura 8.13
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Controllo positivo dell’induzione
Figura 8.14
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Interazione degli attivatori con
la RNA Polimerasi
Figura 8.16
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Organizzazione di un tipico
promotore di lievito
Sequenze che
reprimono la
trascrizione
URS
Sequenze che
attivano la
trascrizione
UAS
TATA
I
40-120 bp
20-700 bp
ORF
40-60 bp
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L’espressione regolata dei geni di utilizzazione
del galattosio nel lievito S. cerevisiae
GAL80
GAL4
I componenti del sistema
GAL7
GAL10
trasferasi
epimerasi
UASGal
GAL1
chinasi
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CH2OH
HO
H
OH
H
H
ATP
Mg2+
ADP
O H
H
D-Galattosio
OH
OH
Galattochinasi
(GAL1)
Glucosio
1-fosfato
PPi
UTP
D-Galattosio 1-fosfato
UDP-glucosio
UDP-D-Glucosio
Galattosio trasferasi
(GAL7)
UDP-D-Galattosio
UDP Glucosio
pirofosforilasi
D-Glucosio 1-fosfato
Fosfoglucomutasi
D-Glucosio 6-fosfato
Galattosio epimerasi
(GAL10)
UDP-D-Glucosio
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La proteina Gal4 si lega alla
UASGal
In assenza di galattosio la proteina
Gal80 si lega a Gal4 e ne
impedisce la funzione di attivatore
della trascrizione
GAL7
GAL10
UASGal
GAL1
UASGal
GAL1
Il galattosio si lega a Gal80
galattosio
GAL7
GAL10
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Il cambiamento
conformazionale induce
l’attivazione
attivazione della trascrizione
GAL7
GAL10
trasferasi
epimerasi
attivazione della trascrizione
UASGal
GAL1
chinasi
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• Le proteine espresse costitutivamente GAL80 e
GAL4 regolano l’espressione di diversi geni
richiesti per la conversione del galattosio in
glucosio-6-fosfato.
• Il prodotto del gene GAL4 lega la Upstream
Activating Sequence (UAS-GAL).
• L’attivazione di GAL4 è repressa da GAL80.
• In presenza di galattosio, è formato un
prodotto metabolico che fa in modo che
GAL80p si separa da GAL4p è quindi avviene
l’attivazione del gruppo dei geni GAL.
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Natura modulare degli attivatori
• DNA binding domain: riconoscimento e legame a
specifiche sequenze di DNA
• Multimerization domain: consente la formazione
di omo o etero multimeri
• Activation domain: necessario per attivare
l’espressione del gene bersaglio
• I target sono ancora oggetto di studio
– fattori generali della trascrizione
– enzimi che modificano gli istoni
– complessi di rimodellamento della cromatina
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Struttura modulare di GAL4
1
98 148 196
768
881
N
legame
attivazione
al DNA
dimerizzazione
C
attivazione
sito di legame
per Gal80
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Esperimenti di “domain swap”
mostrano che i domini sono
intercambiabili
• Si può fondere il dominio di legame al DNA (DBD) di un
fattore di trascrizione con il dominio attivatore di un altro
fattore (AD)
• DBD di LexA (E. coli)
• AD di GAL4 (S. cerevisiae)
• Un gene bersaglio viene posto sotto il controllo del sito di
legame al DNA del primo fattore
• Es. Se nel promotore del gene HIS3 è presente il sito di
legame per LexA, la proteina fusa DBDLexA/ADGAL4
sarà in grado di attivare la trascrizione
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Esperimenti di “domain swap”
mostrano che i domini sono
intercambiabili
Il ceppo è
auxotrofico per
l’istidina in quanto il
gene HIS3 non è
espresso
La proteina di fusione si lega al sito
operatore tramite le sequenze DBD di
LexA e attiva la trascrizione grazie al sito
AD di Gal4. Il gene HIS3 è espresso ed il
ceppo può crescere in assenza di istidina
terreno sintetico
privo di istidina
terreno sintetico
privo di istidina
HIS3
HIS3
sito di legame per LexA
sito di legame per LexA
DBDLexA
ADGal4
Proteina di fusione tra i due domini
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Principio del doppio ibrido
Il ceppo è
auxotrofico per
l’istidina in quanto il
gene HIS3 non è
espresso
La trascrizione del gene HIS3 avviene solo
se la proteina X interagisce con la proteina
Y
terreno sintetico
privo di istidina
terreno sintetico
privo di istidina
HIS3
HIS3
sito di legame per LexA
sito di legame per LexA
ADGal4
DBDLexA
Proteina di fusione tra i
DBDLexA e la proteina X
Proteina di fusione tra i la
proteina Y e ADGal4
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Quorum sensing
 Regolazione dell’espressione genica in risposta alla
densità cellulare
 I lattoni acilati dell’omoserina (AHL) sono molecole
che possono essere prodotte e secrete da tutte le cellule
in una data popolazione.
 Popolazioni ad alta densità cellulare avranno anche
una maggiore concentrazione di AHL
 Le molecole di AHL attivano degli attivatori
trascrizionali specifici che determinano l’induzione
della trascrizione di geni specifici.
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In che modo la cellula “sente” i
cambiamenti esterni?
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Sistema a due componenti
Azzeramento sistema
Stimolo
Cattura dello stimolo
Sensore
Proteina di
membrana
Trasduzione del segnale
Regolatore
Proteina che lega il DNA
operoni
Proteine specifiche
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Sistema a
due
componenti
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Sensore
N-terminale: regione
variabile per la percezione
dello stimolo
OUT
membrana
C-terminale regione conservata:
diversi stimoli vengono trasmessi
nello stesso modo. Qui si trova il
dominio istidina fosfotransferasi
IN
Regolatore
N-terminale: sede della fosforilazione
di un residuo di acido aspartico
C-terminale, sito di legame
con il DNA: regione
variabile che determina
l’appartenenza del
regolatore ad una
sottofamiglia
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Regolazione delle porine di E. coli
•
•
•
•
Le due porine più importanti della membrana esterna sono le proteine
OmpF e OmpC.
I pori generati da OmpC sono più piccoli e si formano quando il batterio
cresce in condizioni di alta pressione osmotica (es. all’interno dell’uomo
possono essere presenti i sali biliari, che sono tossici, perciò è preferibile
avere pori piccoli
I pori generati da OmpF sono più larghi e sono favoriti quando il batterio
cresce in un ambiente diluito.
I geni ompF e ompC sono parzialmente regolati da OmpR che reprime
ompF ed attiva ompC.
osmolarità
OmpF>OmpC
osmolarità
OmpF<OmpC
http://latin.arizona.edu/~mgen/micgen_98/Lect24/2comp.gif
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Regolatore
contenente un
residuo di acido
aspartico
Segnale
osmolarità
Asp
P
EnvZ
EnvZ
OmpR
P
P
Sensore contenente
un dominio istidinchinasi che si
autofosforila in
condizioni di alta
osmolarità
Asp
P
Asp
OmpR
OmpR
+
ompC
-
ompF
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OmpR media la regolazione della trascrizione dei
geni OmpF e OmpC in maniera reciproca
OmpR-P
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Come viene regolato il legame di OmpR-P a questi siti
dei promotori? OmpR fosforilato è una proteina che
lega il DNA. OmpR-P ha un duplice ruolo in quanto
può agire sia da attivatore che da repressore. Questa
proprietà è molto diffusa tra i fattori di trascrizione.
Quando la concentrazione di OmpR-P è bassa (bassa
osmolarità), esso si lega a 2 siti ad alta affinità nel
promotore di OmpF (F1 ed F2) e ne attiva la
trascrizione. Quando la concentrazione di OmpR-P
aumenta (alta osmolarità), esso può legare 3 siti a
bassa affinità presenti nel promotore di OmpC (C1, C2
e C3) e attivare la trascrizione di questo gene.
Contemporaneamente OmpR-P lega anche altri 2 siti
nel promotore di OmpF (F3 e F4), creando una
struttura che non consente la trascrizione.
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OSMOREGOLAZIONE
RISPOSTA ALLE
CONCENTRAZIONI
DI OSSIGENO
CHEMIOTASSI
REGOLAZIONE
DELLA
SPORULAZIONE
Annu. Rev. Biochem. 2000. 69:183–215
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Regolazione genica ad opera dell’RNA
antisenso: regolazione delle porine di E. coli
• Le due porine più importanti della membrana esterna sono le
proteine OmpF e OmpC.
• I pori generati da OmpC sono più piccoli e si formano quando
il batterio cresce in condizioni di alta pressione osmotica.
• I pori generati da OmpF sono più larghi e sono favoriti quando
il batterio cresce in un ambiente diluito.
• I geni ompF e ompC sono parzialmente regolati da OmpR che
reprime ompF ed attiva ompC.
• Inoltre, il gene micF produce un RNA antisenso che blocca
l’azione di ompF. L’RNA micF è infatti complementare al sito
d’inizio della traduzione di ompF e ne reprime quindi la
traduzione.
• Il gene micF viene attivato in condizioni di alta pressione
osmotica (condizione che favorisce la presenza della proteina
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OmpC).
Regolazione delle porine
geni
OmpR
mRNA
proteine
OmpC
+
ompC
5’
3’
OmpF
-
+
ompF
micF
5’
5’
3’ X
3’
Alta pressione osmotica
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Canalizzazione metabolica
• La compartimentazione, ovvero la
distribuzione differenziale di enzimi e
metaboliti in strutture cellulari o in
organelli differenti, è particolarmente
importante nei microrganismi eucariotici.
• La compartimentazione consente che
• 1. Vie metaboliche simili funzionino e
siano regolate in modo separato ma
simultaneo
• 2. Si aumenti la concentrazione di un
particolare substrato
• 3. Gli enzimi siano al posto giusto nel
momento giusto (es. fattori di
regolazione che vengono trasportati nel
nucleo solo quando servono).
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Modificazione covalente di un fattore
seguita da compartimentazione
nucleo
MSN2
INATTIVO
stress
nucleo
alte temperature
basso pH
alta osmolarità
H2O2
etanolo
fase stazionaria
MSN2
P
MSN2 è un attivatore della trascrizione di
geni importanti nella risposta allo stress
cellulare. E’ sempre presente nella
citoplasma della cellula (inattivo) e solo in
presenza di stress viene traslocato nel
nucleo, dove può attivare la trascrizione
(forma attiva).
La fosforilazione in più residui della
proteina la converte in una forma
trasportabile nel nucleo e quindi attiva.
Questo processo è regolato dalla
concentrazione di cAMP nella cellula
P
MSN2
ATTIVO
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