Nucleotidi e acidi nucleici
I nucleotidi rappresentano la forma di energia corrente che
viene utilizzata nelle attività metaboliche.
I nucleotidi sono segnali chimici.
I nucleotidi sono i componenti strutturali di un certo numero
di cofattori enzimatici.
I nucleotidi sono i costituenti degli acidi nucleici.
Struttura dei nucleotidi
Purina o
Pirimidina
Fosfato
Pentosio
Nei deossiribonucleotidi il gruppo ossidrilico -OH nella posizione 2’ (-OH)
viene sostituito da un atomo di idrogeno.
L’atomo di carbonio anomerico è legato all’atomo di azoto di un’amina mediante
un legame N-glicosidico.
Legame N-glicosidico
I legami N-glicosidici hanno una configurazione β in quasi tutte le biomolecole
naturali
Pirimidina
Purina
Adenina
Guanina
Purine
Citosina
Timina
(DNA)
Pirimidine
Uracile
(RNA)
Conformazioni del ribosio
Aldeide
β-Furanosio
L’anello ribofuranosico può esistere in quattro diverse conformazioni
Quattro dei cinque atomi sono coplanari; il quinto (il C-2’ o il C-3’) può
essere sullo stesso lato del piano in cui si trova l’atomo C-5’ (conformazione
endo); oppure sul lato opposto (conformazione eso).
Deossiribonucleotidi
Deossiadenilato
(deossiadenosina
5’-monofosfato)
Deossiguanilato
(deossiguanosina
5’-monofosfato)
Deossitimidilato
(deossitimidina
5’-monofosfato)
Deossicitidilato
(deossicitidina
5’-monofosfato)
Deossiguanosina
Deossitimidina
(o timidina)
Deossicitidina
Simboli:
Deossiadenosina
Ribonucleotidi
Adenilato (adenosina
5’-monofosfato)
Guanilato (guanosina
5’-monofosfato)
Uridilato (uridina
5’-monofosfato)
Deossicitidilato (citidina
5’-monofosfato)
Simboli:
Adenosina
Guanosina
Uridina
Citidina
Il DNA e l’RNA possono contenere piccole quantità di altre basi meno comuni.
Basi minori del DNA
deossiribosio
deossiribosio
5-metilcitidina
N6-Metiladenosina
deossiribosio
N2-Metilguanosina
deossiribosio
5-Idrossimetilcitidina
Basi minori del’RNA
Ribosio
Ribosio
Inosina
Pseudouridina
Ribosio
7-Metilguanosina
Ribosio
4-Tiouridina
Le cellule contengono anche nucleotidi con gruppi fosforici in posizioni
diverse dalla 5’.
Adenina
Adenina
Adenosina 5’-monofosfato
Adenina
Adenosina 3’-monofosfato
Adenosina 2’-monofosfato
Adenina
Adenosina 2’, 3’-monofosfato
ciclico
Negli acidi nucleici i nucleotidi sono uniti da legami fosfodiesterei
Ponte
fosfodiestere
L’estremità 5’ manca
di un nucleotide nella
posizione 5’.
I nucleotidi del DNA e dell’RNA sono
uniti tra loro in successione mediante
“ponti” covalenti tra gruppi fosforici, in
cui il gruppo ossidrilico 5’ di un’unità
necleotidica è unito al gruppo ossidrilico
3’ di quella successiva, formando un
legame fosfodiestere.
Lo scheletro covalente degli acidi
nucleici è costituito da un’alternanza di
gruppi fosforici e di residui di pentosio,
mentre le basi azotate possono essere
considerate come gruppi laterali uniti
allo scheletro.
L’estremità 3’ manca
di un nucleotide nella
posizione 3’.
Lo scheletro covalente del DNA e
dell’RNA è idrofilico.
Lo scheletro covalente del’RNA, ma non quello del DNA, viene idrolizzato
rapidamente in ambiente alcalino.
Il gruppo ossidrilico in posizione 2’ partecipa al processo idrolitico.
Derivato
2’, 3’-monofosfato
ciclico
Miscela di derivati
2’- e 3’-monofosfato
L’assenza
del
gruppo
ossidrilico sull’atomo di
carbonio 2’ nel DNA
aumenta la sua resistenza
all’idrolisi.
RNA
accorciato
Rappresentazione schematica di una sequenza nucleotidica
Le basi azotate
Le purine e le pirimidine sono composti moderatamente basici e per questo
motivo vengono chiamate basi.
Le risonanze che coinvolgono numerosi atomi degli anelli delle basi azotate
conferiscono alla maggior parte dei legami un carattere di parziale doppio
legame.
Le pirimidine sono pertanto molecole planari e le purine presentano solo un
leggero ripiegamento.
Le basi puriniche e pirimidiniche libere possono esistere in due o più forme
tautomeriche a seconda del pH della soluzione.
Lattame
Lattime
Doppio lattime
Forme tautomeriche dll’uracile;
la forma predominante a pH 7 è la forma lattamica.
Strutture delle basi azotate costituenti degli acidi nucleici nelle loro forme
tautomeriche predominanti a pH 7:
Adenina
Guanina
Purine
Citosina
Timina
(DNA)
Pirimidine
Uracile
(RNA)
Sempre per effetto della risonanza, tutte le basi assorbono la luce UV, e
gli acidi nucleici sono caratterizzati proprio da un elevato assorbimento della
luce a una lunghezza d’onda intorno a 260 nm.
Le basi azotate (2)
Le purine e le pirimidine sono molecole idrofobiche e relativamente poco solubili
in acqua ad un pH neutro.
Le interazioni di impilamento idrofobico, in cui i piani degli anelli di due o più
basi si vengono a trovare in posizioni parallele, l’una sopra all’altra,
rappresentano uno dei due principali sistemi di interazione tra le basi.
I gruppi funzionali più importanti delle basi puriniche sono gli atomi di azoto
degli anelli, i gruppi carbonilici e i gruppi amminici esociclici.
I legami idrogeno nelle coppie di basi definite da Watson e Crick.
Timina
Adenina
Citosina
Guanina
Il DNA conserva l’informazione genetica
L’esperimento di Griffith
Batterio utilizzato: Ceppo S (capsulato, virulento) di
Streptococcus pneumoniae
Batterio utilizzato: Ceppo R (non capsulato, e non virulento) di
Streptococcus pneumoniae
L’esperimento di Avery-MacLeod-McCarty (1944)
Il fattore trasformante di Griffith era DNA
Il trattamento del DNA con enzimi proteolitici non distruggeva la sua capacità
trasformante, il trattamento con deossiribonucleasi sì.
L’esperimento di Hershey-Chase (1952)
L’esperimento di Hershey-Chase (1952)
La conferma dei risultati venne
quando altri campioni di batteri e
di particelle fagiche marcate
furono incubati insieme per periodi
di tempo più lunghi, in modo da
ottenere una generazione di
particelle virali.
La progenie di particelle T2 non
conteneva 35S, mentre conteneva
ancora il 32P.
Il DNA, e non le proteine, era
trasmesso da una generazione
virale all’altra.
L’informazione ereditaria dei virus
era contenuta nel DNA.
“Regole di Chargaff” (Erwin Chargaff, fine degli anni ‘40)
1) La composizione in basi varia da una specie all’altra.
2) Le molecole di DNA isolate da tessuti diversi della stessa specie hanno la
stessa composizione in basi.
3) La composizione in basi del DNA di una data specie non si modifica con l’età
dell’organismo, con lo stato nutrizionale o in seguito a variazioni dell’ambiente
4) In tutte le molecole di DNA, indipendentemente dalla specie cui appartiene:
Rosalind Franklin e Maurice Wilkins analizzarono all’inizio degli anni ‘50 i
cristalli di DNA con il metodo della diffrazione dei raggi X.
Risultati:
I polimeri di DNA erano elicoidali con 2 periodicità lungo il loro asse:
una primaria di 3,4 Å e una secondaria di 34 Å.
La struttura primaria di un acido nucleico è la sua struttura covalente
Qualsiasi struttura stabile e regolare
nucleotidi di un acido nucleico può
secondaria
assunta
essere
da una parte o da tutti i
considerata come struttura
Il complesso ripiegamento di un cromosoma all’interno del nucleoide
batterico o della cromatina degli eucarioti viene in genere considerato come
struttura terziaria
Nel 1953 James D. Watson e Francis Crick proposero un modello tridimensionale della
struttura del DNA che poteva spiegare tutte le proprietà sino ad allora note.
Il DNA è costruito da due catene elicoidali avvolte intorno allo stesso asse per formare una
doppia elica destrorsa.
Lo scheletro covalente idrofilico, composto da un’alternanza di deossiribosio e gruppi
fosforici, è all’esterno della doppia elica, in contatto con l’ambiente circostante.
L’anello furanosico di ogni residuo di deossiribosio è nella conformazione C-2’ endo.
Le basi puriniche e pirimidiniche sono impilate all’interno della doppia elica con le loro
strutture planari ad anello poste in posizione praticamente perpendicolare al lungo asse
longitudinale della molecola.
La relazione spaziale che si crea tra le catene genera una scanalatura maggiore (o solco
maggiore) e una scanalatura minore (o solco minore) sulla superficie della doppia elica.
Ogni base nucleotidica di una catena è appaiata sullo stesso piano con una base dell’altra
catena (G≡C; A=T).
Le due catene dell’elica sono antiparallele.
Modello di Watson e Crick della struttura del DNA
Solco
minore
Solco
maggiore
Il modello originale proponeva che
vi fossero 10 coppie di basi oppure
34 Å per ogni giro dell’elica.
Misure
successive
hanno
dimostrato che in ogni giro d’elica
vi sono 10,5 coppie di basi e 36 Å.
Modello a bastoncini e modello spaziale.
La doppia elica del DNA viene
tenuta insieme da due gruppi di
forze:
I legami idrogeno tra coppie di basi
complementari
Le interazioni tra le basi impilate.
A causa del fatto che i legami glicosidici non sono diametralmente opposti l’uno
all’altro, ciascuna coppia di basi ha un lato più esteso che delimita la scanalatura
maggiore e un lato meno esteso che delimita la scanalatura minore
I solchi maggiore e minore sono caratterizzate da potenziali
donatori (in blu) e accettori (in rosso) di legami idrogeno.
Le molecole degli acidi nucleici a doppia elica
contengono due infossature, o scanalature,
dette rispettivamente scanalatura (o solco)
maggiore e scanalatura (o solco) minore.
Il solco maggiore presenta più caratteristiche che differenziano una coppia di
basi dall’altra rispetto al solco minore.
Le dimensioni più ampie della scanalatura maggiore nel DNA-B rendono questa
struttura maggiormente accessibile alle interazioni con
proteine che riconoscono sequenze specifiche del DNA
Vista assiale del DNA
Nella doppia elica le basi sono impilate una sull’altra
Replicazione del DNA suggerita da Watson e Crick
Catena
nuova
Catena
nuova
Catena
preesistente
(progenitrice)
Catena
figlie
Catena
preesistente
(progenitrice)
Sono
state
descritte
numerose
deviazioni dalla struttura del DNA
descritta da Watson e Crick (forma B
del DNA).
Le variazioni strutturali dipendono da
tre fattori:
1) Una conformazione diversa del
deossiribosio.
2) Rotazioni intorno ai legami contigui
che fanno parte dello scheletro i
fosfodeossiribosio.
3) Rotazione libera intorno al legame N-glicosidico sul C-1’.
sin-Adenosina
anti-Adenosina
anti-Citidina
A causa di costrizioni steriche, i nucleotidi purinici e pirimidinici possono
assumere solo 2 conformazioni stabili rispetto al deossiribosio, chiamate sin e
anti.
Le pirimidine sono in genere nella conformazione anti a causa di interferenze
steriche tra lo zucchero e l’ossigeno carbonilico sul C-2.
La struttura proposta da
Watson e Crick (forma B del
DNA) è quella più stabile per
una molecola di DNA con
sequenza casuale e in condizioni
fisiologiche.
Confronto tra le tre varianti strutturali del DNA
La forma A del DNA (a)
La forma A è favorita in condizioni povere
di acqua.
•Il DNA è sempre organizzato in una
doppia elica destrorsa.
• L’elica è un po’ più larga e più corta
dell’elica B.
•Le coppie di basi sono maggiormente
ruotate rispetto all’asse dell’elica in
confronto a quelle della forma B, che sono
quasi perpendicolari.
•Il numero di coppie di basi per giro
d’elica è 11 invece di 10,5.
La forma A del DNA (b)
Molte delle differenze strutturali esistenti tra il DNA-B e
il DNA-A derivano da una diversa compattazione delle
loro unità di ribosio.
Nel DNA-A l’atomo di carbonio in posizione 3’ si trova
fuori dal piano della molecola formato dagli altri quattro
atomi dell’anello furanosico (conformazione endo-C-3’).
Nel DNA-B è invece il carbonio in posizione 2’ a trovarsi
fuori dal piano (conformazione endo-C-2’).
La maggiore vicinanza delle strutture endo-C-3’ nel
DNA-A determina una inclinazione di 19o delle coppie di
basi.
I gruppi fosforici e altri gruppi dell’elica di tipo A legano
meno molecole di acqua rispetto a quelli del DNA-B. La
disidratazione quindi favorisce la forma A.
La modificazione strutturale presente nel DNA A rende
più profondo il solco maggiore e meno profondo il solco
minore.
L’elica di tipo A non è presente solo nel DNA disidratato.
Le regioni a doppia catena di RNA e alcuni ibridi
RNA-DNA adottano una forma a doppia elica
simila a quella del DNA-A.
La
posizione del gruppo ossidrilico lagato
all’atomo di carbonio 2’ del ribosio impedisce
all’RNA di formare un’elica classica B del tipo di
Watson e Crick a causa dell’ingombro sterico.
L’atomo di ossigeno in posizione 2’ si
avvicinerebbe troppo ai tre atomi del gruppo
fosforico adiacente e a uno degli atomi della base
successiva.
In un’elica di tipo A l’atomo di ossigeno in
posizione 2’ è rivolto verso l’esterno, lontano
dagli altri atomi.
Il DNA-Z è una doppia elica sinistrorsa nella quale lo scheletro zucchero-fosfato
è disposto a zigzag
La forma Z del DNA è radicalmente diversa dalla forma B
La differenza più evidente è la rotazione dell’elica in senso sinistrorso.
Vi sono 12 coppie di basi per giro d’elica e la struttura appare più sottile ed
allungata.
La forma Z del DNA
Lo scheletro covalente azzume un andamento a zig -zag.
Alcune sequenze nucleotidiche si ripiegano in eliche Z sinistrorse molto più
facilmente di altre (es.: purine alternate a pirimidine).
Sono necessarie concentrazioni elevate di sali per ridurre al minimo le
repulsioni elettrostatiche tra i gruppi fosforici dello scheletro, che nella
ztruttura Z sono più vicini gli uni agli altri.
I residui di purina devono “saltare” alla conformazione sin, alternandosi a
residui di pirimidina nella conformazione anti.
Il solco maggiore è appena accennato e il solco minore è stretto e profondo.
Confronto tra le forme A, B e Z del DNA
Forma A
Forma B
Forma Z
Destrorsa
Destrorsa
Sinistrorsa
≈ 26 Å
≈ 20 Å
≈ 18 Å
Coppie di basi per
ogni giro d’elica
11
10,5
12
Distanza tra base e
base
2,6 Å
3,4 Å
3,7 Å
Piegamento delle basi
normale all’asse
dell’elica
200
60
70
Conformazione dello
zucchero
C-3’-endo
C-2’-endo
Anti
Anti
Senso dell’elica
Diametro
Conformazione del
legame glicosidico
C-2’-endo per le
pirimidine;
C-3’-endo per le
purine
Anti per le
pirimidine; sin per le
purine
Alcune sequenze di DNA adottano strutture insolite.
Un palindromo è una parola che risulta la stessa letta in una direzione o in
quella inversa (es.: OSSESSO).
Il termine viene applicato alle regioni di DNA di in cui vi sono ripetuti invertiti
di una sequenza di basi con una doppia simmetria presente nelle due catene del
DNA
Quando la sequenza è presente in ciascuna catena, la sequenza viene detta
ripetuto speculare.
Ripetuto speculare
Un palindromo può formare strutture a forcina e a forma di croce.
Struttura a forcina (hairpin)
Struttura a croce
I nucleotidi che partecipano all’appaiamento tipo Watson e Crick possono
formare altri legami idrogeno con gruppi disposti nel solco maggiore.
Un residuo di citidina (se protonato) può appaiarsi a una guanosina di una
coppia C≡G, e la timina può appaiarsi a un’adenosina di una coppia A=T
Appaiamento tipo Hoogsteen
L’appaiamento di Hoogsteen consente di formare DNA triplex.
Le strutture triplex si possono formare in lunghe sequenze contenenti in una
data catena solo pirimidine o solo purine.
Sequenze ricche in residui guanosinici possono formare tetraplex
o
o
DNA H
Tripla elica
Un’organizzazione insolita del DNA, nota con il nome di DNA H, si può formare
in tratti di polipirimidine/polipurine che contengono anche all’interno della
sequenza ripetuti speculari.
Questa struttura produce un brusco ripiegamento del DNA.
mRNA dei procarioti
mRNA monocistronico
mRNA policistronico
Molti RNA hanno strutture tridimensionali complesse
Per l’RNA non esiste una semplice struttura
secondaria che rappresenti un punto di
riferimento per la sua struttura, come accade
per la doppia elica del DNA
Le interazioni deboli, in particolare le
interazioni idrofobiche tra le basi impilate, sono
determinanti per la stabilità della struttura.
Quando sono presenti sequenze complementari,
la struttura predominante è una doppia elica
destrorsa nella forma A.
Struttura elicoidale destrorsa
di una catena singola di RNA
dettata dalle interazioni create
dall’impilamento delle basi
Possibile struttura secondaria dell’RNA M1, un componente dell’enzima
Rnasi P1 di E. coli.
L’RNA si può appaiare a catene
complementari di DNA o di RNA.
Le regole sono le stesse del DNA:
La G si appaia con la C
La A con la U (o con la T,
occasionalmente presente nell’RNA).
Un’eccezione è l’appaiamento della G
con la U, facilmente riscontrabile tra
due catene di RNA ma assente nel
DNA.
Le catene appaiate di RNA o di RNADNA duplex sono antiparallele, come
nel DNA.
Forcina
Catena singola
Ansa interna
Rigonfiamento
Struttura secondaria degli RNA
Doppia elica nella struttura a forcina
Nelle eliche regolari destrorse di tipo A sono comuni interruzioni della struttura
a causa di errori di appaiamento delle basi che portano alla formazione di
protuberanze o ad organizzazioni di anse (loop) interni alla molecola.
Alcune brevi sequenze di basi (es.: UUCG) sono spesso presenti alle estremità
delle strutture a forcina e sono in grado di formare anse particolarmente stabili.
Struttura tridimensionale del
tRNA della fenilalanina del lievito
Contributi strutturali aggiuntivi alla
stabilizzazione
della
struttura
secondaria di alcuni RNA possono
arrivare da legami idrogeno che non
fanno
parte
dell’appaiamento
standard di Watson e Crick.
Il gruppo ossidrilico 2’ del ribosio
può formare un legame idrogeno
con altri gruppi.
Ribozima a testa di martello (virus delle piante)
Struttura di un introne del protozoo ciliato Tetrahymena thermophila, in
grado di catalizzare la propria escissione (ribozima), separandosi dagli esoni.
Il DNA e l’RNA a doppia elica possono essere denaturati
La denaturazione degli acidi nucleici
Il calore e pH estremi, così come determinano la denaturazione delle proteine
globulari, causano anche la denaturazione (o fusione) del DNA a doppia elica.
Il processo avviene mediante la rottura dei legami idrogeno tra le basi
appaiate e delle interazioni idrofobiche tra le basi impilate.
La doppia elica si apre liberando le due catene singole.
I legami covalenti del DNA non vengono rotti.
Quando la temperatura o il pH vengono riportati a valori vicini a quelli
fisiologici, i segmenti srotolati delle due catene si riavvolgono (riassociazione o
annealing)
Il DNA e l’RNA a doppia elica possono essere denaturati
DNA a doppia
elica
Denaturazione
Rinaturazione
(annealing)
DNA parzialmente
denaturato
Separazione
delle catene
Associazione
delle catene
mediante appaiamento
delle basi
Catene separate di DNA
Con una struttura ad avvolgimento casuale
(random coiled)
Denaturazione al calore del DNA
Ogni specie di DNA ha una temperatura di denaturazione caratteristica, detta
anche punto di fusione (tm).
Relazione tra il tm e il contenuto di GC di un DNA
Il punto di fusione è tanto più alto quanto più alto è il contenuto in coppie di basi GC.
Effetto ipercromico
L’interazione tra le basi
impilate ha l’effetto di ridurre
la quantità di luce UV assorbita
e, pertanto, un filamento singolo
di DNA assorbe la luce in
maniera più efficace rispetto ad
una molecola di DNA a doppio
filamento.
L’assorbimento della luce a 260
nm di una soluzione di DNA
aumenta quando la doppia elica
fonde e le catene si separano.
La transizione da DNA a doppia
elica a DNA denaturato a catena
singola può essere monitorata
misurando l’assorbimento della
luce UV.
E’ possibile visualizzare il DNA parzialmente denaturato
Possono essere denaturati anche gli acidi nucleici a doppia catena composti da
due catene di RNA o da una catena di RNA e una di DNA.
I duplex di RNA sono molto più stabili di quelli di DNA. A pH neutro, un RNA
a doppia elica spesso si denatura a una temperatura almeno 20 oC più alta di
quella richiesta da una molecola di DNA con una sequenza comparabile.
La stabilità dell’ibrido RNA-DNA è in genere intermedia tra quella dell’RNA e
quella del DNA.
La capacità di appaiamento di due catene di DNA (o di RNA o di DNA-RNA)
complementari può essere utilizzata per identificare sequenze di DNA simili in
specie diverse oppure nel genoma della stessa specie.
Gli acidi nucleici di specie diverse possono formare ibridi
I nucleotidi e gli acidi nucleici vanno incontro a trasformazioni non enzimatiche
Reazioni di deamminazione
Depurinazione
Timine
adiacenti
Dimero di timina ciclobutanico
Fotoprodotto 6-4
Piega
Sodio nitrito
Sodio nitrato
Nitrosammina
Precursori dell’acido
nitroso che promuove reazioni di deamminazione
Agenti alchilanti
metionina
adenosina
S-Adenosilmetionina
Dimetilnitrosammina
Dimetilsolfato
Mostarda azotata
Tautomeri
della guanina
O6-Metilguanina
E’ possibile determinare la sequenza di lunghi tratti di DNA
Catena
primer
Catena
stampo
Analogo 2’, 3’ - dideossi
Stampo della sequenza
da identificare
DNA polimerasi,
4 dNTP
4 ddNTP
Denaturazione
Segmenti di DNA
marcati con un colore,
copiati dallo stampo
con la sequenza
da identificare
Segmenti di DNA
marcati con un colore,
copiati dallo stampo
con la sequenza
da identificare
Migrazione del
DNA
I segmenti marcati
con il colore sono caricati
su un capillare
contenente un gel
di supporto e sottoposti
ad elettroforesi.
Raggio laser
Rivelatore
Laser
I risultati che si ottengono dal computer
dopo che le bande colorate
sono passate davanti al rivelatore
Genoma di Hemophilus influenzae,
il primo genoma di un organismo vivente che sia stato sequenziato
Per vedere questa immagine
occorre QuickTime™ e un
decompressore Animation.
E’ possibile sintetizzare oligonucleotidi
I nucleotidi trasportano energia chimica
Estere
Adenina
Anidride
Anidride
Anidride acetica,
un’anidride
acida carbossilica
Metilacetato,
un estere
acido carbossilico
I nucleotidi adeninici fanno marte di molti cofattori enzimatici
Coenzima A
Nicotinamide adenin dinucleotide (NAD+)
a
Alcuni nucleotidi sono molecole regolatrici
Adenina
Guanina
Adenosina 3’, 5’ -monofosfato ciclico
(AMP ciclico, cAMP)
Guanina
Guanosina 3’-difosfato, 5’ -difosfato
(Guanosina tetrafosfato, ppGpp)
Guanosina 3’, 5’ -monofosfato ciclico
(GMP ciclico, cGMP)
FINE
Scarica

Nucleotidi e acidi nucleici