Prof.ssa Giulietta MICARA
Da studi di popolazione emerge :
la probabilità di gravidanza è del 20-25% per ogni
ciclo (indice di fecondità);
40% al secondo mese, per raggiungere l’80% entro
un anno di rapporti regolari, continui, non
protetti.
19% delle nuove coppie avrà problemi riproduttivi
dopo 2 anni
4% saranno sterili
15% saranno subfeconde
(Subfecondità sta ad indicare un indice
di fecondità 3 o 4 volte più basso della norma: questo significa che alcune
coppie dovranno attendere un tempo maggiore per concepire)
Fattori causali infertilità
(%)
Fattore maschile
35,4%
Infertilità femminile
Sterilità tubarica
Endometriosi
Insufficienza endocrino ovarica
35,5%
14,2%
5,2%
6,1%
Fattore sia maschile che
femminile
15,0%
Sine causa
13,2%
Altro
5,3%
Sine causa
D
E
2000-2010
C
E
N 1990-2000
N
I 1980-1990
O
22%
38%
20%
38%
Fattore maschile
Dati relativi alla causa di sterilità
negli ultimi 30 anni.
UOC Infertilità-Fivet - Dip. Scienze
Ginecologiche ed Ostetriche e
Scienze Urologiche
Policlinico Umberto I
42%
20%
13%
0%
Fattore femminile
40%
67%
20%
40%
60%
80%
ITALIA
Sul totale dei 357 centri:
43,4% (155) sono i pubblici o privati
convenzionati che offrono servizi a carico del
SSN.
56,6% centri (202) sono privati.
Tecniche di fecondazione assistita
Prevedono:
1. sempre il trattamento del liquido seminale (swim up o gradiente di
densità) per concentrare i gameti maschili più idonei alla fecondazione
ed eliminare le impurità (batteri, prostaglandine, coaguli non
fluidificabili)
2. controllo dello sviluppo follicolare:
a. stimolazione farmacologica della crescita follicolare multipla sotto
stretto controllo ecografico ed ormonale
b. ciclo spontaneo: viene seguita la crescita dell’unico follicolo che si
sviluppa spontaneamente durante il ciclo naturale della paziente.
La fecondazione assistita su ciclo spontaneo può essere una tecnica
alternativa rivolta alle pazienti con una ridotta riserva ovarica
che non producono molti ovociti con la stimolazione o che hanno
affrontato diversi cicli stimolati senza ottenere risultati, e alle
pazienti in età avanzata. In
questi
casi il trasferimento
embrionario (di un solo embrione) si verifica nel 40-50% dei cicli
iniziati.
Trattamento del liquido seminale
Sfrutta la capacità degli spermatozoi di migrare con i loro
movimenti attivi in un mezzo di coltura che sovrasta la massa
(pellet) di spermatozoi, concentrati sul fondo di una provetta dopo
centrifugazione.
Trattamento del liquido seminale
Gradiente
Si basa sulla selezione passiva degli spermatozoi operata da
alcuni strati di una soluzione colloidale: il campione seminale
viene stratificato su strati a diversa densità e dopo
centrifugazione gli spermatozoi mobili si raccolgono sul fondo
della provetta (nel pellet)
Somministrazione di farmaci ormonali (gonadotropine: estrattive o
ricombinanti) associati ad altre sostanze ormonali (analoghi o
antagonisti del GnRh, l’ormone di rilascio delle gonadotropine) per
evitare un’ovulazione spontanea che renderebbe vana la terapia
effettuata.
La terapia dura 10-14 giorni; i farmaci vengono somministrati tramite
iniezioni intramuscolari o sottocutanee da effettuarsi giornalmente.
I dosaggi vengono personalizzati fin dall’inizio (in base a riserva
ovarica, età, costituzione corporea) e possono essere modificati
durante il proseguimento della terapia. La risposta delle pazienti è
strettamente soggettiva, perciò deve essere attentamente monitorata.
La crescita follicolare viene monitorata tramite monitoraggio
ecografico trans-vaginale e dosaggi dell’ormone estradiolo al duplice
scopo di determinare il momento appropriato per il recupero degli
ovociti ed evitare una stimolazione eccessiva (sindrome
iperstimolazione ovarica).
Nel momento in cui un numero sufficiente di follicoli raggiunge
uno stadio adeguato di crescita (18 - 22 mm) viene indotta la
fase finale di maturazione follicolare tramite la somministrazione
di β-hCG, gonadotropina corionica umana (5.000 - 10.000 UI) la
cui azione simula quella svolta dall’LH nei cicli naturali.
D1
D2
Per una corretta
valutazione delle
dimensioni del follicolo
si valuta il
DIAMETRO MEDIO
FOLLICOLARE
DM : (D1 + D2)/2
I livello: AIH o IUI
II livello: ICSI, IVF (FIVET)
III livello: TESA, TESE, MESA, GIFT
I livello: AIH o IUI
II livello: ICSI, IVF (FIVET)
III livello: TESA, TESE, MESA, GIFT
Fecondazione intracorporea
IUI – IntraUterine Insemination: AIH - Artificial Insemination with Husband’s
semen; AID – Artificial Insemination with Donor’s semen
Sterilità idiopatica e fattori lievi di sterilità (la follicologenesi non è seriamente
compromessa, una o ambedue le tube sono pervie e i parametri seminali appaiono
normali o lievemente alterati). Risultati in termini di gravidanze: 10%
I livello: AIH o IUI
II livello: ICSI, IVF (FIVET)
III livello: TESA, TESE, MESA, GIFT
Indicazioni
IVF (FIVET)
Infertilità maschile di
grado intermedio
patologia tubarica
(occlusione o danno
irreversibile)
Ripetuti fallimenti di
inseminazioni intrauterine
ICSI
Infertilità maschile di grado
severo
Mancata/ridotta
fecondazione in precedenti
cicli IVF
Utilizzo di ovociti scongelati
Ridotto numero di ovociti
disponibili
Seme crioconservato
FASE ESSENZIALE ERP L’APPLICAZIONE DI QUESTE TECNICHE E’ IL
PICK-UP OVOCITARIO
Prelievo ovocitario
(Pick up)
34-36 h dopo la somministrazione di HCG
Avviene per via trans-vaginale sotto controllo ecografico in anestesia locale
I follicoli vengono aspirati singolarmente tramite un ago fatto penetrare
attraverso la parete vaginale
FASE POST PICK-UP
• Ricerca al microscopio degli ovociti nel liquido follicolare
aspirato
• Lavaggio degli ovociti in un mezzo tamponato
• Preparazione delle piastre con IM (insemination medium)
• Preparazione del liquido seminale
IVF: gli ovociti non decumulati vengono posti a contatto con gli spermatozoi
per 16-18 h e successivamente decumulati
ICSI: decumulazione degli ovociti e determinazione della fase meiotica;
inseminazione degli ovociti maturi (MII)
Controllo della fecondazione: gli ovociti che mostrano i normali segni di
fecondazione (presenza di due pronuclei e dei due globuli polari vengono
mantenuti in coltura (incubatore a
37 C, 5% CO2) fino al momento del
trasferimento nella cavità uterina della paziente.
consiste nel rimuovere enzimaticamente e
meccanicamente le cellule del cumulo e della corona
radiata che circondano l’ovocita, ed ad introdurre un
singolo spermatozoo selezionato direttamente
all’interno del citoplasma ovocitario.
Per questa procedura è necessario uno strumento di
laboratorio che prende il nome di micromanipolatore
ago
aspiratore
ovocita
• al centro il microscopio invertito
• a destra e a sinistra i micromanipolatori
(parte meccanica)
• a sinistra i microiniettori (parte
idraulica) con i due capillari (holding ed
injection)
ICSI
pipetta Holding con cui si
crea pressione negativa per
bloccare l’ovocita da iniettare
ovocita
corpo polare
il singolo spermatozoo viene caricato
nell’ago da iniezione e poi immesso nel citoplasma dell’ovocita
Immobilizzazione dello
spermatozoo
Inserimento dello spermatozoo all’interno
dell’ovocita
cono di
fecondazione
IVF e ICSI a confronto
IVF
Lo spermatozoo penetra
autonomamente nell’ovocita
Fecondazione nel 60-65%
Comparsa dei 2 pn e divisione
cellulare più lenta
Qualità embrionaria e % di
gravidanza sovrapponibili alla
ICSI
ICSI
Selezione e introduzione dello
spermatozoo da parte
dell’operatore
Fecondazione nell’85-90%
Comparsa dei 2 pn e divisione
cellulare più rapida
Qualità embrionaria e % di
gravidanza sovrapponibili alla
IVF
I livello: AIH o IUI
II livello: ICSI, IVF (FIVET)
III livello: TESA, TESE, MESA, GIFT
Le azoospermie si dividono in ostruttive e non ostruttive a seconda che
l’assenza di spermatozoi sia causata rispettivamente da un’ostruzione dei
deferenti o da un’alterazione primaria o secondaria della spermatogenesi
Azoospermie ostruttive: possono essere post-infettive, post-chirurgiche
(vasectomia) o congenite (assenza bilaterale dei vasi deferenti). La
spermatogenesi è conservata ed è quindi possibile recuperare spermatozoi
chirurgicamente
Azoospermie secretorie: possono essere dovute a criptorchidismo, orchiti, trauma
o torsione testicolare, radio o chemioterapia, anomalie cromosomiche (47,xxy,
46,xy del yq11). In base al quadro istologico si distinguono in:
- ipospermatogenesi
- sindrome a sole cellule del Sertoli
- arresto maturativi
- sclerosi
Le probabilità di trovare spermatozoi è strettamente legata al suddetto quadro
istologico.
Tecniche chirurgiche per il prelievo degli
spermatozoi
OA
NOA
(AZOOSPERMIE OSTRUTTIVE)
(AZOOSPERMIE NON OSTRUTTIVE)
TESA
o
TeFNA
PESA
Agoaspirazione testicolare con
ago sottile
Agoaspirazione percutanea di
spermatozoi epididimari
MESA
Aspirazione microchirurgica di
spermatozoi epididimari
TESE
Prelievo chirurgico di
spermatozoi
dal testicolo
TESE o
Micro
TESE
Prelievo chirurgico o microchirurgico
di spermatozoi dal testicolo
Ovocita immaturo
Profase I – (Nucleo: vescicola germinale, GV)
Nucleo : sferico, in
posizione eccentrica, 1
nucleolo
Rottura GV (GVBD)  Metafase I
 Assenza del nucleo
 Assenza del globulo polare
 Tondo ed omogeneo
Ovocita maturo (MII)
circondato dalla corona radiata
Ovocita maturo denudato
Bloccato in metafase II – 1° globulo polare (PB)
Diametro di 110-160 μm
Citoplasma: OOPLASMA
Membrana plasmatica: OOLEMMA
Protetto da un involucro glicoproteico: ZONA PELLUCIDA
Tra ooplasma e zona pellucida: SPAZIO PERIVITELLINO
Morfologia degli ovociti maturi
vacuoli
Globulo polare
GV (Profase I)
GVBD (Metafase I)
Migrazione dei granuli corticali
verso la membrana plasmatica
1 corpo polare
Metafase II
zona pellucida e corona radiata (MET)
zona pellucida (MES)
Giorno 1 post-inseminazione
Controllo della fecondazione (14-18 ore post-inseminazione)
- FIVET: rimozione delle cellule del complesso cumulo-corona con
pipette o aghi
- ICSI: osservazione diretta (l’ovocita è già stato denudato)
Stadio 2 PN
– evidenza morfologica dell’avvenuta fecondazione
ICSI 14 – 16 h
FIV
16 – 18 h
GIORNO 2 post-inseminazione
Embrioni a 2 e 4 blastomeri
7 blastomeri
8 blastomeri
BLASTOCISTI
Fattori coinvolgenti l’esito delle
tecniche di fecondazione assistita
Infertilità
Stimolazione
ovarica
Manipolazione
Classificazione ovocitaria
Condizioni di
coltura
Transfer
numero, volume e forma dei blastomeri
presenza di frammenti
aspetto del citoplasma
presenza di blastomeri multinucleati
spessore della zona pellucida
15%
10%
20%
40%
60%
Transfer embrionale (giorno +1, +2, +3 o +5)
• generalmente semplice e indolore, non richiede anestesia
• trasferimento degli embrioni nella piastra per ET
• caricamento del catetere per ET (diametro 1-1.5 mm)
• introduzione del catetere nella cavità uterina attraverso il
canale cervicale
Fecondazione: 65% IVF; 85% ICSI
Embryo transfer: 80%
Gravidanza: 29%
Impianto: 20%
Nascita: 15%
Sindrome da iperstimolazione ovarica
Rischio iatrogeno (complicanze del prelievo ovocitario)
Gravidanza tubarica
Gravidanza multipla
Rischio di malformazioni fetali
Identificazione e trasferimento nell’utero materno dei soli embrioni,
generati da tecniche di fecondazione in vitro, non affetti da specifiche
anomalie genetiche
• Coppie portatrici di un disordine genetico:
- malattia monogenica (dominante o recessiva; autosomica o
legata al cromosoma X)
- anomalia cromosomica strutturale bilanciata (inversione,
traslocazione)
• Diagnosi pre-impianto delle aneuploidie (Preimplantation Genetic
Screening, PGS)
• Coppie con cariotipo normale ma a rischio di generare
embrioni aneuploidi
Consulenza
medica
-
Procedure
Percentuali di
successo
Rischi
Costi
Trattamento di
PMA/PGD
Diagnosi prenatale
Stimolazione
ovarica
Prelievo degli
ovociti
Fecondazione
in vitro
Biopsia
Analisi
genetica
Trasferimento
embrionale
intrauterino
IntraCytoplasmatic
Sperm Injection,
ICSI
Trattamento di PMA/PGD
Stimolazione
ovarica
Prelievo degli
ovociti
Fecondazione
in vitro
Biopsia
Analisi
genetica
Trasferimento
embrionale
intrauterino
Trattamento di PMA/PGD
Stimolazione
ovarica
Prelievo degli
ovociti
Fecondazione
in vitro
Biopsia
Analisi
genetica
Trasferimento
embrionale
intrauterino
Analisi molecolare (PCR) o citogenetica (FISH)
Polymerase Chain Reaction
provetta analitica
Fluorescence In Situ Hybridization
vetrino da microscopia
BLASTOMERO
Malattie monogeniche
- Screening delle aneuploidie
- Ricerca di sbilanciamenti cromosomici
dovuti ad anomalie cromosomiche strutturali
bilanciate in un genitore
Trattamento di PMA/PGD
Stimolazione
ovarica
Prelievo degli
ovociti
Fecondazione
in vitro
Biopsia
Analisi
genetica
Trasferimento
embrionale
intrauterino
12 giorno:
rilevamento HCG
4 -6 giorno dopo la ICSI
-
Embrioni non affetti
Morfologia
Divisioni mitotiche
Età della paziente
6^ settimana:
camera/e
gestazionale/i