METODI RAPIDI PER LA DETERMINAZIONE DI AMMINE BIOGENE IN
PRODOTTI CASEARI: ESTRAZIONE MSPD ED ANALISI HPLC-ESI-MS/MS
F. Calbiani, M. Careri, L. Elviri, A. Mangia, L. Pistarà, I. Zagnoni
Dipartimento di Chimica Generale ed Inorganica, Chimica Analitica, Chimica Fisica,
Università degli Studi di Parma, Parco Area delle Scienze 17/A, 43100 Parma
Nell’ambito di studi sulla qualità e la sicurezza degli alimenti, le ammine biogene
rappresentano una classe di contaminanti che ha recentemente suscitato notevole interesse,
motivato dall’approfondimento delle conoscenze sia circa il loro ruolo fisiologico di mediatori
di vari processi metabolici, sia sulla loro capacità di agire quali induttori di reazioni allergiche
[1]. Grazie alla correlazione fra la loro concentrazione e l’entità di processi di
decarbossilazione enzimatica di origine microbica, le ammine biogene possono essere
considerate marker di contaminazione microbica di alimenti. L’elevata variabilità nel
contenuto di ammine sia tra alimenti diversi, quali carne, pesce, formaggi, birra, vino, che
all’interno di alimenti della stessa tipologia è riconducibile a diversi fattori quali il contenuto
di sali, il pH, la temperatura e la disponibilità di substrati [2].
Lo sviluppo di metodi affidabili per la determinazione di ammine biogene in matrici
alimentari quali pesce e formaggi è di notevole importanza, in quanto la presenza di queste
sostanze negli alimenti è correlata al manifestarsi di sintomi riconducibili rispettivamente alla
sindrome da “avvelenamento da sgombroidi” e alla “cheese reaction”. Questa azione si
esplica a concentrazioni delle ammine variabili da poche decine a migliaia di mg/kg in
funzione della sensibilità individuale e di fattori legati all’assunzione di determinati farmaci.
Nel presente lavoro, è stato sviluppato un metodo rapido basato sulla cromatografia liquida
abbinata alla spettrometria di massa tandem (HPLC-MS/MS) con sorgente electrospray (ESI)
per l’identificazione e la determinazione di ammine biogene, quali istamina, tiramina e βfeniletilamina (Figura 1), in campioni di formaggio fresco e formaggio stagionato.
Tiramina
β-feniletilamina
Istamina
Figura 1. Struttura chimica delle ammine biogene.
La separazione cromatografica degli analiti in oggetto è stata effettuata con meccanismo di
ripartizione a fase inversa mediante impiego di una colonna Luna C18(2) narrow-bore (250 x
2.0 mm, 5µm, Phenomenex), utilizzando quale fase mobile una miscela di metanolo e acqua
acidificata con TFA 0.1% (v/v), con eluizione in gradiente. La rivelazione ESI-MS/MS è stata
effettuata acquisendo il segnale degli ioni positivi in modalità MRM (Multiple Reaction
Monitoring) ed utilizzando gli standard deuterati degli analiti come standard interni. Al fine di
aumentare la selettività, sono state acquisite due transizioni per ciascuno degli analiti
considerati. Particolare attenzione è stata posta alla fase di trattamento del campione, per la
quale è stato valutato l’impiego di nuove tecniche di estrazione “solvent-free”.
L’applicazione della tecnica di estrazione solido/liquido per impiego di acqua acidificata per
HCl 0.1 M ha consentito di ottenere buoni risultati per entrambe le matrici. Nel caso del
formaggio stagionato, a causa dell’elevato contenuto proteico, si è resa necessaria una
successiva purificazione dell’estratto mediante filtrazione con filtri a taglio molecolare
(Centricon YM-3, 3000 MWCO, Amicon, Milllipore). Tuttavia, allo scopo di sviluppare
metodi rapidi di trattamento del campione ed al fine di ridurre il consumo di solventi e la
quantità di campione da sottoporre ad analisi, è stato sviluppato un metodo alternativo, basato
sull’impiego dell’estrazione per dispersione della matrice in fase solida (MSPD). Il metodo
sviluppato, che presenta il vantaggio di combinare l’omogeneizzazione, l’estrazione e la
purificazione in un unico stadio, consentendo di trattare direttamente campioni solidi, semisolidi e viscosi, prevede nel caso in esame l’omogeneizzazione di 0.25g di formaggio con 1g
di silice funzionalizzata con gruppi cianopropile, e la successiva eluizione con miscele
metanolo/acqua acidificata con acido formico 0.1% (v/v). L’applicabilità dei metodi MSPD
sviluppati è attestata dalle buone rese di estrazione ottenute. In particolare, nel caso del
formaggio stagionato sono stati calcolati recuperi pari a 84±10% (istamina), 91±12%
(tiramina), 117±3 % (β-feniletilamina) al livello di concentrazione di 3 mg/kg, 0.4 mg/kg e 2
mg/kg per istamina, tiramina e β-feniletilamina rispettivamente.
In conformità alle linee guida proposte dalla Eurachem [3], i metodi proposti sono stati
validati in termini di robustezza, selettività, limiti di rivelazione e quantificazione, intervallo
di linearità e accuratezza, utilizzando quale ‘bianco’ di matrice un campione di formaggio
fresco cremoso, addizionato degli analiti ad opportuni livelli di concentrazione. In particolare,
gli eccellenti limiti di rivelazione (0.05-0.25 mg/kg) e quantificazione (0.09-0.55 mg/kg)
attestano l’applicabilità del metodo per la quantificazione di ammine biogene nel formaggio a
livello di tracce.
La determinazione delle ammine biogene in campioni di formaggio stagionato ha consentito
di determinare la tiramina a concentrazione variabile da 0.21±0.03 a 16.8±1.4 mg/kg e
l’istamina da 4.3±0.2 a 12.3±0.8 mg/kg e di evidenziare una dipendenza dei livelli di
concentrazione dal tempo di stagionatura. E’ stato inoltre riscontrato un buon accordo dei dati
ottenuti con i due metodi di estrazione considerati. In Figura 2 sono illustrati i cromatogrammi
MRM delle transizioni estratte di istamina e tiramina in un campione di formaggio stagionato.
A
B
C
D
Figura 2. Cromatogrammi HPLC-ESI-MS/MS MRM delle transizioni estratte di istamina (A-B) e
tiramina (C-D) in un campione di formaggio stagionato.
Riferimenti
[1] A.R. Shalaby, Food Research Int., 7 (1996) 675.
[2] A. Halasz, A. Barath, L.S. Sarkadi, W. Holzapfel, Trends in Food Science & Technology, 51
(1994) 42.
[3] The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method Validation and
Related Topics, EURACHEM Guide, (1998) LGC, Teddington, GB; http://www.eurachem.ul.pt/
Lavoro svolto nell’ambito del Progetto COFIN 2002 (MIUR): Sicurezza degli alimenti. Nuovi metodi
di controllo per contaminanti naturali in tracce