Analisi cromatografiche (HPLC)
L’impiego di acqua ultrapura con ridotti
livelli di TOC appena prodotta migliora
le prestazioni cromatografiche
Nelle analisi di cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC),
la qualità dei risultati è influenzata dalla purezza dei solventi
utilizzati nella fase mobile. Nel presente studio sono state
confrontate acqua in bottiglia a grado HPLC reperibile
sul mercato senza alcuna specifica per quanto
riguarda il carbonio ossidabile totale (TOC) e acqua
ultrapura appena prodotta con un tenore di TOC
pari o inferiore a 5 ppb. I cromatogrammi HPLC
ottenuti dopo preconcentrazione dell’acqua
suggeriscono che alcune acque in bottiglia
a grado HPLC contengono soluti organici
in quantità di gran lunga superiore rispetto
all’acqua ultrapura appena prodotta e che
questi contaminanti possono contribuire alla
variabilità della linea di base ed alla mediocrità
delle prestazioni cromatografiche. Il presente
studio illustra anche in che modo la purezza
organica dell’acqua utilizzata come solvente
per l’eluizione in gradiente di una miscela di
principi attivi farmaceutici incide sulle prestazioni
cromatografiche nel tempo. I risultati evidenziano
i benefici dell’impiego di acqua ultrapura appena
prodotta con livelli di TOC pari o inferiori a 5 ppb per la
preparazione della fase mobile.
Maricar Tarun, Coralie Monferran, Cecilia Devaux, Stéphane Mabic
*Autore corrispondente: Stephane Mabic, Merck Millipore, Saint-Quentin-en-Yvelines, FRANCIA
[email protected]
Gli anni recenti hanno visto progressi e
sviluppi straordinari per le tecniche analitiche. Di conseguenza, gli strumenti sono
diventati sempre più sensibili e richiedono,
un maggiore livello qualitativo per reagenti
e solventi, acqua inclusa. Nell’HPLC, l’importanza della qualità dell’acqua diventa
più evidente nelle eluizioni a gradiente
su colonne in fase inversa, perché esse
richiedono l’equilibrazione con diversi
volumi colonna dell’eluente acquoso.
I contaminanti organici del solvente acquoso
tendono a venire adsorbiti in testa alla colonna e ad essere eluiti, generando picchi,
nelle successive corse in gradiente.
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Esistono diverse fasi stazionarie per HPLC, ma
l’HPLC in fase inversa è la modalità di separazione
più comunemente utilizzata(1).
Essa presenta alcune esigenze che, se non
soddisfatte, potrebbero compromettere la qualità
dei risultati, come la riduzione dei contaminanti a
livelli minimi, se non nulli. La contaminazione può
essere dovuta a diversi componenti non eluenti della
fase mobile, al campione o alla vetreria utilizzata.
Inoltre, possono essere causa di contaminazione
l’ordinario deterioramento del sistema o persino le
sostanze dell’ambiente circostante che potrebbero
trovare una via di accesso (2, 3, 4, 5, 6, 7). Secondo
McMaster, la maggior parte delle difficoltà che
si incontrano in HPLC sono dovute a problemi
di contaminazione della colonna, la cui causa
è spesso l’acqua contaminata (8). In seguito
a tale contaminazione, la linea di base può
essere caratterizzata da picchi spuri, gobbe e
avvallamenti (5, 6, 7, 9, 10).
Gli esperti di cromatografia solitamente
utilizzano solventi a grado HPLC che vengono
filtrati e degassati prima dell’uso.
Spesso, tuttavia, non si prende in considerazione un dettaglio: il fatto che l’acqua in bottiglia
a grado HPLC può contenere anche diverse
migliaia di µg/L (parti per miliardo [ppb]) di
carbonio ossidabile totale (TOC).
Il TOC è una misura di tutte le specie organiche
presenti nell’acqua (11).
Al fine di studiare l’influenza di tale contaminazione
organica sulle analisi HPLC, abbiamo condotto due
serie di esperimenti. La prima consisteva nella preconcentrazione del solvente acquoso (acqua) su una
colonna da preconcentrazione, seguita dall’eluizione
in gradiente su una colonna analitica.
Nella seconda serie di esperimenti, utilizzavamo
l’eluizione a gradiente per separare i diversi componenti di una miscela di principi attivi farmaceutici.
Tale miscela veniva iniettata ripetutamente per 1.310
volte, al fine di esaminare gli effetti a lungo termine
dell’impiego come eluente acquoso di acqua in
bottiglia a grado HPLC o di acqua ultrapura preparata
poco prima dell’analisi.
Materiali e metodi
Materiali e reagenti - Per il confronto delle linee di
base, venivano comparati due tipi d’acqua con origine
diversa: un’acqua ultrapura appena purificata da un
sistema Milli-Q® (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)
e un’acqua in bottiglia a grado HPLC. Nel secondo
esperimento, si preparava una miscela contenente
0,200 µg/mL di standard cromatografici di principi
attivi farmaceutici. Gli standard erano stati acquistati
da Alltech (Deerfield, Il, USA) sotto forma di soluzioni
in metanolo alla concentrazione di 1 mg/mL (paracetamolo, acetazolamide, carbamazepina, fenobarbital,
fenitoina, nabumetone, secobarbital).
Le fasi mobili erano acqua ed acetonitrile
preparate fresche ogni giorno.
Si utilizzavano due fonti d’acqua: acqua a grado
HPLC Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA,
U.S.A.) e acqua ultrapura appena prodotta da un
sistema Milli-Q® Advantage A10® (Merck Millipore,
Billerica, MA, U.S.A.) completo di lampada UV,
al mercurio a bassa pressione, emittente a
doppia lunghezza d’onda (185 nm e 254 nm).
Il sistema Milli-Q® includeva anche un dispositivo
A10® integrato per il monitoraggio in linea del
TOC, cartucce Q-Gard® T1 per il pretrattamento
e Quantum® TEX per il trattamento finale, cui
faceva seguito un filtro finale da 0,22 μm.
La resistività dell’acqua appena prodotta era di
18,2 MW.cm (misurata in linea e compensata a
25 °C). Al sistema Milli-Q® Advantage l’acqua d’alimentazione veniva fornita da un sistema Elix®
che operava un primo trattamento dell’acqua
combinando osmosi inversa ed elettrodeionizzazione. L’acetonitrile era di grado HPLC. Prima
dell’impiego, le fasi mobili venivano sonicate.
Sistemi cromatografici - Per il confronto delle
linee di base, il sistema HPLC utilizzato era
un cromatografo Waters Alliance ® 2695 con
rivelatore a serie di fotodiodi modello 2996.
Milli-Q® Integral System
Milli-Q® Advantage
Il sistema HPLC impiegato per le iniezioni ripetute della miscela di principi attivi farmaceutici
era una pompa per HPLC 510 Waters (Waters
Corp., Milford, MA, U.S.A.) con autocampionatore
717 plus e rivelatore a serie di fotodiodi 996
impostato a 190-400 nm.
Si utilizzavano colonne RP18 SymmetryShield™
(4.6 x 150 mm, 3,5 µm) Waters.
Procedura - Per il confronto delle linee di base,
l’acqua veniva prima preconcentrata su una
colonna C18 XTERRA® (4,6 x 30 mm, 3 µm) per
60 min. a 1 mL/min, scartando l’eluato.
Dopo la preconcentrazione, alla colonna
XTERRA ®veniva connessa una colonna C18
Atlantis® (2,1 x 150 mm, 3 µm) e si utilizzava
il seguente gradiente per eluire eventuali
Sistema Elix® Advantage
molecole organiche adsorbite sulla colonna
XTerra®: acqua da 100% a 0% in 30 min, per
10 min. acqua allo 0%. La velocità del flusso
era di 0,25 mL/min.
Per lo studio sul lungo termine, si utilizzavano
unità filtranti Millex®-LCR (Merck Millipore) (0,45
µm, 13 mm) per filtrare la miscela di principi
attivi, prima di iniettarne campioni di 25 µL.
Per separare i componenti della miscela, si
ricorreva al seguente gradiente: acqua da 80%
a 30% in 15 min, da 30% a 80% in 1 min, quindi
acqua all’80% per 4 min.
La velocità del flusso era di 1 mL/min. Per
studiare gli effetti dei due tipi d’acqua della
fase mobile si utilizzavano due diverse colonne,
identiche tra loro.
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Analisi cromatografiche (HPLC)
Figura 1: Cromatogrammi a 254 nm (a) e 214 nm (b) di acqua in bottiglia a grado HPLC e di acqua ultrapura appena prodotta, dopo
preconcentrazione. La seconda genera linee di base più pulite. Si noti la differenza di scala tra (a) e (b).
Risultati e discussione
Confronto della linea di base ottenuta con l’acqua
a grado HPLC e con l’acqua ultrapura a ridotto
livello di TOC Nella prima serie di esperimenti, si
ipotizzava che durante l’ora della fase di preconcentrazione, ogni contaminante organico presente
nell’acqua venisse adsorbito in testa alla colonna,
per venire poi eluito fuori dalla colonna nel corso
dell’eluizione, generando picchi nel cromatogramma.
La Figura 1 mostra il maggiore livello di contaminazione organica nell’acqua in bottiglia a
grado HPLC.
Entrambe le Figure 1a (a 254 nm) e 1b (a 214
nm) mostrano che l’acqua in bottiglia a grado
HPLC generava un maggior numero di picchi,
alcuni dei quali fino a 15 volte più intensi di
quelli prodotti dalla preconcentrazione dell’acqua
ultrapura fresca.
Purification Pack
Filtro LCR
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Effetti a lungo termine dell’acqua in bottiglia
a grado HPLC e dell’acqua ultrapura a ridotto
tenore di TOC nella fase mobile - Per la seconda
serie di esperimenti, le Figure 2 (254 nm) e 3 (214
nm) mostrano i cromatogrammi corrispondenti alle
iniezioni 50, 290, 530, 770, 1010 e 1310.
Si può notare una differenza significativa nella
deriva della linea di base. Sebbene nell’eluizione
a gradiente ci si attendesse una deriva della linea
di base, specialmente alle basse lunghezze
d’onda, l’ampiezza e la variabilità della deriva
osservata utilizzando acqua in bottiglia a grado
HPLC (Figura 2a) fa pensare che nel tempo i
contaminanti si siano accumulati nella colonna.
Per contro, utilizzando acqua pura da poco prodotta
(Figura 2b), non si osservava uno scostamento così
variabile della linea di base. Un’altra differenza tra
le due tipologie di acqua è la comparsa di picchi
estranei quando si utilizzava acqua in bottiglia a
grado HPLC, un’ulteriore indicazione di contaminazione organica della fase mobile acquosa.
La presenza di picchi estranei in un cromatogramma è grave nel caso si stiano analizzando
campioni contenenti sostanze sconosciute. Il(I)
picco(i) estraneo(i) potrebbe(ro) essere confuso(i)
con un(dei) componente(i) del campione, oppure
coeluire con un(degli) analita(i), generando
problemi nella quantificazione.
Quando si utilizzava acqua a grado HPLC, cominciavano ad apparire picchi estranei sia nei cromatogrammi
a 254 nm (a ~5 min. per l’iniezione 770) che a 214
nm (a ~15 min. per l’iniezione 530), come mostrano
le Figure 2a e 3a. L’area sottesa dal picco con tempo
di ritenzione ~5 min. in Figura 2a è più del triplo
rispetto a quella del fenobarbital (picco 3) e più del
doppio di quella della fenitoina (picco 5). Prima di
ogni iniezione in HPLC a gradiente, la colonna deve
essere equilibrata nelle condizioni iniziali. Solitamente
ciò richiede da 5 a 10 volumi colonna della fase
mobile iniziale(12), che corrispondono ad almeno due
ordini di grandezza superiori rispetto al volume di
iniezione del campione(9). Nell’esperimento descritto,
il volume di equilibrazione corrisponde a 200 volte il
volume del campione iniettato.
In seguito ad una equilibrazione così estesa, non è
pertanto sorprendente che i contaminanti contenuti
in tracce nella fase mobile acquosa possano causare interferenze significative nei cromatogrammi.
Se l’analisi HPLC è utilizzata per l’identificazione
dei picchi e/o la quantificazione di analiti presenti
in piccole quantità, picchi indesiderati nel rumore
di fondo dovuti a una contaminazione della fase
mobile possono ridurre l’accuratezza, la precisione
e/o la sensibilità del metodo, compromettendo
l’identificazione o la quantificazione dei picchi.
Nel peggiore dei casi, i cromatogrammi possono
essere assolutamente non interpretabili a causa
della rumorosità della linea di base e della presenza
di picchi estranei. Il risultato di entrambi gli esperimenti suggerisce che l’acqua ultrapura appena
prodotta è una fonte eccellente per la preparazione
delle fasi mobili per HPLC. In questo tipo d’acqua, il
livello di contaminazione organica è mantenuto a
livelli minimi (≤ 5 ppb) e monitorato utilizzando un
dispositivo per la misura del TOC in linea.
Di contro, i livelli di contaminazione organica
nell’acqua in bottiglia possono variare in modo significativo tra un produttore e l’altro, con alcune delle
bottiglie testate contenenti livelli di TOC addirittura
pari a 777 ppb(1, 12). Questa variabilità può essere
spiegata da diversi fattori: le tecnologie utilizzate
per preparare l’acqua, le condizioni del laboratorio
o del sito produttivo durante l’imbottigliamento ed il
confezionamento, i materiali di fabbricazione scelti
per la bottiglia ed il tappo e il tempo di stoccaggio
della bottiglia prima dell’impiego.
Figura 2: Cromatogrammi (254 nm) di una miscela di principi attivi con eluente acquoso costituito da acqua in bottiglia a grado HPLC
(a) e acqua ultrapura da poco prodotta (b). L’eluente organico era acetonitrile a grado HPLC. Picchi: 1: paracetamolo, 2:
acetazolamide, 3: fenobarbital, 4: carbamazepina, 5: fenitoina, 6: secobarbital, 7: nabumetone.
Figura 3: Cromatogrammi (214 nm) di una miscela di principi attivi con eluente acquoso costituito da acqua in bottiglia a grado HPLC
(a) e acqua ultrapura da poco prodotta (b). L’eluente organico era acetonitrile a grado HPLC. Picchi: 1: paracetamolo, 2: acetazolamide,
3: fenobarbital, 4: carbamazepina, 5: fenitoina, 6: secobarbital, 7: nabumetone.
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Produzione di acqua ultrapura a ridotto tenore
di TOC - Nell’acqua ultrapura, il tenore costantemente ridotto del TOC deriva dalla combinazione
di diverse tecnologie di purificazione tra loro
complementari. L’osmosi inversa elimina dall’80
al 90% del carico organico in ingresso ed è
seguita dall’elettrodeionizzazione che rimuove
efficientemente le specie cariche, cioè gli ioni
organici ed inorganici. L’elettrodeionizzazione
è complementare all’osmosi inversa per la
rimozione dei contaminanti organici, perché
elimina eventuali acidi ed ammine organiche di
piccole dimensioni che potrebbero attraversare
i pori delle membrane da RO. L’adsorbimento
dei contaminanti organici sul carbone attivo è
un terzo metodo che contribuisce a ridurre la
concentrazione organica dell’acqua. Il quarto
processo che riduce la concentrazione organica
nell’acqua è la fotossidazione UV. Questa tecnologia ossida le molecole per mezzo dei
radicali ossidrile generati a partire dall’acqua
e dall’ossigeno in seguito all’irradiazione con
una lampada UV a doppia lunghezza d’onda
(185/254 nm) (13). La fotossidazione UV è generalmente utilizzata alla fine del processo di
purificazione, una volta che il carico organico sia
già stato ridotto tramite le altre tecniche sopra
menzionate. La combinazione di tali tecniche
consente di raggiungere livelli di contaminazione organica costantemente ridotti (TOC ≤ 5 ppb)
nell’acqua erogata dall’unità di purificazione.
Altre considerazioni per analisi HPLC ben
riuscite - Se la qualità dell’acqua utilizzata
per preparare le fasi mobili per le analisi HPLC
è di fondamentale importanza, un impiego
appropriato ed un’adeguata manutenzione del
sistema e della colonna utilizzati, oltre all’attuazione di idonee procedure per la preparazione
dei campioni, sono altrettanto importanti per
assicurarsi la buona riuscita degli esperimenti
HPLC. È stato dimostrato che i contaminanti
presenti in tracce nella fase mobile organica
(acetonitrile, metanolo) ed i modificatori (come
acido trifluoroacetico [TFA]) contribuiscono ai
picchi del rumore di fondo(9).
Se non si presta cura nella preparazione delle
soluzioni che costituiscono la fase mobile
(impiego di contenitori o tappi in plastica,
pellicola in paraffina, guanti), si rischia di
introdurvi ftalati ed altre specie che assorbono
gli UV. Pertanto, non solo è importante disporre
di una fonte affidabile di solventi ad elevata
purezza, ma anche ricorrere a buone pratiche
di laboratorio.
Conclusione
Questo studio ha dimostrato che l’acqua ultrapura con ridotti
livelli di TOC da poco prodotta è affidabile per la preparazione
di fasi mobili per HPLC. Preconcentrando su una colonna
C18 acqua in bottiglia a grado HPLC ed eluendola, quindi,
in gradiente, si ottenevano diversi picchi.Tali picchi non erano
presenti utilizzando acqua ultrapura da poco prodotta, il
che conferma che la prima dei due tipi di acqua contiene
contaminanti organici a livelli di gran lunga superiori rispetto
alla seconda. Nell’HPLC a fase inversa, una tipica eluizione
in gradiente richiede l’equilibrazione della colonna nelle
condizioni iniziali con diversi volumi colonna del solvente
debole (acquoso). I contaminanti organici del solvente
acquoso vengono adsorbiti in testa alla colonna e causano
interferenze nei successivi cromatogrammi, come deriva della
linea di base e presenza di picchi estranei. Inoltre, quando
si utilizzava acqua in bottiglia a grado HPLC come eluente
acquoso per la separazione di una miscela di principi attivi,
nel tempo si osservava un’ampia deriva della linea di base
e la presenza di picchi estranei.Tali fenomeni possono essere
attribuiti alla presenza di contaminanti nell’acqua. Utilizzando
acqua ultrapura da poco prodotta, essi non si manifestavano.
Per concludere, questo studio ha dimostrato che l’acqua
ultrapura con livelli di TOC costantemente ridotti appena
prodotta genera linee di base più costanti e minimizza il
rischio della presenza di picchi estranei.
Riferimenti bibliografici
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