Analisi
molecolare
dei geni
Denaturazione e rinaturazione di una molecola di
DNA
Si rompono i legami idrogeno
100°C
Denaturazione del DNA
Rinaturazione per
riassociazione delle
sequenze
complementari
Ogni frammento di DNA ha una caratteristica
temperatura di fusione (Tm-> melting temperature)
…
Maggiore e’ il contenuto
delle G C, maggiore e’ la
Tm
Tm-> temperatura alla quale meta’ delle molecole di DNA sono
denaturate in singoli filamenti
Effetto ipercromico delle basi nucleotidiche,
all’aumentare della separazione dei due
filamenti aumenta la OD a 260nm
Applicazioni sperimentali della
complementarietà delle basi
Le cinetiche di riassociazione suggeriscono che il DNA umano e’
formato da:
fast
Cinetica di
rinaturazione
del genoma
umano
intermediate
slow
Fast: DNA altamente ripetuto, presente in
numerose copie (trasposoni inattivi, copie
geniche inattive, ripetizione di sequenze
semplici, sequenze ripetute in tandem,
duplicazioni segmentali)
Intermediate: DNA mediamente ripetuto
Slow: DNA presente in sequenze uniche
Composizione del genoma umano
PCR
(Polymerase Chain Reaction o reazione a
catena della polimerasi)
1
Gene a sequenza nota
La
PCR
permette
l’amplificazione di un
milione di volte o piu’ di
una sequenza specifica
di DNA che e’ gia’ nota o
di cui sono note delle
piccole
sequenze
all’estremita’ del gene
2
La possibilita’ di conoscere i geni
deriva dalla capacita’di manipolarli:
-isolare un gene (enzimi di restrizione)
-clonaggio (amplificazione)
vettori
-sequenziamento
-funzione
VETTORE
PLASMIDICO
-si replica
autonomamente
rispetto al
cromosoma
batterico
-possiede un
polylinker
-possiede un
marcatore di
selezione
Vettore di espressione
Oligonucleotidi o primers
Oligonucleotidi o primers
PCR
(Polymerase Chain Reaction)
DNA polimerasi
dNTP
Mg2+
Reazione 2n dove n=numero di cicli
Si possono ottenere informazioni sulla sequenza a
partire da ridottissime quantita’ di DNA come sangue,
capelli, etc
Southern/Northern Blot
Ibridazione
con sonda
di DNA
- PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA
CERCANDO
- PER OSSERVARE LA PRESENZA DI UN TRANSGENE INSERITO
NEI CROMOSOMI (PRESENZA O ASSENZA)
- PER OSSERVARE TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE
- PER OSSERVARE LE DIMENSIONI DEL TARGET (NON
OSSERVABILI CON ALTRE TECNICHE)
- PER OSSERVARE LA COLLOCAZIONE SUBCROMOSOMICA O
NEL TESSUTO O NELLA CELLULA DEL TARGET
DETERMINAZIONE DI RFLP PATOGENI
Anemia falciforme
RFLP (Restriction fragment lenght polymorfism) polimorfismo dovuto
a differenze di dimensione di frammenti di restrizione allelici causati
dalla presenza o assenza di un sito di restrizione
Applicazione del DNA ricombinante: Diagnosi
dell’anemia falciforme tramite Southern Blot
La
mutazione
abolisce il
sito MstII
Ibridazioni in situ
Il sequenziamento del DNA (Sanger)
Determinazione della
sequenza nucleotidica
del DNA
il metodo di Sanger 2’-3’
DIDEOSSINUCLEOTIDI
DNA stampo
DNA polimerasi
dNTP
primer marcato
Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti
separati di un gel di poliacrilammide
*
Indica il primer (lungo 15 nucleotidi)
** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella
dei ddNTP in ciascuna provetta
Sequenziamento del DNA:
il metodo di Sanger
pozzetti
autoradiogramma
Si legge la sequenza mano mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il
nucleotide G è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15
nucleotidi)) all’estremità 5’ mentre il nucleotide T è all’estremità 3’.
5’GCTCCACGTAACGT3’ Questa sequenza è complementare al
filamento stampo.
ddNTP marcati
con fluorofori
cromatogramma
Mappe fisiche di molecole di DNA basate su taglio di
enzimi di restrizione (Mappe di Restrizione)
Un Sito di restrizione o sequenza
consenso viene definito come una
particolare sequenza di DNA
riconosciuta da un enzima di
restrizione o endonucleasi come il
punto in cui tagliare la molecola di
DNA. Questi siti sono generalmente
palindromici e con una sequenza ben
precisa.
Gli enzimi di restrizione sono degli enzimi che i batteri
utilizzano per difendersi dagli attacchi di un DNA estraneo
Frammenti di restrizione
La mobilita’ di ciascun fammento e’ inversamente proporzionale
al logaritmo della sua lunghezza
Mappe di
restrizione
Rappresentano
delle
mappe fisiche del DNA
in
cui
i
siti
di
restrizione fungono da
marcatori. Forniscono
le reali distanze in
coppie di basi tra 2 geni
elettroforesi
A COSA SERVE L’ANIMALE
TRANSGENICO?
• RIPRODUZIONE DI MODELLI DI MALATTIE UMANE IN TOPI
• ANALISI IN VIVO DELLA FUNZIONE O MANCANZA DI UN GENE
(analisi di ridondanza, fenotipica, sviluppo etc.)
• DETERMINAZIONE DI APPROCCI FARMACOLOGICI IDONEI
SPERIMENTABILI SU ANIAMALI CHE RIPRODUCONO LA
PATOLOGIA UMANA
• ANIMALE TRANSGENICO COME “BIOREATTORE” O
PRODUTTORE DI PROTEINE UMANE DA POTER PURIFICARE E
USARE COME FARMACO
Animali
transgenici
fondatori
fondatori
progenie
MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI
ANIMALI CHIMERICI e le CELLULE STAMINALI
EMBRIONALI
blastocisti
Cellule embrionali
PROPRIETA’ DELLE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI
(ES)
• Possono dividersi illimitatamente in modo simmetrico senza
differenziare
• Mantengono un normale corredo cromosomale
• Producono cellule di tipo ecto-meso ed endodermico
• Si integrano in tutti i tessuti fetali durante lo sviluppo
• Colonizzano la linea germinale per originale le cellule delle gonadi
• Sono clonogeniche, ovvero da una singola cellula si origina una colonia
di cellule geneticamente identiche
• Esprimono il fattore di trascrizione Oct-4, che attiva una serie di geni
che mantengono la cellula in uno stato proliferativo e indifferenziato
• Posono essere indotte a proliferare o differenziare
• Spendono la maggior parte del loro ciclo cellulare nella fase S e non
necessitano di stimoli esterni per proliferare
• Non mostrano inattivazione dell’X
Vantaggio nell’uso delle ES
- Possono essere sottoposte a diverse manipolazioni
genetiche prima di reiniettarle nella blastocisti
ricevente
- Il transgene puo’ essere coespresso insieme ad un
gene marcatore (neo) che consente di selezionare
solo le cellule contenenti il transgene
(importante soprattutto nei casi di mutagenesi
mirata in cui deve avvenire ricombinazione
omologa)
a
b
Progenie con
cellule
germinali
portatrici del
transgene
Eredita’ mendeliana
del transgene
Cellule germinali
aploidi
50% +
50% -
Come introdurre il transgene
nella cellula zigote o nelle
cellule staminali embrionali?
•INIEZIONE NEL PRONUCLEO DI PLASMIDI
INEFFICIENTE E COSTOSO
• ONCORETROVETTORI MoMLV
SILENZIAMENTO DEL VETTORE DURANTE LO SVILUPPO
• LENTIVETTORI
NON SOGGETTI A SILENZIAMENTO